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문제 정의
- 이에 저 자는 뇌 혈 류가 감소하게 되면 허 혈 성 뇌 손상이 나타나게 되 고, 이로 말미 암아 대사산물이 침착되어 각종의 뇌조직내 염증과 뇌세포 사멸이 발생 되 기 때문에 소회향이 신경세포사멸과정에서 생성되는 LDH 양에 미치는 억제 효과와 뇌허혈이 유발된 흰쥐의 혈청 내에서 항염증 사이토카인의 생성능과 염증촉발 사이토카인의 생성능을 살펴보았다.
- 이에 저자는 개별 한약재의 다양한 실험을 통하여 뇌혈관에 효과를 나타내는 약물들을 실험을 실시하였으며, 그 중 溫裏한 약물인 소 회향이 뇌혈관계 질환에 해당되는 中風에 어떠한 영향을 미치는가에 대하여 알아보고자 뇌 혈류개선 및 보호에 미치는 기전을 확인한 결과 유의성을 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 2~4주 후 교세포 (glial cell)가 충분히 증식한 다음 약물 처리전 배양액으로 3번 씻어주고 나서 FF를 농도별(1 ug/ml, 10 ug/ml, 100 ug ml)로 처리하였다. 소회향 투여 24시간 후 96 well plate의 각 well에 배양액 25 ul를 넣고, buffer 125 ml, 0.
- 외경동맥의 분지점으로부터내경 동맥내로 외경동맥을 통하여 3-0 단 선조나 일론 봉합사를 삽입함으로써 MCA 기저부를 폐쇄하였다. 2시간 후 내경 동맥내에 삽입되어 있는 단선조 나일론 봉합사를 MCA 기저부로부터 제거해 줌으로써 혈액을 재관류시켰다.
- Epidermal growth factor (Sigma E4127)를 10 ng/m4 농도로 첨가한 후 24 well plate (Primaria, Falcon) 에 0.5 hemisphere/plate 밀도로 각 well 당 400 ul씩 도포하여 37℃, 5% CO2와 100% 습도가 유지되는 CO2 배양기 (VS-9108MS, Korea)에서 배양하였다.
- 뇌허혈 병태 모델의 혈청내에서 생성되는 IL-1P 양 측정은 rIL-iP ELISA kit를 이용하였다. 96 well plate 에 rIL-10 Standard diluent buffer(SDB) 100 ul를 넣은 후, 나머지 well에는 혈청 50 ul와 SDB 50 ul를 넣은 다음 실온에서 3시간 방치 한 뒤 washing buffer(WB)로 4 회 세척하였다.
- 뇌허혈 병태 모델의 혈청내에서 생성되는 TNF-a 양 측정은 rTNF-a ELISA kit를 이용하였다. 96 well plate에 rTNF-a SDB 50 ul를 넣은 다음, 나머지 well에 혈청과 controKhigh, low)을 각각 50 ul씩 분주한 후 SDB 50 ul를 넣었다.
- 뇌허혈 병태 모델의 혈청에서 생산되는 사이토카인 양을 알아보기 위하여 MCA 폐 색법으로 뇌허혈을 유발시킨 후 소회향을 투여하고, 유발 1시간 후와 재관류 1시간이 경과된 다음 뇌 허혈 병태 모델의 혈액을 취하여 TNF-a 생성 능을 측정하였다 (Fig. 3).
- 뇌허혈 병태 모델의 혈청에서 생산되는 사이토카인 양을 알아보기 위하여 MCA 폐색법으로 뇌허혈을 유발시킨 후 소회향을 투여하고, 유발 1시간 후와 재관류 1시간이 경과된 다음 뇌 허혈 병태 모델의 혈액을 취하여 IL-10 생성 능을 측정하였다 (Fig. 5).
- 뇌허혈 병태 모델의 혈청에서 생산되는 사이토카인 양을 알아보기 위하여 MCA 폐색법으로 뇌허혈을 유발시킨 후 소회향을 투여하고, 유발 1시간 후와 재관류 1시간이 경과된 다음 뇌 허혈 병태 모델의 혈액을 취하여 TGF-P 생성 능을 측정하였다 (Fig. 4).
