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문제 정의
- 이에 저자는 龍腊瀉肝湯合黃連解毒湯加減의 抗炎症 작용을 실험적으로 究明하고자 세포독성에 미치는 영향, RAW264.7 세포주에서의 정량적 중합 효소 연쇄 반응, IL-1β, IL-6, TNF-α, COX-2 및 NOS-Ⅱ의 유전자 발현에 미치는 영향, NO 및 ROS 생성량에 미치는 영향, LPS로 유도된 염증 생쥐 모델의 혈청 내 cytokine 변화에 미치는 영향 및 생명 연장 효과 등을 실험 평가하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- Real time quantitative PCRe Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR system(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였다
- YSHHK 2첩 분량을 증류수 2,000 mC에 가하여 열탕 추출기로 3시간 추출하고 얻은 액을 흡입 여과하여 이를 감압 증류장치(Rotary vacuum evaporator)로 농축한 다음, 동결 건조기(Freeze dryer)를 이용하여 완전 건조하여 YSHHK 추출액 19.2 g을 얻어 냉동(-84℃) 보관하면서 적당한 농도로 희석하여 사용하였다.
- 01) 감소시켰다. 龍膽瀉肝湯合黃 連解毒加減은 LFS 투여 후 3일째부터 대조군에 비하여 생쥐의 생존율을 증가시켰다.
- 龍膽瀉肝湯合黃連解毒加減의 抗炎作用의 효과를 평가하기 위해 細胞毒性에 미치는 영향, RAW264.7 세포주에서의 정량적 중합 효소 연쇄반응, 염증 관련 cytokine인 IL-1β, IL-6, TNF-α, COX-2 및 NOS-Ⅱ의 유전자 발현에 미치는 영향, NO 및 ROS 생성량게 미치는 영향, 급성 염증 유발 생쥐 모델의 혈청 내 cytokines 변화에 미치는 영향 및 생명 연장 효과 등을 실험 평가한 결과는 다음과 같다.
- 주사한 후 90분 후에 ethyl ether.로 마취하고 심장 천자법으로 채혈하였다. 채혈 후 혈청을 분리하여 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 생성량을 ELISA로 측정하였다.
- 여기에 YSHHK(100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖)를 처리하고 1시간 후 LPS(2 ㎍/㎖)를 처리한 다음 37℃에서 48시간 배양하였다. 배양 종료 후 DCFH-DA 50 μM을 처리하고 5분간 배양하고 2회 수세한 후 flow cytometer(Becton Dickinson Co., USA)로 세포 내 형광 DCF 또는 ROS를 측정하였다.
- 본 실험에서는 竈臆瀉肝湯合黃連解毒加減(YSHHK)의 추출물에 항염증 작용이 있는지를 확인하기 위해 細胞毒性에 미치는 영향, RAW264.7 cell line에서의 정량적 중합 효소 연쇄 반응, 염증 관련 cytokine인 IL-1β, IL-6, TNF-α, COX-2, NOS-Ⅱ 등의 유전자 발현에 미치는 영향, 세포 내 nitric oxidc(NO), reactive oxygen species(ROS) 생성량에 미치는 영향과 IL-1β, IL-6, TNF-α 등의 생성량에 미치는 영향, LPS로 유도된 lethal endotoxemia에 대한 생명 연장 효과 등을 실험 평가하였다.
- 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 22±2℃, 1일중 12시간은 200-300 Lux로 조명하고, 12시간은 모든 빛을 차단하였다. 사료는 고형사료 (조단백질 22.1% 이상, 조지방 8.0% 이하, 조섬유 5.0% 이하, 조회분 8.0% 이하, 칼슘 0.6% 이상, 인 0.4% 이상, 삼양사, 항생제 무첨가)와 물을 충분히 공급하였다.
- 15 min at 95℃, 1 min at 60℃ 에서 수행하였다. 실험군과 대조군은 internal standard로 G3PDH를 사용하여 아래의 수식으로 target group의 Quantitative PCR을 정량하여 RQ(relative quantitative) 값을 측정하였다.
- 7 세포주를 96 well plate에 2×104 cells/well 로 분주하였다. 여기에 YSHHKQ0Q, 50, 10 ㎍/㎖) 처리하고 1시간 후 LPS(2 ㎍/㎖)를 각각의 well에 첨가하여 48시간 배양하였다. 배양종료 후 전체 배양액을 2,000 rpm에서 5분간 원심분리 하여 상등액을 회수한 후 여기에 Griess 시약 용액 A(0.
