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문제 정의
- 이에 본 연구는 우리 나라에서 널리 재배되고 있는 고추의 잎을 이용하여 항산화 활성이 높은 기능성 식품으로의 개발 가능성을 모색하기 위해 고추잎의 메타놀 추출물, 각종 유기용매로 분획물 및 분리한 성분들의 항산화 활성을 DPPH를 이용하여 검색하였다.
가설 설정
- annuum leaves on DPPH radicaleConcentration giving a 50% decrease of DPPH radical, Mean(ri 느 5). '가Positive control.
제안 방법
- 고추잎의MeOH 추출물, 이 추출물의 "-hexane, CH, C1, , EtOAc, n- BuOH 그리고 수층 분획물을 대상으로 DPPH 라디칼 소거 능을 검색한 후(Table I), 가장 높은 활성을 보인 EtOAc 가용 부에서 분리한 4종의 페놀성 화합물을 대상으로 활성을검색하였다(Table II).
- )에서 구입 하여 사용하였다. 성분의 1H-NMR과 "C-NMR분석은 Bruker사 Avance Digital 400 spectrophotometer(Karsruche, Germany)를 사용하였다.
- 가장 높은 DPPH 라디칼 소거활성을 보인EtOAc 분획을 대상으로 silica gel과 Sephadex LH-20 column chromatography를 행하여 4종의 화합물을 순수하게 분리하였다. 이들 화합물은 apigenin (1), vanillic acid (2), uracil (3) 및 apigenin 7-O-P-D-apiofuranosyl(l 2)-P-D- glucopyranoside (4)로 동정하였다.
- 이중 CAE2C 소분획물에서 화합물 2를 단일물질로 얻었다. 그리고 CAE3 소분획물은 CHC의 가용부를 제거하여 화합물 3을 분리하였으며, 주성분이 함유되어 있는 것으로 판단되는 CAE4 소분획물을 용출용매로 MeOH를 사용한 Sephadex LH-20 column chromatography를 실시하여 화합물 4를 단일물질로 분리하였다(Fig. 1).
- 81에서 singlet로 관측되었다. 그리고 bC-NMR sepctrum에서 carboxyl기에 의한 peak가 167.15 (C-7)에서 관측되어 화합물 까 benzoic acid 유도체 화합물임을 알 수 있었으며 , 문헌치 ⑹와 비교로 화합물 2를 vanMic acid로 구조동정하였다.
- 81 에서는 flavone 골격의 H-3에 의한 singlet가 각각 나타났다. 그리고, meta coupling 하는 A-ring의 두 개의 methine 기에 의한 peak가 5 6.51 (1H, d, J=1.9Hz, H-8)과 5 6.21 (1H, d, J=1.9Hz, H-6)에서 각각 관찰되었으며, 문헌치 의 13C-NMR data와 비교하여 화합물 1을 apigenin으로 구조 동정하였다.
- 측정하였다. 대조군은 기존의 항산화제인 ascorbic acid를 사용하여 활성을 비교하였고, free radical 소거 활성은 다음 계산식을 이용하여 산정하였다.
- RCA ~6). 이 중 CAE1 소분획물을 MeOH로 용출하는 Sephadex LH-20 column chromatography를 하여 화합물 1을 단일물질로 분리하였으며, CAE2 소분획물은 acetone 과 MeOH로 용출하는 Sephadex LH-20 column chromato- graphy를 행하여 4개의 소분획물을 얻었다(CAE2 A~D). 이중 CAE2C 소분획물에서 화합물 2를 단일물질로 얻었다.
- 받았다. 이들 소분획물은 TLC pattern에 따라 6개의 소분획물로 나누었다. RCA ~6).
- 6kg)을 음건세절한 후, methanol(MeOH)로 3시간 동안 3회 반복 추출하여 771 g의 추출물을 얻었다. 추출물은 10% MeOH로 현탁시켜 n-hexane, CH2Cl2(methylene chloride), EtOAc(ethyl acetate), ”-BuOHSbutyl alcohol) 및 H2O 순으로 분획하여 60, 20, 12, 78 및 57 g의 분획물을 얻었다.
- 향신료 및 채소로 널리 이용되고 있는 고추의 열매에 비해 나물로만 활용되고 있는 고추잎의 MeOH 추출물과 유기용매 분획물을 대상으로 DPPH를 이용한 항산화 활성을 검색하였다. 가장 높은 DPPH 라디칼 소거활성을 보인EtOAc 분획을 대상으로 silica gel과 Sephadex LH-20 column chromatography를 행하여 4종의 화합물을 순수하게 분리하였다.
- 화합물 3은 E-NMR spectrum에서 5 7.40 (1H, d, J= 7.62 Hz, H-5)와 5 5.45 (1H, d, 丿=7.62 Hz, H-6)에서 ortho coupling에 의한 피크만 관측되었으며 , 13C-NMR spectrum 에서 pyrimidine게 화합물의 이과 C-3에 결합한 ketone기에 의한 피크가 5 164.28과 5 151.46에서 관측되고 uracil의문헌치 *와 잘 일치하여 화합물 3을 uracil로 구조를 동정하였다. 화합물 4는 1H-NMR spectrum에서 5 5.
