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문제 정의
- 대식세포에서 LPS로 자극하였을 때 나타나는 NO 생산을 신이 추출물이 얼마나 억제할 수 있는지 알아보았다. 그 결과 신이의 농도 의존적으로 NO 생산이 현저하게 억제됨을 알 수 있었다.
- 마우스의 복강 대식세포를 LPS로 자극하였을때 신이의 항염증 효과를 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 신이는 한의학에서 풍한표증에 거풍산한한 작용으로 사용되고 있고 이에 신이이 항염증작용을 가지고 있다고 생각되어 본 저자는 신이의 물 추출물로 대식세포에 신이가 미치는 영향을 검증하고자 대식세포에 신이가 미치는 영향을 조사하였다.
- 신이이 대식세포에서 전염증성 인자들에 대한 영향을 조사하기 위하여 염증성 세포활성물질의 생성을 조사하였다. 신 이를 전처리한 후 LPS로 자극하여 ELISA 방법으로 단백질 수준에서 실험 (Fig.
제안 방법
- 동일한양의 단백질을 샘플링 버퍼(4X)를 같이 넣어 섞은 다음 그 샘플을 10% SDS-PAGE에 전기영동 한 후 맴브레인에 옮기고 나서 5% skin milk로 2h blocking 하였다. ERK, p38, JNK의 phosphorylation과 IK-Ba을ECL detection 용액 (Amersham)으로 확인하였다.
- MTT분석법으로 측정했다. 간단히 설명하면 지수성장을 하는 세포들은 RPMI-1640배지에서 IxlU/ml의 밀도로 현탁하였고, 여러 가지 농도로 AETD로 처리하였다. 4시간 동안 배양한 뒤 1 mg/ml의 농도로 배양하기 위해서 MTT용액을 첨가하고 다시 2 시간 동안 배양하였다.
- 조사하였다. 더불어 IKB-q를 조사하였다.
- 복강에서 추출한 마우스 대식세포를 60 mm culture dish에 lxW2 * * * 6 cells/ml로 세포를 배양하고 serum free media(RPM11640) 으로 12시간 starvation 시킨 후 신이(500 mg/ml)으로 전처리 하고 30분 뒤에 LPS (500 ng/ml)로 자극하여 cold PBS로 3회 세처한 후 시간별로(0, 15, 30, 60 min) cell을 harvest하여 cell을 얻은 뒤 원심분리(5000 RPM, 5 min) 하여 그 상층액을 버리고 cell pellet을 수거하였다. lysis buffer(lysis buffer 1ml + phosphotase inhibitor 10 ㎕+protase inhibitor 10 ㎕)를 넣어 단백질을 lysis 시켜서 원심분리(15000 RPM, 20 min)하여 찌꺼기를 가라앉히고 단백질 정량하였다.
- 신 이를 전처리한 후 LPS로 자극하여 ELISA 방법으로 단백질 수준에서 실험 (Fig. 3a)하였고 RT-PCR 방법으로 mRNA생성을 실험(Fig. 3b)하였다. 그 결과 TNF-a, IL-6, IL-12와 같은 염증성 세포 활성 물질들을 신이가 농도 의존적을 억제함을 알 수 있었다(Fig.
- 것으로 알려져 있다. 신이가 항염효과에 미치는 영향을 조사하기 위하여 먼저 신이가 대식세포에서 LPS에 의한 NO 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 신이를 다양한 농도로 전 처리하고 LPS로 자극하였다.
- 신이가 항염효과에 미치는 영향을 조사하기 위하여 먼저 신이가 대식세포에서 LPS에 의한 NO 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 신이를 다양한 농도로 전 처리하고 LPS로 자극하였다. 24시간 후에 세포 상층액에서 NO의 생성을 측정한 결과 LPS로 자극한 대조군에 비해 신이추출물을 전처리한 군에서 농도 의존적으로 NO 생성이 감소하고 있음을 알 수 있다(Fig.
- 신이의 세포독성에 관해 알아보기 위하여 대식세포에 신이를 농도의존적으로 처리하여 24시간 후에 세포의 생존률을 즉정하였다. Fig.
- 신이이 NF-kB 활성에 미치는 영향을 조사하기위해 신이를 전처리 하고 LPS로 자극한 대식세포에서 IkB-Q의 분해 정도를 조사하였다. NF-KB는 자극이 없는 상태에는 세포질에서 IkB-a와결합되어 존재한다.
