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문제 정의
- 따라서 본 연구는 된장과 간장제조시 초피 과피를 첨가하여, 식중독 유발균이나 기타 세균성질환 병원성 균에 대한 항균 활성을 확인하고, 식중독사고의 예방을 위한 식품개발의 가능성을 살펴보는데 그 목적이 있다.
- necrosis와 apop- tosis는 형태학적으로 큰 차이를 보이는데 apoptosis가 일어나면 염색질의 응축, 핵의 응축, 세포의 축소, antibody의 출현, 대식세포에 의한 탐식작용과 같은 현상이 관찰되어진다 [32], 또한 apoptosis의 결정적인 증거가 되는 것이 DNA의 fragmentation이다. 초피간장 추출물처리에 의한 세포사가 necrosis인지 apoptosis인지 알아보기 위하여 세포내의 DNA 구조적 변화를 관찰하였다. 그 결과 무처리와 일반간장을 처리한 대조구세포의 DNA는 fragmentation0] 일어나지 않았으나, 초피간장의 추출물을 처리한 세포는 endonuclease 가 활성화되어 DNA가 일정한 크기로 단편화되어 전형적인 DNA ladder가 형성되어졌다(Fig.
제안 방법
- 하였다. 봄철 초피간장은 4월달에 제조를 하였으며, 60 1 간장독에 물 50 1, 소금 17 kg, 메주 6 kg을 넣고, 70% 종자를 제거한 과피를 4%(w/w) 첨가한 것을 2독, 2%(w/w) 첨가한 것을 2독, l%(w/w)첨가한 것을 2독해서 총 6독을 담궜다. 그리고 가을철의 초피간장은 10월달에 제조를 하였으며 메주와 소금의 첨가량은 봄철과 동일하게 했고, 생초피를 각각 16%(w/w) 첨가한 것을 2독, 8%(w/w) 첨가한 것을 2독, 4%(w/w) 첨가한 것을 2독해서 6독을 제조하였다.
- 봄철 초피간장은 4월달에 제조를 하였으며, 60 1 간장독에 물 50 1, 소금 17 kg, 메주 6 kg을 넣고, 70% 종자를 제거한 과피를 4%(w/w) 첨가한 것을 2독, 2%(w/w) 첨가한 것을 2독, l%(w/w)첨가한 것을 2독해서 총 6독을 담궜다. 그리고 가을철의 초피간장은 10월달에 제조를 하였으며 메주와 소금의 첨가량은 봄철과 동일하게 했고, 생초피를 각각 16%(w/w) 첨가한 것을 2독, 8%(w/w) 첨가한 것을 2독, 4%(w/w) 첨가한 것을 2독해서 6독을 제조하였다. 충분히 발효를 시킨 다음, 메주를 건져내어 새로운 항아리에 넣고, 위에 소금을 뿌리고 발효를 시켰다.
- 추출용매는 진공회전 농축기로 농축을 한 다음 실험에 이용했다. 초피된장으로부터 물질추출은, 초피 된장 6 종을 각각 200 g 씩 취해 Hexane 1 1를 가해 180 rpm으로 24시간 진탕추출 하고, 잔존물은 Ethylacetate 1 1를 가해 Hexane과 동일한 방법으로 추출을 실시했다. 추출용매는 진공 회전 농축기로 농축을 한 다음 실험에 이용했다.
- 항균성 시험용 평판배지의 조제는 생육 배지로 멸균된 기층용 배지(agar 1.5%)를 petri dish에 15 ml 씩 분주하여 응고시키고, 중층용배지 (agar 0.75%)를 각각 2.5 ml 씩 시험관에 분주하여 멸균한 후 45C 의 수욕상에 보관하면서 각종 시 험균액 0.1 ml 를 무균적으로 첨가하여 잘 혼합한 후 기층용 배지위에 고르게 펴지도록 도포한 뒤 응고시켜 2 중의 균 접종 평판배지를 만들어 사용하였다. 시료의 항균력 측정은 한천배지확산법(disk plate method)으로 측정하였다.
- 45pm membrane filter 로 여과하여 paper disk 에 20 μ1을 흡수시켰다. 용매를 완전히 휘산시키고 평판배지위에 밀착 시켜 4℃ 냉장고에서 1시간 방치한 후, 30C의 incubator에서 24~48시간 배양한 다음 paper disk 주변의 clear zone 직경을 측정하여 항균력을 측정하였다.
- 초피열매를 말려 종자를 제거한 과피와 생초피를 이용하여 첨가량과 시기를 달리하여 조제한 간장과 된장의 추출물을 이용하여 각종 식중독 유발균에 대한 생육저해효과를 조사하였다. 초피 간장과 된장추출물의 생육저해효과는 보관 중인 각 균을 3 ml nutrient broth 배지에 접종하고 30℃에서 18~24시간씩 3회 계대배양하여, 0.