- 역전사(reverse transcription) 반응은 준비된 total RNA 3 ㎍을 DNase I (10 U/㎕) 2 U/tube를 37℃ heating block에서 30분간 반응한 후 75℃에서 10분 동안 변성시키고, 이에 2.5 ㎕ 10 mM dNTPs mix, 1 ㎕ random sequence hexanucleotides(25 pmole/ 25 ㎕), RNA inhibitor로서 1 ㎕ RNase inhibitor(20 U/㎕), 1 ㎕ 100 mM DTTZ 4.5 ㎕ 5xRT buffer(250 mM, Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2)를 가한 후, 1 ㎕의 M-MLV RT(200 U/㎕)를 다시 가하고 DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 하였다. 이 20 ㎕의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000 rpm에서 5초간 원심 침강하여 37℃ heating block에서 60분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성하였다.
- 염증 사이토카인 유전자 발현은 SYBR Green PCR Master mix(ABI)를 사용하였고, internal standard틀 G3PDH를 사용하였으며, primer의 최종 농도가 200 nM이 되게 반응시켰다. Real time quantitative PCR의 조건은 pre-denaturatione 2 min at 50℃, 10 min at 94℃, 그리고 40 cycles을 0.
- 2% EDTA를 첨가하여 30 분간 배양 후 인산완충생리식염수(PBS)로 약 2회 1,500 rpm에서 원심분리 하였다. 이를 DMEM-10% FBS로 1주일 동안 배양한 후 0.5% trypsin-0.2% EDTA로 세포를 분리하는 작업을 3회 반복한 후 최종적으로 살아있는 무착세포를 DMEM-5% FBS 배양액에서 배양하였다.
- 일주일간 YSHHK를 경구투여 한 후 LPS 3 ㎎/㎏을 복강에 주사하고 실험군은 1시간 전에 다시 한번 YSHHK를 경구투여 하여, 5일간 생쥐의 생존율을 관찰하여 생명 연장 곡선을 만들었다.
- 로 마취하고 심장 천자법으로 채혈하였다. 채혈 후 혈청을 분리하여 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 생성량을 ELISA로 측정하였다. 각 well에 생쥐의 혈청 100 ㎕(1/100 dilution)씨 분주한 후 antibody cytokine- biotined conjugated 100 ㎕를 처리하고 2시간 실온에서 방치한 후 다시 세척하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 기기는 centrifuge (Beckman Co., USA), rotary vacuum evaporator(Buchi 461 z Swiss), vacuum pump (Biichi 461 Co., Swiss), deep freezer(Sanyo Co., Japan), freeze dryer(Eyela Co.z Japan), roller mixer (Gowon scientific technology Co., Korea), 열탕추출기(대웅, Co., Korea), CO., incubator(Forma scientific Co., USA), clean bench(Vision scientific Co., Korea), autoclave(Sanyo Co., Japan), niicro-pipct (Gilson Co., France), water bath(Vision scientific Co., Korea), heating block(Vision scientific Co., Korea), vortex mixer(Vision scientific Co.z Korea), spectrophotometer (Shimazue Co., Japan), ice-maker (Vision scientific Co.z Korea), plate shaker(Lab-Line Co.,USA), ELISA reader(Molecular Devices Co.z USA), 7500 Fast Real-Time PCR system(Applied Biosystenis Co., USA), flow cytometer (Becton Dickinson Co., USA)등을 사용하였다.
- 실험동물은 한국생명공학연구원에서 구입한 수컷 ICR계 마우스와 Balb/c계 마우스 8주령을 구입하여, 1주일 동안 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 22±2℃, 1일중 12시간은 200-300 Lux로 조명하고, 12시간은 모든 빛을 차단하였다.
- 실험에 사용된 시약은 lipopolysaccaride(LPS)/chlorosulforrodamin-B (SRB), diethyl pyrocarbonate(DEPC), tris-base, tris-HCL, ethanol, trypsin-EDTA, trichloroacetic acid(TCA), acetic acid, dulbecco's minimum essential medium (DMEM), DNase type I , penicillin, streptomycin, amphotericin, 2, 7-dichlorodihydro fluorescin diacettate(DCFH-DA), anti -body avidin-HRP, chloroform, naphthylethylen diamine dihydrochloride, sulfonylamide, H3PO4, Dulbeccozs phosphate buffered saline(D-PBS), RNAzolB, RNA inhibitor, ACK solution, KCl, isopripanol, magnesium chloride(MgCl2)는 Sigma(USA)사 제품을 사용하였으며, fetal bovine serum(FBS)는 Hyclone Logan(USA)사 제품을, RNase는 Pharmingen Torrey ana (USA) 사 제품을, IL-1β, IL-6, TNF-α ELISA kit는 R&D system Minneapolis(USA)사 제품을 사용하였으며, 기타 시약은 특급 시약을 사용하였다.