- 실험 3~4일 전에 실험 mouse에 염증 물질 (thioglucollate 2~3 ml)을 i.p.로 투여하여 RPMI-1640+10%FBS medium을 6~7 ml를 복강에 투여하여 넣어 복강액을 뽑아내 원심분리 한 후 cell을 counting해서 Dish나 Plate에 깔고 5% CO2 37℃가 유지되는 incubator에서 3시간 배양하고, suspension 세포를 버린 후에 부착한 세포를 대식세포로 간주하여 실험하였다
- 이에 신이의 LPS로 유도한 대식세포의 활성화를 억제하는 효과를 검증하고자 NO, 전염증성 사이토카인(IL-6, IL-12, TNF-a)의 발현을 실험하였고, mitogen-activated protein kinase (MAPK) family인 extracellular signal-regulated kinase(ERK), C-jun N-terminal Kinase(JNK) 및 p38 kinase(p38)에 미치는 영향을 조사하였다. 더불어 IKB-q를 조사하였다.
- A)로 540 nm에서 측정하였다. 일산화질소의 농도는 아질산염의 표준커브로부터 계산하였다 .
대상 데이터
- C57BL/6 6주령 암컷을 오리엔트에 구입하여 사용하였다.
- Fetal bovine serum(FBS), RPM 1-1640, penicillin-streptomycin 등의 세포 배양용 시약들은 Gibco BRL (Grand Island, USA) 사에서 배양조는 Corning(Rochester, USA)사에서 구입하였다 실험에 사용된 시약 중 HEPES, sodium dodesyl sulfate(SDS), acrylamide, bisacrylamide, LPS, Tris-HCl 등은 SIGMA (St. Louis, USA) 사에서 구입하였으며, 실험에 사용된 항체인 anti-phospo-ERKl/2, anti-phospo-p38z anti-1 K-B-a, anti-phospo-JNK는 Cell signaling 사에서 구입하였다. anti-mouse IL-6, TNF-a, IL-12 antibodies, 재조합 IL-6, TNF-이L-12는 R & D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입했다.
- Louis, USA) 사에서 구입하였으며, 실험에 사용된 항체인 anti-phospo-ERKl/2, anti-phospo-p38z anti-1 K-B-a, anti-phospo-JNK는 Cell signaling 사에서 구입하였다. anti-mouse IL-6, TNF-a, IL-12 antibodies, 재조합 IL-6, TNF-이L-12는 R & D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입했다. 실험에 사용된 모든 시약은 분석용 등급 이상으로 사용하였다
- 실험에 사용한 신이는 옴니허브에서 구입하여 물 1 L에 100 g을 넣고 2시간 동안 전탕한 액을 동결 건조하여 3차 증류수에 녹여서 필터한 후 사용하였다
데이터처리
- 실험결과에 대한 통계처리는 students' t-test에 준하였고 p-value가 0.05 미만일 경우 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- and then incubated with or without 500 nm/ml LPS for 24 hrs. NO released by c예s was measured by the method of Griess.
- 전 처리 하였다. Pro-inflammatory cytokine의 염증 매개물질의 생성에 미치는 약물의 효과를 검증하기 위해서 LPS (500 ng/ml)로 자극한 후 18시간 뒤 이들 염증매개물을 세포 상층액에서 ELISA법으로 정량하였다
- 대식세포의 생존율은 밀집세포의 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 자주빛 formazan 생성물로 변하는 MTT환원을 바탕으로 MTT분석법으로 측정했다. 간단히 설명하면 지수성장을 하는 세포들은 RPMI-1640배지에서 IxlU/ml의 밀도로 현탁하였고, 여러 가지 농도로 AETD로 처리하였다.
성능/효과
- 신이를 다양한 농도로 전 처리하고 LPS로 자극하였다. 24시간 후에 세포 상층액에서 NO의 생성을 측정한 결과 LPS로 자극한 대조군에 비해 신이추출물을 전처리한 군에서 농도 의존적으로 NO 생성이 감소하고 있음을 알 수 있다(Fig. 2).
- 3b)하였다. 그 결과 TNF-a, IL-6, IL-12와 같은 염증성 세포 활성 물질들을 신이가 농도 의존적을 억제함을 알 수 있었다(Fig. 3).