- 뇌허혈 흰쥐의 혈청에서 생산되는 사이토카인 양을 알아보기 위하여 MCA 폐색법으로 뇌 허혈을 유발시킨 후 소회향을 투여하고, 유발 1시간 후와 재관류 1시간이 경과된 다음 뇌 허혈 병태 모델의 혈액을 취하여 IL-1P 생성능을 측정하였다 (Fig. 2).
- 뇌허혈시 염증반응이 나타나고, 염증반응으로 인해 더욱더 심한 뇌손상이 나타난다 하여 허혈로 인해 야기되는 뇌손상 억제효과를 나타낸 소회향이 염증촉발 사이토카인의 생성 능과 항염증 사이토카인의 생성능에 미치는 효과를 관찰하였다.
- 소회향 (10 ㎎/㎏, i.p.)가 뇌허혈-재관류 동안에 뇌허혈 병태 모델의 생리학적 변수 (MABP, HR, pH, 동맥혈의 산소 분압, 동맥혈의 이산화탄소 분압 및 직장내 온도 등)에 미치는 영향을 알아보기 위하여 뇌허혈 전과 뇌 허혈 1시간 후 그리고 혈액 재관류 6 시간 후의 생리학적 변수를 측정하였다 (Table I ).
- 소회향이 신경 세포의 손상을 억제하는지에 대하여 알아보기 위하여 NMDA를 처리한 신경 세포에 소회향을 농도별 (1 座/!試 10 /zg/m£, 100 昭/ml)로 투여한 결과 다음과 같았다 (Fig. 1).
- 실험 동물에게 기관절개술을 행하여 14G catheter로써 기도를 확보하고 gallamine (3—5 ㎎/㎏, i.m.)을 투여하여 골격근을 마비시킨다. 동물용 호흡기 (Harvard, USA)를 사용하여 분당 50-60 회의 호흡을 유지시킨다.
- 약물처리 방법은 24 well plate를 이용하여 맨 첫 줄(4 well)은 약물처리하지 않은 허위 군으로, 둘째 줄(4 well) 은 N-methyl-D-aspartate(NMDA, 30 J1M)를 처리한 대조군으로, 셋째 줄부터 다섯째 줄까지는 소회향을 처리한 실험군으로 하였다.
- 병태 모델은 Longa 등의 방법 3)에 따라 정상 흰쥐의 총경동맥과 외경동맥을 결찰하고 내 .외경동맥의 분지점으로부터내경 동맥내로 외경동맥을 통하여 3-0 단 선조나 일론 봉합사를 삽입함으로써 MCA 기저부를 폐쇄하였다. 2시간 후 내경 동맥내에 삽입되어 있는 단선조 나일론 봉합사를 MCA 기저부로부터 제거해 줌으로써 혈액을 재관류시켰다.
- 경동맥에 PE-50 polyethylene tube를 삽관하고 이를 통하여 혈액 gas 및 pH를 측정하고 PaCO2 가 33-45 mmHg가 되도록 호흡을 조절한 후이를 유지시킨다. 전신 혈압 변동을 관찰하기 위하여 실험 동물의 대퇴동맥에 삽입된 polyethylene tube (PE-50)에 연결된 Statham pressure transducer (Gould, USA)를 통하여 혈압을 MacLab과 Macintosh computer로 구성된 data acquisition system에 기록한다.
- 0 m£ 를 채혈하였다. 채혈시에는 반드시 뇌 혈류역학변동이 변화되지 않도록 하기 위하여 조심스럽게 5.0 m2 주사기를 통해 채혈하였고, 만약 채혈 시 뇌혈류역학 변동에 이상이 발생되면 사이토카인 생성능 측정 혈청으로 사용하지 않았다. 채혈 후 30분동안 실온에 방치한 후 3, 000 rpm 으로 30분동안 원심분리시킨 다음 혈청만을 취해 냉동 보관하면서 필요시마다 해동시켜 사용하였다.
