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문제 정의
- 본 연구에서는 유황이 여드름 유발균과 염증에 미치는 영향을 알아보기 위하여 세포독성실험, NO 생성 저해능을 통한 항염 효과, DPPH 라디칼 소거 능을 통한 항산화 효과와 여드름을 유발하는 혐기성 세균인 Propionibacterium acnes에 대한 항균력을 실험하였다. 이에 저자는 유황이 여드름 치료에 미치는 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 보고가 있다. 이를 근거로하여 본 연구에서는 항염증작용을 나타내는 유황의 항산화 작용 여부를 검색하기 위하여 DPPH radical 소거법을 이용하여 유황에 대하여 항산화작용을 검색하였다.
- 실험하였다. 이에 저자는 유황이 여드름 치료에 미치는 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 비누 등을 많이 사용한다'. 이처럼 유황은 외용약으로 사용되어 여드름에 효능이 있다고 알려져 있어 실험을 통하여 규명하고자 한다. 실험은 유황의 농도별 세포독성, 항염효능, 항산화능, 항균효능 등을 알아보았다.
제안 방법
- 배양 후 시료의 최종 농도가 각각 20, 50, 100 의 농도가 되도록 세포에 처리하여 주고 염증반응 유도 인자인 LPS를 100 mg/의 농도로 처리하여 주었다. 24시간 배양 후 배지를 이용하여 Nitric oxide(NO)의 생성 정도를 측정하였다. 96 well plate에 세포배양액 50 R와 Griess 시약 50 R를 혼합하여 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광값을 측정하였다.
- DPPH의 환원성을 이용하여 시료의 DPPH 라디칼 소거효과를 측정하였다. DPPH를 메탄올에 용해시켜 0.
- 7 세포를 접종한 후 24시간 배양하였다. 배양 후 시료의 최종 농도가 각각 20, 50, 100 의 농도가 되도록 세포에 처리하여 주고 염증반응 유도 인자인 LPS를 100 mg/의 농도로 처리하여 주었다. 24시간 배양 후 배지를 이용하여 Nitric oxide(NO)의 생성 정도를 측정하였다.
- 이처럼 유황은 외용약으로 사용되어 여드름에 효능이 있다고 알려져 있어 실험을 통하여 규명하고자 한다. 실험은 유황의 농도별 세포독성, 항염효능, 항산화능, 항균효능 등을 알아보았다.
- 50/disk의 농도로 10분간 정치하여 시료가 모두 배지에 확산되어 흡수된 후, 균의 생장 최적 온도인 37℃ 에서 배양하였다. 양성 대조군으로 tridosan을 이용하여 시험한 후, 72시간 동안 배양하여 균의 생장 억제환의 직경을 측정하여 항균 활성을 비교 하였다.
- 96 well plate에 세포배양액 50 R와 Griess 시약 50 R를 혼합하여 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광값을 측정하였다. 양성 대조군으로는 NO 생성 억제제인 L-NMMA를 50 //M이 되도록 시험 시료와 같은 방법으로 처리하여 시험 시료의 NO 생성 저해 능을 비교하였다.
- 열수추출 유황과 에탄올 추출 유황의 여드름 유발 균과 염증에 미치는 영향을 알아보기 위하여 항염효능, 항산화능, 여드름 유발균인 Propionibaaerium acnee 대한 항균효능을 측정하는 실험을 하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 에탄올 추출의 경우 같은 방법으로 분쇄하여 70% EtOH 500 을 넣고 실온에서 180분 동안 교반기로 추출하였다. 추출한 후 여과지(ADVANTEC 5C)로 여과하고 여과액을 회전 감압농축기를 이용하여 완전 농축하였다. 각 시료를 적당량을 가하여 microtube 에 담은 후 100% DMSO를 이용하여 20 mg/의 농도로 만들어 실험에 사용흐였다.
- 5x10' cells/의 농도로 준비하였고 균 희석액을 미리 준비해 둔 agar plate에 굳기 직전의 배지와 혼합하여 굳을 때까지 정치하였다. 충분히 굳은 고체배지 위에 멸균된 paper disk를 올려놓은 후 각각 5, 10 mg/찌의 농도로 희석되어진 시료를 disk에 loading 하였다. 50/disk의 농도로 10분간 정치하여 시료가 모두 배지에 확산되어 흡수된 후, 균의 생장 최적 온도인 37℃ 에서 배양하였다.
