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문제 정의
- 연구결과는 아직 보그된 바가 없었다. 따라서 난소를 적출한 백서에 우슬을 농도별로 투여하여 골다공증 생화학적 지표, 대퇴골의 병리학적 검사, 골밀도와 무기질 함량을 측정하여 골다공증에 관한 효과에 대하여 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 가수술 군, n=8) 및 난소 절제를 시행하였다. kg당 10 mg의 Ketamin hydrochloride와 kg당 0.15 mg의 2% xylazine hydrochloride을 근육 주사하여 전신마취를 시행하였다. 일반적인 수술 전 처치방법에 따라 10% 요오드로 수술부위 및 주위를 세척 및 분리 후 하복부의 피부, 근육, 복막의 절개를 시행하여 양쪽 난소를 모두 노출시킨 후 난소를 절개하고 절제부위를 4호 실크로 결찰한 후 복막, 근육, 피부의 각 층을 3호 실크로 봉합하였다.
- 골길이, 둘레 측정은 버니어캘리퍼스를 이용하였고, 대퇴골 무게 측정은 희생 후 대퇴골을 적출하여 골막 분리 후 알코올 용액에 담가 지방을 제거한 후 무게(dry weight)를 전자저울을 이용하여 측정하였다.
- 골밀도는 요추 4-5번과 왼쪽 대퇴골의 골밀도를 Hologic사 (Waltham, USA)에서 제공한 소동물용 소프트웨어를 사용하여 이중에너지 흡수 계측기 (QDR-4500A) 토 측정하였다. 혈청 alkaline phosphatase(ALP) 활성은 Kind-king법을 이용한 kit(아산제약)을 사용하여 측정한다.
- 난소적출로 골다공증을 유발한 흰쥐에 우슬(Acyranthes Radix)추출물을 6주 동안 농도별로 투여하여 체중, 골밀도, 혈중생화학적 마커, 대퇴골의 무기질 함량, 조직학적 소견 등을 통하여 골다공증에 미치는 효과를 보았다. 체중은 정상대조군에 비하여 모든 실험군에서 유의하게 체중이 증가하였으며, 골밀도와 혈중 ALP가 유의하게 증가하였으며, 특히 500 ㎎/㎏ 의 농도에서 더 유의한 효과를 보였다.
- 병리조직학적 검사를 위하여 신장, 간, 대퇴골의 일부를 10% 중성완충 포르말린에 3일간 충분히 고정시킨 다음, 일반적인 조직 처리 과정을 거쳐 파라핀 포매기를 이용하여 포매했다. 포매된 조직을 마이크로톰으로 4 ㎛로 박절한 후 Hematoxylin & Eosin(H & E)염색을 실시하여 광학현미경하에서 병리 조직학적 변화를 관찰했다.
- 15 mg의 2% xylazine hydrochloride을 근육 주사하여 전신마취를 시행하였다. 일반적인 수술 전 처치방법에 따라 10% 요오드로 수술부위 및 주위를 세척 및 분리 후 하복부의 피부, 근육, 복막의 절개를 시행하여 양쪽 난소를 모두 노출시킨 후 난소를 절개하고 절제부위를 4호 실크로 결찰한 후 복막, 근육, 피부의 각 층을 3호 실크로 봉합하였다. 난소 절제 후 60일 후 실험을 하였다.
- 포매했다. 포매된 조직을 마이크로톰으로 4 ㎛로 박절한 후 Hematoxylin & Eosin(H & E)염색을 실시하여 광학현미경하에서 병리 조직학적 변화를 관찰했다.
- 혈청 alkaline phosphatase(ALP) 활성은 Kind-king법을 이용한 kit(아산제약)을 사용하여 측정한다. 혈청 GOT, GPT, Ca, P 함량은 혈액 자동분석기를 이용하여 측정하였다.
대상 데이터
- Sprague Dawley 벅서를 5주령에 정상대조군 (sham operation, 가수술 군, n=8) 및 난소 절제를 시행하였다. kg당 10 mg의 Ketamin hydrochloride와 kg당 0.
- 본 실험에 사용한 우슬은 화순시 소재의 생약협동조합에 서구입하였으며, 건조 . 분쇄 한 후 사용하였다.
데이터처리
- 일요인분산분석(one-way ANOVA)을 실시하였고, 사후검정으로 Duncan test를 사용하였다. 각 실험군의 측정 시기 간에 따른 차이를 검정하기 위하여 짝비교 T 검정(paired t-tcst)을 실시하였다. 모든 통계학적 유의 수준은 p<0.