대상 데이터
- 동물은 생후 2일째의 ICR 생쥐와 체중 300 g내외의 웅성 Sprague-Dawley계 흰쥐를 (주) 다물사이언스 및 화인 실험 동물 센타로부터구입하여 항온항습 장치가 부착된 사육장에서고형사료 (삼양주식회사, 한국)와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경 (실내온도 24±2℃, 습도 55+5%, 12시간 drak/light)에 적응시 킨 후사용하였다.
- MILL.)。은 원광대학교 부속익산한방병원에서 구입한 후 정선해서 사용하였다. 소회향 100 g을 3, 000 ml 환저 플라스크에 증류수 1,500 ml와 함께 120분간 가열한 다음 전탕액을 여과지로 여과한 뒤 5, 000 rpm으로 30분간 원심분리 한 후 rotary vacuum evaporator (EYELA, Japan) 에 넣어 감압 농축한 후 Freeze dryer (SFDSM 06, Korea)로 동결 건조시켜 9.
데이터처리
- 소회향의 효과에 대한 통계처리는 Student's t-test에 의하였고, p-value는 0.05 미 만인 경우에만 유의성을 인정하였다.
이론/모형
- 뇌허혈 병태 모델 유발은 널리 사용하는 중대뇌동맥(middle cerebral artery, MCA) 폐쇄법을 이용하였다. 병태 모델은 Longa 등의 방법 3)에 따라 정상 흰쥐의 총경동맥과 외경동맥을 결찰하고 내 .
- 이용하였다. 병태 모델은 Longa 등의 방법 3)에 따라 정상 흰쥐의 총경동맥과 외경동맥을 결찰하고 내 .외경동맥의 분지점으로부터내경 동맥내로 외경동맥을 통하여 3-0 단 선조나 일론 봉합사를 삽입함으로써 MCA 기저부를 폐쇄하였다.
성능/효과
- 1. 뇌허혈 병태 모델에 소회향을 투여한 결과, MCA 폐색 1시간 후와 재관류 1시간 후에서 실험군의 IL-1P 생성능은 대조군에 비해 유의 성있게 감소되었다.
- 2. 뇌허혈 병태 모델에 소회향을 투여한 결과, MCA 폐 색 1시간 후와 재관류 1시간 후에서 실험군의 TNF-a 생성능은 대조군에 비해 유의성 있게 감소되었다.
- 3. 뇌허혈 병태 모델에 소회향을 투여한 결과, MCA 폐색 1시간 후와 재관류 1시간 후에서 실험군의 TGF-P 생성능은 대조군에 비해 유의 성있게 증가되었다.
- 4. 뇌허혈 병태 모델에 소회향을 투여한 결과, 재관류 1시간 후에서 실험군의 IL-10 생성 능은 대조군에 비해 유의 성있게 증가되었다.
- MCA 폐색 1시간 후 실험군의 TNF-a의 생성 능은 대조군보다 유의성있게 감소되었고, IL-10의 생성능도 대조군보다 감소되었으나 IL-1P 및 TNF-a의 생성능은 대조군에 비하여감소되었다. 이와 같은 결과는 소회향이 뇌 허혈 초기에서부터 항염증 사이토카인인 TGF-P 생성능을 촉진시켜 염증촉발 사이토카인인 IL-W 및 TNF-a의 생성능을 억제함을 알 수 있었다.
- 02%이었다. NMDA와 소회향을 각 농도별로 처리한 실험군의 LDH 활성도는 각각 99.64+0.02%, 98.56±0.02%와 97.66±0.01%로 대조군에 비해감소되는 경향을 보였지만 유의성은 인정되지 않았다.