대상 데이터
- HaCaT cell과 Raw 264.7 cell을 10% fetal bovine serum, penicillin(100 units/ml), streptomycin( 100 units/ml)0] 첨가된 DMEM (Dulbecco's modified Egale*s medium) 배지로 5% CO2, 371에서 배양하였으며, 배지는 3~4일 간격으로 교체하고 배양용기에 90%이상 자라게 되면 계대 배양하여 실험에 사용하였다
- 균의 생육배지로서 Reinforced-clostridial Broth를 사용하였으며 37P, incubator에서 72시간 동안 배양하였다. 항균성 실험에 사용한 고체 배지는 각 배지의 Agart 사용하였다'지
- 본 실험에 사용된 유황은 시중에서 엄선하여 구입한 후 50 g을 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용한 l, l-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), 3-(4, 5-dimethyl thiazol-2-gel)- 2, 5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT), N°-methyl-L-arginine acetate salt(L-NMMA), Lipopolysaccharide(LPS) 시약들은 Sigma(USA), Dimethyl sulfoxide (DMSO), 2-Propanol Hueller- Hinton Brothe Merck(USA)에서 구입하여 사용하였으며, ELISA reader(Perkin-Elmer, Foster City, CA), Spectrophotomrter(UNICO.. USA), Micro centrifuge(Hettich, Germany) 등의 기기를 실험에 사용하였다.
- 유황 25 각각 에탄올 추출과 열수 추출을 하여 실험에 사용할 시료를 제조하였다. 열수 추출의 경우 분쇄기를 이용하여 분말로 만들고 2차 증류수 1 Z 와 혼합하여 약탕기로 10에서 150분 동안 추출하였다.
- 항균실험에 사용한 균주는 혐기성 균주인 여드름 유발균주Propionibacterium acnes를 한국 생명공학 연구원 생물자원센터에서 분양 받아 사용하였다. 균의 생육배지로서 Reinforced-clostridial Broth를 사용하였으며 37P, incubator에서 72시간 동안 배양하였다.
- 항염에 사용된 Raw 264.7(Mouse Macrophage ceU line) 세포주는 한림대학교 TIC에서, 세포독성에 사용된 HaCaT(Human Keratinocyte cell line) 세포주는 강원대학교 생화학과 김병철 교수로부터 분양받아 사용하였으며, 항균실험에 사용한 균주는 혐기성 균주인 여드름 유발균주 Propionibacterium acmMKCTC 3314)를 한국 생명 공학 연구원 생물자원센터에서 분양 받아 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 평균土표준편차로 표기 하였고 통계적 유의성은 one-way ANOVA로 하였으며 p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
이론/모형
- 항균 효능을 평가하기 위해 본 실험에서는 paper disk diffusion 방법을 사용하였다';”. 10% DMSO에 stock되어 -701에 보관되어 있는 균주를 백금이를 이용하여 agar plate에 streaking하여 37t 에서 72시간 배양 하였다.
성능/효과
- 1. 세포 독성에 대해 실험한 결과, 열수추출한 유황은 농도에 따른 변화가 없었으나 에탄올 추출한 유황의 경우 세포생존율이 유의성 있게 감소하였다.
- 2. 항염효능에 대해 실험한 결과, 열수추출한 유황, 에탄올추출한 유황은 농도에 따라 NO 생성 저해능이 유의성 있게 증가하여 항염효능이 있는 것으로 나타났다.
- 3. 항산화능에 대해 실험한 결과, 열수추출한 유황, 에탄올추출한 유황은 농도에 따라 DPPH 라디칼 소거능이 유의성 있게 증가하였으나 에탄올추출 유황 100 에서는 오히려 감소하였다.
- 4. 항균효능에 대해 실험한 결과, 열수추출한 유황과 에탄올추출한 유황에서 항균효능을 나타내지 않아 항균효능에 대한 유의성은 인정되지 않았다.
- 세포 독성에 대해 실험한 결과, 열수추출 유황은 20 에서 78.1 ±4.5%, 50 ㎛에서 79.8±3.5%, 100 에서 79.1 ±8.8%의 세포 생존율을 나타냈으며, 에탄올추출 유황은 20 에서 55.3 + 11.2%, 50 ㎛에서 39.9+4.2%, 100 에서 19.6±4.4%의 세포생존율을 나타냈다.
- 세포 독성에 대해 실험한 결과, 유황의 열수 추출에서는 20 /지농도에서 78.1 ±4.5%, 50 ㎛ 농도에서 79.8±3.5%, 100 ㎛에서 79.1+8.8% 의 세포생존율을 나타냈으며 , 에탄올추출에서는 20 ㎛에서 55.3±11.2%, 50 ㎛농도에서 39.9+4.2%, 100 ㎛에서 19.6±4.4%의 세포 생존율을 나타냈다. 열수추출한 유황은 농도에 따른 변화가 없었으나 에탄올추출한 유황의 경우 세포 생존율이 유의성 있게 감소하여 에탄올추출 유황의 세포독성이 열수추출 유황보다 강한 것으로 나타났다.