- 실험에 사용된 용담사간탕합황련해독가감(YSHHK)의 구성 약물은 대전대학교 부속한방병원에서 구입하여 정선한 후 사용하였다.
- 이 20 ㎕의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000 rpm에서 5초간 원심 침강하여 37℃ heating block에서 60분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성하였다. 이를 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT를 불활성화 시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 polymerase chain reaction(PCR)에 사용하였다.
데이터처리
- 다양한 실험으로부터 얻은 결과는 mean±standard error로 기록하였고, 유의성 검증은 Studenfs t-test 분석방법을 이용하여 결정하였다.
이론/모형
- Survival was monitored over the next 5 days. The survival curves from experiments were analyzed by:he Kaplan-Meier method.
성능/효과
- 458 ± 0. 236 nm로 나타났으며, YSHHK 100, 50, 10 ㎍/㎖ 농도 처리군이 각각 0.587 ± 0.178, 0.66 ± 0.168, 0.845 ± 0.205 로 나타나 대조군에 비하여 100, 50 ㎍/㎖ 농도에서 유의성 (p<0.01, p<0.01) 있게 NO 생성을 억제하였다(Fig. 3).
- mLFCs were pretreated with various concentrations of YSHHK extract The data% viability) in the Figure are expressed as the mean±sem. Comparison between YSHHK-treated and untreatec control groups were analyzed using Student's paired test, and differences were considered significant when the degree of confidence in significance was 95% or higher.
- The gta are expressed as the mean ± sem (η=6). Comparisons between groups were analyzed using Student's paired test and differences between experimental and control groups were considered significant when the degree of confidence m significance was 95% or higher T test. +: Statistically significant value compared with normal data( + - P<0.
- 2-A). IL-6 유전자 발현에 미치는 영향에서는 RAW264.7 세포주에서 IL-6 유전자 발현의 RQ 값이, 정상군은 0.121, 대조군은 1.00인 것에 비하여, YSHHK 100, 50, 10 ㎍/㎖ 농도 처리군은 각각 0.254, 0.364, 0.787로 나타나 대조군에 비해 농도 의존적으로 유전자 발현을 억제하였다(Fig. 2-B). TNF-α 유전자 발현에 미치는 영향은 RAW264.
- LPS로 유도된 lethal endotoxemia에 대한 YSHHK의 생명 연장 효과를 살펴보기 위해서, 생쥐의 복강에 LPS(3 ㎎/㎏)를 주사하여 5일간 관찰한 결과, YSHHK 투여군은 LPS 투여 3일째부터 대조군에 비하여 생존율이 증가하였다(Fig. 6).
- NOS-I1 유전자 발현에 미치는 영향은 RAW264.7 세포주에서 NOS-II 유전자 발현의 RQ 값이, 정상군은 0.048, 대조군은 1.00으로 나타난 반면, YSHHK 100, 50, 10 ㎍/㎖ 농도 처리 군은 각각 0.321, 0.597, 0.912로 나타나 대조군에 비해 농도 의존적으로 유전자 발현을 억제하였다(Fig. 그E).
- RAW264.7 세포주에서 COX-2 유전자 발현의 RQ 값은 정상군(WT)이 0.242, 대조군(CT)이 L00로 나타난 반면, YSHHK 100, 50, 10 ㎍/㎖ 처리군에서는 각각 0.400, 0.599, 0.831로 나타나 대조군에 비해 농도 의존적으로 유전자 발현을 억제하였다(Fig. 2-D).
- RAW264.7 세포주에서 IL-1β 유전자 발현의 RQ 값은, 정상군(WT)이 0.125, 대조군(CT)이 1.00로 나타났으며, YSHHK 100, 50, 10 ㎍/㎖ 농도 처리군에서는 각각 0.555, 0.568, 0.905로 나타나 대조군에 비해 농도 의존적으로 유전자 발현을 억제하였다(Fig. 2-A).
- RAW264.7 세포주에서 IL-6 유전자 발현의 RQ 값은, 정상군(WT)이 0.121, 대조군(CT)이 1.00인데 비하여, YSHHK 100, 50, 10 ㎍/㎖ 농도 처리군이 각각 0.254, 0.364, 0.787로 나타나, 역시 대조군에 비해 농도 의존적으로 유전자 발현을 억제하였다(Fig. 2-B).