- 이상의 결과, 뇌허혈시 ILTB와 TNF-a가 상승된다는 보고49 剥와 NOS 억제제인 처리하게 되 면 IL-邱와 TNF-a가 상승하게 된다는 보고 汕에서 볼 수 있듯이 소회 향은 NOS를 활성화시켜 염증촉발 사이토카인의 생성을 억제하여허혈시 나타나는 염증반응을 억제한 것으로 생각된다.
- 이상의 결과, 소회향은 항염증 사이토카인의생성을 촉진시킴으로써 염증 촉발 사이토카인의 생성을 억제해 허혈로 인한 뇌손상을 억제하는 것으로 생각된다.
- 이와 같은 결과는 소회향이 뇌 허혈 초기에서부터 항염증 사이토카인인 TGF-P 생성능을 촉진시켜 염증촉발 사이토카인인 IL-W 및 TNF-a의 생성능을 억제함을 알 수 있었다. 재관류 1시간 후 실험군의 IL-1P 및 TNF-a의 생성능은 대조군에 비해 유의성있게감소되었나 실험군의 TGF-I3 및 IL-10의 생성 능은 대조군에 비하여 유의성있게 증가되어 본방이 뇌허혈 초기를 포함한 뇌허혈 기간 동안 항염증 사이토카인의 생성능을 촉진시킴으로써 염증촉발 사이토카인의 생성능을 억제시켜항허혈 작용이 있음을 보여주었다.
- 이와 같은 결과는 소회향이 뇌 허혈 초기에서부터 항염증 사이토카인인 TGF-P 생성능을 촉진시켜 염증촉발 사이토카인인 IL-W 및 TNF-a의 생성능을 억제함을 알 수 있었다. 재관류 1시간 후 실험군의 IL-1P 및 TNF-a의 생성능은 대조군에 비해 유의성있게감소되었나 실험군의 TGF-I3 및 IL-10의 생성 능은 대조군에 비하여 유의성있게 증가되어 본방이 뇌허혈 초기를 포함한 뇌허혈 기간 동안 항염증 사이토카인의 생성능을 촉진시킴으로써 염증촉발 사이토카인의 생성능을 억제시켜항허혈 작용이 있음을 보여주었다.
- 폐색 1시간 후 대조군의 IL-10 생성능을 100.00±0.11%라 하였을 때 실험군의 IL-10 생성 능은 100.18±0.01%로 대조군과 유사하였고, 재관류 1시간 후 대조군의 IL-10 생성능을 100.00±0.06%라 하였을 때 실험군의 IL-10 생성 능은 126.94±0.04%로 대조군보다 유의성 (P<0.05) 있게 증가되었다.
- 폐색 1시간 후 대조군의 IL-1P 생성능을 100.00+0.02%^ 하였을 때 실험군의 IL-1P 생성 능은 85.95±0.03%로 대조군보다 유의성 (PC0.01)있게 감소되었고, 재관류 1시간 후 대조군의 IL-1P 생성능을 100.00±0.03%라 하였을 때 실험군의 IL-1P 생성능은 82.49±0.03%로 대조군보다 유의성(P<0.01)있게 감소되었다.
- 폐색 1시간 후 대조군의 TGF-0 생성능을 100.00±0.05%라 하였을 때 실험군의 TGF-P 생성능은 122.18±0.03%로 대조군보다 유의성 (PV0.01)있게 증가되었고, 재관류 1시간 후 대조군의 TGF-p 생성능을 100.00+0.03%^ 하였을 때 실험군의 TGF-B 생성능은 128.12±0.03%로 대조군보다 유의성 (FV0.001) 있게 증가되었다.
- 폐색 1시간 후 대조군의 TNF-a 생성능을 100.00+0.03%^ 하였을 때 실험군의 TNF-a 생성 능은 76.59±0.02%로 대조군보다 유의성 (P<0.001)있게 감소되었고, 재관류 1시간 후 대조군의 TNF-a 생성능을 100.00±0.02%라 하였을 때 실험군의 TNF-a 생성능은 71.85±0.09%로 대조군보다 유의성 (PV0.01)있게 감소되었다.
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