- 0 windows를 사용하였다. 일요인분산분석(one-way ANOVA)을 실시하였고, 사후검정으로 Duncan test를 사용하였다. 각 실험군의 측정 시기 간에 따른 차이를 검정하기 위하여 짝비교 T 검정(paired t-tcst)을 실시하였다.
이론/모형
- 5%La2O3 용액으로 희석하여 AAS(Automic absorption spectrophotometer, Perkin-Emer Co, 2380)로 427 nm에서 흡광도를 측정하였다. 인의 함량은 Molybdenum blue 흡광도법을 이용하여 측정하였는데 일정량의 시료용액을 100 ml의 v-flask에 취한 후 ammonium molybdate를 가한 후 잘 혼합하여 방치하였다가 hydroquinon용액과 NazSCh용액을 가한 후 적용하여 30분 동안 발색시켜 650 nm에서 비색정량 하였다.
- 혈청 alkaline phosphatase(ALP) 활성은 Kind-king법을 이용한 kit(아산제약)을 사용하여 측정한다. 혈청 GOT, GPT, Ca, P 함량은 혈액 자동분석기를 이용하여 측정하였다.
성능/효과
- 83% 증가하였다. 6주간 실험동물 체중의 변화에 있어서 난소적출 후 치료 시작 시와 치료 종료 후의 체중 변화에서 우슬을농도별로 투여한 실험군들에서 골다공증을 유도한 실험 대조군에 비하여 감소하는 경향을 보였으나, 체중변화에 있어 실험군 간유의 한 효과를 보이지 않았다.
- Fig. 1에서는 실험 시작 후 모든 군에서 체중이 증가하는 것을 볼 수 있는데 6주 동안 정상군에서는 236.00에서 271.30으로 14.96%, 실험 대조군은 231.50에서 309.75로 33.80% 증가하였으며 I군은 244.80어서 277.43으로 13.33%, II 군은 233.67에서 283.23로 21.20% 증가하였다. HI군은 238.
- 83 IU/l 으로 유의하게 증가하였으며 실험군간의 유의성은 없었다. Phosphorus도 실험군에서 정상군에 비해 유의하게 증가하였으며, 실험군 DI에서 실험대조군에 비해 유의하게 감소함을 나타내었다. GOT와 Cae 통계적으로 유의한차이는 없었다(Table 3).
- 그러나 우슬 농도별 처리시에는 군간 유의한 차이성을 보이지 않았으며, 우슬 처리시 농도 의존적인 경향은 나타나지 않았다. 대퇴골의 길이, 둘레, 무게의 변화를 측정하여 본 결과 길이, 둘레, 무게에는 유의한 변화가 없었다. Lenchik 등찌과 Wasnich 등A)은 골밀도를 골다공증의 위험인자 중에 가장 예방 가능하고 중요한 인자로 제시하면서, 낮은 골밀도와 골절의 관계에 대해 보고하였다.
- 그 외 Mg, K, Na, Moisture, Crude ash의 측정 결과 유의성은 없었다. 대퇴골의 단면을 조직학적으로 H&E 염색을 통하여 확인하여 본 결과 난소 절제술 후 실험대조군(Fig. 3B)의 대퇴골 단면에서 정상군 (Fig. 3A)에 비하여 선명한 골융해의 소견을 보였으며, 우슬 추출물을 투여한 실험군들에서는 대조군과 비교하여 대퇴골 단면에서 골융해가 많이 호전됨을 확인할 수 있었으나 농도 의존적인 경향을 보이지는 않았다(Fig. 3C, 3D, 3E).
- 본 연구에서도 우슬의 농도별 투여시 혈중 Ca과 P의 농도에는 영향을 주지 않는 것으로 보여진다. 대퇴골의 무기질 함량의 변화를 본 결과 Ca 함량은 정상군보다 실험대조군에서 골다공증시 유의하게 낮게 나타났으나 실험군간의 유의성은 없었다. 그리고 Pe 정상군에서 실험대조군이 유의하게 낮게 나타났으며, 실험군 I 과 n 는 실험대조군에 비해 유의하게 높게 나타났다.
- 본 연구에서는 골다공증을 유발한 대조군에 비하여우슬을 농도별로 투여한 실험군에서 증가율이 감소되어 나타났으나 실험군 간의 차이는 없었다. 또한 간세포의 손상시 혈액 속으로 다량 방출되어 간 질환계의 지표로 활용되는 간효소 수치에서 GOT는 정상군에 비하여 약간 감소하는 경향을 보였으나 유의하지는 않았고, GPT는 정상군에 비해 실험대조군이 유의하게 증가하였으며(P<0.05) 우슬을 투여한 실험군 간에 유의성은 없었다. 이로 보아 우슬의 농도별 투여시 간독성에는 영향을 미치지 않은 것으로 보여진다.