- 대식세포에서 LPS로 자극하였을 때 나타나는 NO 생산을 신이 추출물이 얼마나 억제할 수 있는지 알아보았다. 그 결과 신이의 농도 의존적으로 NO 생산이 현저하게 억제됨을 알 수 있었다. 신이을 전처리 한 대식세포에서 TNF-az IL-6, IL-12 항염증성 cytokine의 분비를 조사하였을 때 신이의 농도 의존적으로 cytokine 생산이 현저하게 억제됨을 알 수 있었다.
- 본 연구에서 우선 신이가 대식세포에 대한 독성을 가지고있는지 알아보기 위하여 MTT방식으로 조사한 결과 대식세포에 대한 독성이 없는 것을 확인할 수 있었다.그 다음으로 체내염증과 정에서는 다량의 nitik oxidc(NO)가 생성되는데 신 이를 농도별로 전처리 하고 LPS로 NO생성을 유도 했을때 NO의 생성이 신이추출물의 농도에 따라 농도 의존적으로 억제함을 알 수 있었다
- 신이을 전처리 한 대식세포에서 TNF-az IL-6, IL-12 항염증성 cytokine의 분비를 조사하였을 때 신이의 농도 의존적으로 cytokine 생산이 현저하게 억제됨을 알 수 있었다. 신이 처리시 MAP kinase 활성과 IKB-a의 분해를 억제하여 NFkB의 활성을 저해하는지 알아보기 위하여 western blot를 수행한 결과 IKB-q의 분해를 방지하였고, ERK 1/2, JNK, p38의 인산화가 억제되었다
- 그 결과 신이의 농도 의존적으로 NO 생산이 현저하게 억제됨을 알 수 있었다. 신이을 전처리 한 대식세포에서 TNF-az IL-6, IL-12 항염증성 cytokine의 분비를 조사하였을 때 신이의 농도 의존적으로 cytokine 생산이 현저하게 억제됨을 알 수 있었다. 신이 처리시 MAP kinase 활성과 IKB-a의 분해를 억제하여 NFkB의 활성을 저해하는지 알아보기 위하여 western blot를 수행한 결과 IKB-q의 분해를 방지하였고, ERK 1/2, JNK, p38의 인산화가 억제되었다
- 신이의 세포독성을 확인하기 위해 MTT assay를 수행한 결과 신이농도별로 처리했을때 세포독성이 거의 나타나지 않음을 확인 할 수 있었고 현미경 관찰을 통해서도 이와 같은 결과를 얻었다. 대식세포에서 LPS로 자극하였을 때 나타나는 NO 생산을 신이 추출물이 얼마나 억제할 수 있는지 알아보았다.
- 이러한 실험 결과들로 보아 신이이 대식세포에서 IkB-a의 분해를 억제하여 전염증성 cytokine 들의 발현과 NO의 생산을 줄였다고 사료되어진다. 신이의 이와 같은 작용은 LPS로 유발되어지는 염증에 효과적일 것이라고 생각되고 앞으로 신 이의 항염증 작용에 대한 in vivo 실험들과 실제로 어떤 성분이 이러한 치료효과를 내는지에 관한 연구가 계속되어야 할 것이라고 사료되어진다.
- 이와 같은 결과로 보아 신이 추출물은 대식세포에 작용하여 IKB-a의 분해를 억제함으로써 NF-kB에 의한 신호전달을 억제하여 NO와 항염증성 cytokine들의 생산을 억제하여서 LPS로 유발되는 대식세포의 염증성 작용들을 차단함으로써 항염증성 효과를 가지고 있다고 볼 수 있다.
후속연구
- 염증 매개 물질이 과량 생산되면, 과도한 면역반응을 야기하게 되고 이로써 각종 인체 질환을 악화시키는 원인이 된다. 따라서 NO, PGE2, TNF-azIL-ip 및 1L-6와 같은 염증 매개물질을 억제하는 물질을 발견한다면, 각종 면역질환 및 인체질환의 치료에 도움이 될 것이다.
- 사료되어진다. 신이의 이와 같은 작용은 LPS로 유발되어지는 염증에 효과적일 것이라고 생각되고 앞으로 신 이의 항염증 작용에 대한 in vivo 실험들과 실제로 어떤 성분이 이러한 치료효과를 내는지에 관한 연구가 계속되어야 할 것이라고 사료되어진다.
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