- RAW264.7 세포주에서 NO 생성량은 정상군(WT)의 OD 값이 0.054 ± 0.012 nm, 대조군(CT)이 1.458 ± 0.236 nm로 나타났으며, YSHHK 100, 50, 10 ㎍/㎖ 농도 처리군이 각각 0.587 ± 0.178, 0.66 + 0.168, 0.845 ± 0.205로 나타나 대조군에 비하여 100, 50 ㎍/㎖ 농도에서 유의성 (p<0.01, p<0.01) 있게 NO 생성을 억제하였다(Fig. 3).
- RAW264.7 세포주에서 NOS-II 유전자 발현의 RQ 값은 정상군(WT)이 0.048, 대조군(CT)이 1.00로 나타난 반면, YSHHK 100, 50, 10 ㎍/㎖ 농도 처리군이 각각 0.321, 0.597, 0.912로 나타나 대조군에 비해 농도 의존적으로 유전자 발현을 억제하였다(Fig. 2-E).
- RAW264.7 세포주에서 TNF-α 유전자 발현의 RQ 값은, 정상군(WT)이 0.041, 대조군(CT)이 1.00로 나타났으며, YSHHK 100, 50, 10 ㎍/㎖ 농도 처리군에서는 각각 0.626, 0.787, 0.981 로 나타나 대조군에 비해 농도 의존적으로 유전자 발현을 억제하였다(Fig. 2-C).
- ROS 생성량은 대조군(B)이 정상군(A)에 비하여 큰 폭으로 증가하였으며, YSHHK 투여군(100 ㎍/㎖ C, 50 ㎍/㎖ D)은 대조군에 비하여 농도 의존적으로 ROS 생성을 억제하였다(Fig. 4).
- 2-B). TNF-α 유전자 발현에 미치는 영향은 RAW264.7 세포주에서 TNF-α 유전자 발현의 RQ 값이, 정상군은 0.041, 대조군은 1.00으로 나타났으며, YSHHK 100, 50, 10 ㎍/㎖ 농도 처리군에서는 각각 0.626, 0.787, 0.981 로 나타나 대조군에 비해 농도 의존적으로 유전자 발현을 억제하였다(Fig. 2-C).
- YSHHK의 항염증 효과에 관한 본 연구에서 대표적인 염증성 cytokine인 lL-1β, IL-6, TNF-α의 유전자 발현에 미치는 영향에 대해 살펴본 결과, IL-10 유전자 발현에 미치는 영향은 RAW264.7 세포주에서 IL-1β 유전자 발현의 RQ 값이, 정상군은 0.125, 대조군은 1.00으로 나타났으며, YSHHK 100, 50, 10 ㎍/㎖ 농도 처리군에서는 각각 0.555, 0.568, 0.905로 나타나 대조군에 비해 농도 의존적으로 유전자 발현을 억제하였다(Fig. 2-A). IL-6 유전자 발현에 미치는 영향에서는 RAW264.
- mLFCs에 대한 세포독성 평가에서 YSHHK는 200, 100, 50, 10, 1 ng/mH 농도에서 대조군(100 %)에 비해 각각 93.5 ± 4.6, 97.1 + 6.5, 96.1 ± 5.8, 100.3 + 4.6, 102.6 ± 3.8%로 세포독성이 없는 것으로 나타났다(Fig. 1).
- mLFCs에 대한 세포독성 평가에서 YSHHK는 200, 100, 50, 10, 1 ㎍/㎖ 농도에서 대조군(100%)에 비해 각각 93.5 ± 4.6, 97.1 ± 6.5, 96.1 ± 5.8, 100.3 ± 4.6, 102.6 ± 3.8 %로 세포독성이 없는 것으로 나타났다(Fig. 1).
- 龍膽瀉肝湯合黃連解毒加減은 RAW264.7 세포주에서 IL-1β, IL-6, TNF-α, COX-2 및 NOS-Ⅱ 의 유전자 발현을 농도 의존적으로 억제하였다. 龍膽瀉肝湯合黃連 解毒加減은 100, 50 ㎍/㎖ 농도에서 유의성 있게(p<0.
- 급성 염증 유발 생쥐 모델의 혈청 내 IL-W 생성량을 측정한 결과, 정상군은 1.3 ± 0.7 ng/mt 대조군은 57.4 + 5.2 ng/㎖로 나타난 반면, YSHHK 투여군에서는 32.1 ± 5.5 ng/㎖로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있게 (p<0.01) 감소하였다(Fig. 5-A).