- 4 g 함유된 10 ml TSB 에 접종하여 30℃ 에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양액을 620 nm 에서 흡광도 측정으로 생육정도를 측정하였다.
- 세포사멸의 기전 중 apoptosis의 지표가 되는 DNA fragmentation 실험을 실시하였다. U-937 human leukemia 세포를 10% FBS가 포함된 RPMI 1640배지에 2xl05cells/ml 농도로 9.
- 62cm2 dish에 시료와 함께 8시간 배양한 후, cell을 회수하였다. 회수한 cell에 lysis buffer(20 mM EDTA, 100 mM Tris, pH 7.4, 0.5% Triton X-100)를 넣고 ice 위에서 10 분간정치를 시킨 다음 centrifuge를 하여 침전물을 제거하고 RNase를 처리하여 37℃에서 1시간 배양을 하고, Proteinase 를 처 리하여 37℃ 에서 1시간 배양을 한 다음 2% agarose gel 에 전기영동을 실시하여 DNA fragmentation을 확인하였다.
- aureus, Sal. typhimurium, V. parahetnolyticus와 E. coli 0157:H7에 대해 항균활성을 조사했다. 무처 리와 용매만 처리한 것에서는 clean zone이 형성되지 않았고, V.
- 과피량과 시기를 달리하여 조제한 간장을 Hexane과 Ethylacetate를 이용하여 추출하고, 얻은 추출물을 그람양성균인 Sta. aureus, B. subtilis와 그람음성균인 SaL typhimurium, E. coli O157:H7, V. parahemolyticus에 대한 항균활성을 조사했으며, 생육저해활성은 무처리의균 생육을 평균하여 100으로 하고, 일반간장과 초 피처리 간장의 생육을 비교하여 측정했다.
- 초피나무(Z piperitum) 열매는 다양한 생리활성을 갖고 있으며, 과피 용매추출물은 세균에 대한 강한 항균활성을 갖고 있어, 간장과 된장제조에 초피를 첨가하여 생리활성효과를 조사하였다. 초피를 간장제조에 1%, 2%, 4% 첨가하여 제조하고, 간장추출물을 식중독균(SM.
- 초피를 간장제조에 1%, 2%, 4% 첨가하여 제조하고, 간장추출물을 식중독균(SM. aureus, Sal. typhimurium, V. parahemolyticus, E. coli 0157:H7)에 대한 항균활성을 조사했다. 초피를 2% 첨가한 간장은 E.
- 초피간장의 추출물을 백혈병세포 U-937에 처리하여 cas- pase-3 활성으로 항암활성을 조사했다. 그 결과 초피의 량을 1%, 2%, 4% 첨가한 간장의 추출물은 초피를 첨 가하지 않은 간장보다 caspase-3 활성이 각각 4배, 12배, 15배 활성이 증가하는 것이 확인되어졌다.
- 초피를 1% 첨가한 것에서는 frag- mentation을 확인하기 힘들었고, 2%와 4%초피를 첨가한 간장 추출물은 DNA fragmentation을 강하게 일으켰다. 초피를첨가한 간장추출물이 caspase를 활성화시키고, DNA frag- mentation을 일으키는 apoptosis 기작에 의해 암세포를 죽음으로 유도하는 초피간장의 항암효과를 입증했다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 초피(Z. piperitum) 는 경남 거창의 산지개발연구소 재배단지에서 생산된 것을 이용하였다. 봄에 담근 간장과 된장에 사용한 것은 전년도 8월에 수확한 것으로 음건한 후 70% 탈립 시킨 과피를 사용했고, 가을에 담근 간장과 된장에 사용한 것은 8월에 수확하여 생초피를 그대로 사용하였다.
- subtilis ATCC 9372를 사용하였고, 그람음성균으로서 는 Sal. typhimurium, E. coli O157:H7 KSC 059 및 V. parahemolyticus ATCC 33844를 사용하였다. 균 생육배지는 nutrient agar를 사용하였으나, V.
- 항암활성에 사용한 세포는 사람의 백혈병세포주 U-937을 10% FBS를 첨가한 RPMI-1640에 5% CC2, 37℃ 에서 세포를 계대배양하며 실험에 사용하였다.