- 그러나 골밀도 측정을 기저로 하는 난소적출 백서로 유도한 골다공증과 대체약물에 관한 실험적 연구는 일부 선행연구에 한정되어 있으며, 골다공증과 관련하여 본 실험에서 사용한 우슬의 연구는 극히 미비하였다. 본 연구결과에서 골밀도와 관련한 우슬의농도별 차이를 조사한 결과 골다공증만을 유도한 실험대조군에 비해 우슬 농도별로 투여한 실험군들 모두에서 유의한 골밀도증가를 보였으며(pv0.05), 실험군간 약간의 차이를 보였으나 유의하지는 않았다.
- 또한 혈중 P과 Ca는 뼈의 인산칼슘과 hydroxyapatites] 상태로 존재하나 대부분이 유리형태로 존재하며 PTH에 의해 정상범위인 3-4 mg/dL 로 일정하게 유지된다. 본 연구에서 혈중 Ca과 P의 농도가 유의한 차이가 없다고 나타났는데 이는 난소적출 백서에게 대두 이소플라본을 수준별로 공급하였을 때 혈중 Ca 농도가 유의한 차이가 없었다는 보고와, 사람을 대상으로 한 연구에서도 혈청 Ca과 P의 농도 역시유의적인 차이가 없었다는 선행연구와 일치하였다. 본 연구에서도 우슬의 농도별 투여시 혈중 Ca과 P의 농도에는 영향을 주지 않는 것으로 보여진다.
- ALP의 경우 젊은 연령층에서의 증가는 골형성의 증가를 의미하여 긍정적이나, 폐경 후에는 골밀도와 음의 상관관계를 나타내어 골 교체율의 증가를 의미한다. 본 연구에서는 골다공증을 유발한 대조군에 비하여우슬을 농도별로 투여한 실험군에서 증가율이 감소되어 나타났으나 실험군 간의 차이는 없었다. 또한 간세포의 손상시 혈액 속으로 다량 방출되어 간 질환계의 지표로 활용되는 간효소 수치에서 GOT는 정상군에 비하여 약간 감소하는 경향을 보였으나 유의하지는 않았고, GPT는 정상군에 비해 실험대조군이 유의하게 증가하였으며(P<0.
- 같은 배아세포에서 분화되기 때문으로 사료된다. 본 연구에서도 실험 전과 비교하여 실험군에 비하여 골다공증 대조군에서 유의한 체중 증가를 보였으며, 우슬 농도별 처리 실험군 간의 체중에 있어서 대조군에 비해 체중증가율이 많이 감소됨을 보여주고 있었다. 그러나 우슬 농도별 처리시에는 군간 유의한 차이성을 보이지 않았으며, 우슬 처리시 농도 의존적인 경향은 나타나지 않았다.
- 본 연구에서 혈중 Ca과 P의 농도가 유의한 차이가 없다고 나타났는데 이는 난소적출 백서에게 대두 이소플라본을 수준별로 공급하였을 때 혈중 Ca 농도가 유의한 차이가 없었다는 보고와, 사람을 대상으로 한 연구에서도 혈청 Ca과 P의 농도 역시유의적인 차이가 없었다는 선행연구와 일치하였다. 본 연구에서도 우슬의 농도별 투여시 혈중 Ca과 P의 농도에는 영향을 주지 않는 것으로 보여진다. 대퇴골의 무기질 함량의 변화를 본 결과 Ca 함량은 정상군보다 실험대조군에서 골다공증시 유의하게 낮게 나타났으나 실험군간의 유의성은 없었다.
- 이상의 연구 결과로 보아 골다공증 백서에서 우슬의 농도별 투여 시 대조군에 비해 모든 실험군의 골밀도가 유의하게 증가하였으며, 우슬이 골다공증에 효과적인 것으로 나타났다. 우슬이골다공증과 관련하여 ALP, Ca, P 등의 골대사에 관련한 요인들에 영향을 미치는 것으로 보여지며, 우슬과 골다공증에 관련된 연구가 추후 지속되어야 될 것으로 사료된다.
- 골다공증에 미치는 효과를 보았다. 체중은 정상대조군에 비하여 모든 실험군에서 유의하게 체중이 증가하였으며, 골밀도와 혈중 ALP가 유의하게 증가하였으며, 특히 500 ㎎/㎏ 의 농도에서 더 유의한 효과를 보였다.
후속연구
- 우슬이골다공증과 관련하여 ALP, Ca, P 등의 골대사에 관련한 요인들에 영향을 미치는 것으로 보여지며, 우슬과 골다공증에 관련된 연구가 추후 지속되어야 될 것으로 사료된다.
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