- 급성 염증 유발 생쥐 모델의 혈청 중 TNF-α 생성량을 측정한 결과, 정상군은 1.1 ± 0.6 ng/㎖, 대조군은 77.8 ± 4.7 ng/㎖로 나타난 븐]면, YSHHK 투여군에서는 59.8 ± 4.2 ng/㎖로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있는 (p<0.01) 결과를 나타내었다(Fig. 5-C).
- 급성 염증 유발 생쥐 모델의 혈청내 IL-6 생성량을 측정한 결과, 정상군은 3.7 ±1.4 ng/㎖, 대조군은 326.4 ± 27.41 ng/㎖로 나타난 반면, YSHHK 투여군에서는 198.6 ± 19.7 ng/㎖로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있게 (p<0.001) 감소하였다(Fig. 5-B).
- 본 실험에서는 LPS로 급성 염증을 유발시킨 생쥐 모델을 이용하여 YSHHK의 항염증 효과를 살펴보았는데, 급성 염증 유발 생쥐 모델의 혈청 내 IL-1β, IL-6, TNF-α생성량을 측정한 결과, 정상군은 1.3 ± 0.7 ng/㎖ 대조군은 57.4 ± 5.2 ng/㎖로 나타난 반면, YSHHK 투여군에서는 32.1 ± 5.5 ng/㎖로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있게 (p<0.01) 감소하였다(Fig. 5).
- 생쥐의 복강에 LPS (3 ㎎/㎏) 주사하여 5일간 관찰한 결과, YSHHK 투여군은 LPS 투여 3일째부터 대조군에 비하여 생존율이 증가되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 6).
- 세포 내 ROS 생성량은 대조군이 정상군에 비하여 큰 폭으로 증가하였으며, YSHHK 투여군(100 ㎍/㎖ C, 50 ㎍/㎖ D)은 대조군에 비하여 농도 의존적으로 ROS 생성을 억제하였다(Fig. 4).
- 이상의 실험결과를 종합하면 龍膽瀉肝湯合黃連解毒加減은 IL-1β, IL-6, TNF-α, NOS-Ⅱ, COX-2의 유전자 발현을 억제하였으며, NO와 ROS의 생성을 억제하였다. 그리고 LPS로 유도된 급성 염증 유발 생쥐 모델의 혈청 내 IL-1β, IL-6, TNF-α의 생성량을 억제하였으며, LPS로 유도된 lethal endotoxemia에 대해 생명 연장 효과를 보이는 등 抗炎症 效果가 인정되므로, 炎症性 疾患 의 治療에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 瀉火解毒한다9,10). 이상의 효능을 종합하여 보면 龍膽瀉肝湯合黃連解毒湯加減은 瀉 火解毒, 淸熱燥濕, 消腫排膿하는 效能이 았어 乳發과 같은 乳房의 炎症性 질환의 치료에 적합한 方劑임을 알 수 있다.
- 이에 YSHHK가 RAW 264.7 세포주에서 COX-2와 NOS-H 유전자 발현에 미치는 영향에 대해 살펴본 결과, COX-2 유전자 발현에 미치는 영향은 RAW264.7 세포주에서 COX-2 유전자 발현의 RQ 값이, 정상군은 0.24Z 대조군은 1.00으로 나타난 반면, YSHHK 100, 50, 10 ㎍/㎖ 처리군에서는 각각 0.400, 0.599, 0.831 로 나타나 대조군에 비해 농도 의존적으로 유전자 발현을 억제하였다(Fig. 2-D).
- 이에 본 연구에서는 YSHHK이 NO 생성량 및 ROS 생성량에 미치는 영향에 대해 살펴본 결과 RAW264.7 세포주에서 NO 생성량은 정상군의 OD값이 0.054 ± 0.012 nmz 대조군이 1.458 ± 0. 236 nm로 나타났으며, YSHHK 100, 50, 10 ㎍/㎖ 농도 처리군이 각각 0.
후속연구
- NO와 ROS의 생성을 억제하였다. 그리고 LPS로 유도된 급성 염증 유발 생쥐 모델의 혈청 내 IL-1β, IL-6, TNF-α의 생성량을 억제하였으며, LPS로 유도된 lethal endotoxemia에 대해 생명 연장 효과를 보이는 등 抗炎症 效果가 인정되므로, 炎症性 疾患 의 治療에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 이상의 실험 결과로 보아 龍膽瀉肝湯合黃連解毒加減은 抗炎症 효과가 인정되므로 乳發과 같은 乳房의 炎症性 疾患에 유효하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
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