- 초피간장의 제조는 봄철과 가을철에 각각 제조를 하였다. 봄철 초피간장은 4월달에 제조를 하였으며, 60 1 간장독에 물 50 1, 소금 17 kg, 메주 6 kg을 넣고, 70% 종자를 제거한 과피를 4%(w/w) 첨가한 것을 2독, 2%(w/w) 첨가한 것을 2독, l%(w/w)첨가한 것을 2독해서 총 6독을 담궜다.
- 추출용매는 진공회전 농축기로 농축을 한 다음 실험에 이용했다. 초피된장으로부터 물질추출은, 초피 된장 6 종을 각각 200 g 씩 취해 Hexane 1 1를 가해 180 rpm으로 24시간 진탕추출 하고, 잔존물은 Ethylacetate 1 1를 가해 Hexane과 동일한 방법으로 추출을 실시했다.
- 실험을 실시하였다. U-937 human leukemia 세포를 10% FBS가 포함된 RPMI 1640배지에 2xl05cells/ml 농도로 9.62cm2 dish에 시료와 함께 8시간 배양한 후, cell을 회수하였다. 회수한 cell에 lysis buffer(20 mM EDTA, 100 mM Tris, pH 7.
이론/모형
- 1 ml 를 무균적으로 첨가하여 잘 혼합한 후 기층용 배지위에 고르게 펴지도록 도포한 뒤 응고시켜 2 중의 균 접종 평판배지를 만들어 사용하였다. 시료의 항균력 측정은 한천배지확산법(disk plate method)으로 측정하였다. 시료처리량은 초피 0.
- Caspase-3 활성측정은 Yamazaki 등이 발표한 방법을 이용하였다[14, 34]. 배양한 U-937세포를 원심분리하여 배지를 제거한 다음 1% Triton X-100를 첨가한 10 mM Tris/HCl buffer(pH 7.
성능/효과
- aureus 에 대한 항균효과는 농도와 간장 제조 시기에 따라 40% ~ 60% 의 생육을 억제했다. 초피된장의용매추출물에서는 약한 항균활성을 확인할 수 있었다.
- 초피의 정유성분연구는 Sakai [29]등이 terpene화합물을 중심으로 성숙한 과실로부터 다양한 성분 연구가 되어졌고 Wu Yin[33]은 위의 각 성분들의 함량에 대해 조사를 하였다. 초피나무의 과피, 종자, 잎, 목피, 목질부 그리고 뿌리를 순차적 용매추출법으로 추출한 추출물을 이용하여 식중독 유발균(E. coli O157:H7, Sta. aureus, Sal. typhimurium, V. pm/zgemg/ficus) 에 대한 항균효과를 조사한 결과, 과피추출물에서 그람 양성균과 음성균에 뛰어난 항균효과를 보였다[13]. 과피의 메탄올추출물이 항돌연변이와 MG-63 암세포증식억제 효과가 있는 것이 보고되어져 있다 [17].
- coli 0157:H7에 대해 항균활성을 조사했다. 무처 리와 용매만 처리한 것에서는 clean zone이 형성되지 않았고, V. para- hemoIyHciis에 대해서는 Methanol추출물이 넓은 clear zone 이 형성되어져 강력한 항균활성을 보였고(Fig. 1), E. coli 0157:H7에는 Hexane, Chloroform, Ethylacetate추출물이 좋은 항균활성을 보였다. 초피종자도 Hexane, Chloroform, Ethylacetate 및 Methan이로 추출하여 V, parahetnolyticus에 항균 활성을 조사했지만 항균활성은 나타나지 않았다(Fig.
- &kanjange 봄에 제조한 간장이고, A-kanjange가을에 제조한 간장의 추출물을 처리한 결과이다. 봄 간장에서는 초피를 2% 첨가한 간장이 E. coli O157:H7생육을 70% 이상 생육을 저해하는 것을 확인할 수 있었고, 4% 처리한 곳에서는 50% 생육을 저해했다. 가을간장 추출물의 처리에서는 30-40% 정도로 균의 생육을 저해했으나, 봄간장 추출물에 비해서는 초피처리량에 관계없이 모두 활성이 낮았다.
- coli O157:H7생육을 70% 이상 생육을 저해하는 것을 확인할 수 있었고, 4% 처리한 곳에서는 50% 생육을 저해했다. 가을간장 추출물의 처리에서는 30-40% 정도로 균의 생육을 저해했으나, 봄간장 추출물에 비해서는 초피처리량에 관계없이 모두 활성이 낮았다. Sal.
- 5에 나타냈다. 봄 간장에서 초피의 첨가량이 많은 것일수록 생육 저해 효과가 뛰어났고, 초피 4% 처리한 간장의 추출물은 58%의 생육을 저해했으며, 2%의 초피첨가에도 55% 생육을 억제하는 효과가 나타났다. 가을 간장에서는 커다란 차이를 보이지 않았다.