- 화합물의 구조동정 - 고추잎의 항산화 활성물질을 분리하기 위해, 환류 냉각 추출하여 얻은 MeOH 추출물과 이추출물의 ”-hexane, CH, C1, , EtOAc, n-BuOH 및 수층 분획물을 대상으로 DPPH를 2용한 황산화 활성을 검색한 후, 높은 소거활성을 보인 EtOAc 분획을 대상으로 silica gel과 Sephadex LH-20 column chromatography를 실시하여 4 종의 화합물을 분리하여 화학구조를 동정하고 활성을 검색하였다.
대상 데이터
- TLC는 precoated silica gel(Kiselgel 6OF254)를, column용 순상 충진제로는 70-230 mesh silica gel(Art. 7734)를 각각 Merck사(NJ, U.S.A.)에서 구입 하여 사용하였다. 성분의 1H-NMR과 "C-NMR분석은 Bruker사 Avance Digital 400 spectrophotometer(Karsruche, Germany)를 사용하였다.
- 구입한 고추 잎(2.6kg)을 음건세절한 후, methanol(MeOH)로 3시간 동안 3회 반복 추출하여 771 g의 추출물을 얻었다. 추출물은 10% MeOH로 현탁시켜 n-hexane, CH2Cl2(methylene chloride), EtOAc(ethyl acetate), ”-BuOHSbutyl alcohol) 및 H2O 순으로 분획하여 60, 20, 12, 78 및 57 g의 분획물을 얻었다.
- 실험에 사용한 고추 잎은 2004년 8월에 전남 여수시 율촌지역에서 직접 구입하였으며, 표본(NM-CA-1) 은 순천대학교 한약자원학과 표본실에 보관 중이다.
성능/효과
- 63%의 DPPH 라디칼 소거효과를 나타내었으며, 농도 의존적으로 활성이 증가하였다(Table I). 각 분획물들의 DPPH radical 소거활성을 검색한 결과, ”-hexane과 H, 0 분획물은 20% 이하의 매우 낮은 활성을 나타내었다. 그리고CHY% 분획물은 50 μg/ml에서 41.
- 9%의 소거할 성을 나타내었다. 그러나, EtOAc 분획물은 10 jig/ml 에서 40.9%의 소거활성을 나타내고, 25 μg/ml에서는 90.6%, 50 μg/ml에서는 94.2%의 높은 활성을 보였으며, 100 pig/ml 에서는 94.6%로 농도 증가에 따른 활성변화는 관찰되지 않았다. 또한 w-BuOH 분획 물은 50과 100 jig/ml 농도에서 82.
- 거의 일치하였다. 그리고 bC-NMR spectrum 분석에서 2 mole의 당은 anomeric carbon을 제외한 peak가 9 개로 1 mole의 당은 5탄당으로 apiofhranose의 문헌치(1)와거의 일치하였으며, 나머지 1 mole의 당은 이ucose임을 알 수 있었다. 당의 결합위치는 apigenin의 문헌치와 비교로 C- 7위치에 결합하였음을 알 수 있었으며, 1H-NMR 분석을 통해 2 mole의 당은 모두 s 형태임을 알 수 있었다.
- 그리고 bC-NMR spectrum 분석에서 2 mole의 당은 anomeric carbon을 제외한 peak가 9 개로 1 mole의 당은 5탄당으로 apiofhranose의 문헌치(1)와거의 일치하였으며, 나머지 1 mole의 당은 이ucose임을 알 수 있었다. 당의 결합위치는 apigenin의 문헌치와 비교로 C- 7위치에 결합하였음을 알 수 있었으며, 1H-NMR 분석을 통해 2 mole의 당은 모두 s 형태임을 알 수 있었다.
- 6%로 농도 증가에 따른 활성변화는 관찰되지 않았다. 또한 w-BuOH 분획 물은 50과 100 jig/ml 농도에서 82.8%와 88.2%의 높은 소거활성을 보였다.
- 분획물 중에서 DPPH 라디칼 소거능이 가장 우수한 EtOAc 분획에서 분리한 4 종 화합물의 활성을 측정한 결과(Table II), 화합물 1, 3 및 4는 IC50 값이 200 jig/ml 보다 높으므로소거활성이 없는 것으로 나타났으나, 화합물 2인 vanillic acid는 14.70 μg/ml로서 대조군으로 사용한 ascorbic acid 보다는 못하지만 우수한 활성을 나타내었다.
후속연구
- 밀접한 관련이 있는 것으로 인식되고 있다.좌) 그러므로 높은 항산화 활성을 보인 고추잎은 이들 질환을 예방할 수 있는 건강기능성 식품 개발에 유용한 식물자원이 될 수 있을 것이며, 고추잎에 대한 성분과 활성에 대한 많은 추가연구가 필요하다고 사료된다.
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