- 가을 간장에서는 커다란 차이를 보이지 않았다. 전체적인 결과를 살펴보면 Hexane추출물에서는 커다란 항균효과를 볼 수 없었고, 건조한 과피를 사용한 봄 간장이 생과피를 사용한 가을 간장보다 균의 생육을 억제하는 효과가 뛰어나고, 4% 첨가한 간장보다 2% 첨가한 간장도 크게 활성에서 차이가 나지 않으므로 초피간장의 제조에는 2% 정도의 초피 첨가가 가장바람직한 것으로 여겨진다.
- 초피 된장의 경우는 Hexane과 Ethylacetate 추출물에서 뚜렷한 항균효과를 볼 수 없었으며, 간장과 비교했을 때 약한 항균활성이 나타났다. 이 등은 된장 추출물의 항균 활성에 대한 보고에서[35[ 된장의 용매추출물이 B.
- U-937만 배양한 것에서는 caspase 활성을 확인할 수 없었고, 초피를 첨가하지 않은 간장의 처리구에서도 거의 caspase 활성을 볼 수 없었다. 반면 초피를 1% 처리한 간장에서는 대조구에 비해 170%의 활성을 보였고, 2% 초피를 첨가한 것은 510% 이상 높게 caspase 활성이 나타났으며, 4% 초피를 처리한 것은 630% 이상 caspase 활성을 증가시켰다. 양조간장의 추출물은 항산화 활성이 확인 되어졌다[2, 3].
- 초피간장 추출물처리에 의한 세포사가 necrosis인지 apoptosis인지 알아보기 위하여 세포내의 DNA 구조적 변화를 관찰하였다. 그 결과 무처리와 일반간장을 처리한 대조구세포의 DNA는 fragmentation0] 일어나지 않았으나, 초피간장의 추출물을 처리한 세포는 endonuclease 가 활성화되어 DNA가 일정한 크기로 단편화되어 전형적인 DNA ladder가 형성되어졌다(Fig. 7). 초피를 1% 처리한 것에서는 ladder를 확인하기 힘들었고, 2%와 4% 초피를 첨가한 간장의 추출물을 처리한 세포에서는 ADCL을 처리한 세포의 DNA와 같이 DNA fragmentation이 강하게 일어났다.
- 7). 초피를 1% 처리한 것에서는 ladder를 확인하기 힘들었고, 2%와 4% 초피를 첨가한 간장의 추출물을 처리한 세포에서는 ADCL을 처리한 세포의 DNA와 같이 DNA fragmentation이 강하게 일어났다. 따라서 초피간장의 추출물에 의한 세포사는 apoptosis에 의한 것임을 확인했다.
- 활성으로 항암활성을 조사했다. 그 결과 초피의 량을 1%, 2%, 4% 첨가한 간장의 추출물은 초피를 첨 가하지 않은 간장보다 caspase-3 활성이 각각 4배, 12배, 15배 활성이 증가하는 것이 확인되어졌다. 이는 초피간장의 추출물이 apopto- sis를 유도하는 것을 의미하며, 된장의 용매추출물은 cas- pase-3 활성에 아무런 영향이 없었다.
- 형성되어졌다. 초피를 1% 첨가한 것에서는 frag- mentation을 확인하기 힘들었고, 2%와 4%초피를 첨가한 간장 추출물은 DNA fragmentation을 강하게 일으켰다. 초피를첨가한 간장추출물이 caspase를 활성화시키고, DNA frag- mentation을 일으키는 apoptosis 기작에 의해 암세포를 죽음으로 유도하는 초피간장의 항암효과를 입증했다.
후속연구
- 우리나라에도 단체급식 등을 통해 식중독의 피해가 증가하고 있어 사회적으로 심각한 문제가 되고 있다. 초피의 과피추출물이 일부 그람양성균과 그람음성균에 모두 항균활성을 나타내므로 현재 주로 이용하는 추어탕이나 생선요리 외에도 초피의 사용범위를 확대하고, 과피추출물을 이용한 살균제개발과 이용으로 식중독에 대한 예방효과를 얻을 수 있을 것으로 여겨지며, 과피의 방향성과 매운맛을 활용하여 새로운 요리와 안전한 요리의 개발도 가능할 것이다.
- 하지만 양조간장을 이용한 항균활성은 보고된 사례가 적다. 초피 과피는 많은 요리나 음식에 오랫동안 사용해오고 있으나 인체에 대한 해가 없기 때문에 이를 이용한 양조간장제조의 활용은 식중독 유발균의 오염방지 및 기능성의 효과를 얻을 수 있을 것이다.
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