- 3%의 DPPH 라디칼 소거능을 나타내어 오히려 수치가 감소하여 향후 연구가 더 필요할 것으로 생각된다. 에탄올추출의 100 /에서만 DPPH 라디칼 소거능이 낮아졌으며 다른 농도에서는 농도에 따라 DPPH 라디칼 소거능이 증가하기는 하였으나, 열수추출 유황 100 에서만 유의성이 나타났다.
- 1%의 NO 생성 저해능을 나타내었다. 열수추출, 에탄올추출 유황 모두 농도에 따라 NO 생성 저해능이 유의성 있게 증가하여 항염효능이 있는 것으로 나타났다.
- 4%의 세포 생존율을 나타냈다. 열수추출한 유황은 농도에 따른 변화가 없었으나 에탄올추출한 유황의 경우 세포 생존율이 유의성 있게 감소하여 에탄올추출 유황의 세포독성이 열수추출 유황보다 강한 것으로 나타났다.
- 항균효능에 대해 실험한 결과, Triclosane 100 /disk에서 직경이 38이었으며, 열수추출과 에탄올 추출한 유황 250 /disk, 500 /disk 농도에서 모두 항균효능을 나타나지 않아 항균효능에 대한 유의성은 인정되지 않았다.
- 항균효능에 대해 실험한 결과, Triclosane 100 /disk에서 직경이 38이었으며, 열수추출한 유황과 에탄올추출한 유황은 250 /disk농도와 500 /disk농도에서 항균효능을 나타내지 않았다.
- 항산화능에 대한 실험 결과, Quercetine 20 에서 62.5±5.8%의 DPPH 라디칼 소거능을 나타냈으며, 열수추출 유황은 20 에서 5.0± 0.7%, 50 ㎛에서 14.8±0.3%, 100 ㎛에서 24.4±0.8%의 DPPH 라디칼 소거능을 나타냈고, 에탄올추출한 유황은 20 에서 4.0±2.2%, 50 ㎛농도에서 12.7±3.8%, 100 ㎛에서 5.8± 3.3%의 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었다.
- 항산화능에 대해 실험한 결과에서는 Quercetin 은 20 /찌농도에서 62.5±5.8%의 DPPH 라디칼 소거 능을 나타냈으며, 유황의 열수추출에서는 20 농도에서 5.0±0.7%, 50 ㎛농도에서 14.8±0.3%, 100 /에서 24.4±0.8%의 DPPH 라디칼 소거능을 나타냈으며 , 에탄올추출에서는 20 /지에서 4.0±2.2%, 50 /농도에서 12.7±3.8%, 100 ㎛에서 5.8±3.3%의 DPPH 라디칼 소거 능을 나타내었다. 에탄올추출한 유황은 100 에서 5.
- 항염효능에 대해 실험한 결과, NMMA는 50 도에서 50.4±13.1%의 NO 생성 저해능을 나타냈으며, 열수추출한 유황은 20농도에서 23.9±0.4%, 50 /찌농도에서 33.0±2.7%, 100 ㎛에서 67.6±7.9%의 NO 생성 저해능을 나타냈으며, 에탄올추출한 유황은 20 에서 7.0±3.6%, 50 찌농도에서 35.8±3.2%, 100 에서 85.7±3.1%의 NO 생성 저해능을 나타내었다.
- 항염효능에 대해 실험한 결과에서는 NMM는 50㎛농도에서 50.4±13.1%의 NO 생성 저해 능을 나타냈으며, 유황의 열수추출에서는 20 농도에서 23.9+0.4%, 50 ㎛농도에서 33.0±2.7%, 100 /에서 67.6±7.9%의 NO 생성 저해능을 나타냈으며, 에탄올추출에서는 20 에서 7.0±3.6%, 50 ㎛농도에서 35.8+3.2%, 100 ㎛에서 85.7±3.1%의 NO 생성 저해능을 나타내었다. 열수추출, 에탄올추출 유황 모두 농도에 따라 NO 생성 저해능이 유의성 있게 증가하여 항염효능이 있는 것으로 나타났다.
후속연구
- 3%의 DPPH 라디칼 소거 능을 나타내었다. 에탄올추출한 유황은 100 에서 5.8±3.3%의 DPPH 라디칼 소거능을 나타내어 오히려 수치가 감소하여 향후 연구가 더 필요할 것으로 생각된다. 에탄올추출의 100 /에서만 DPPH 라디칼 소거능이 낮아졌으며 다른 농도에서는 농도에 따라 DPPH 라디칼 소거능이 증가하기는 하였으나, 열수추출 유황 100 에서만 유의성이 나타났다.
- 이상과 같은 실험결과를 종합할 때 유황은 항균효과에 있어서는 유효한 결과를 나타내지 못하였으나 항염, 항산화작용에는 유효한 효과가 있었으며 이는 염증이 생긴 이후에 염증을 억제하는 효과가 있을 것으로 판단되며 여드름의 치료에 응용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 이상과 같은 실험결과를 종합할 때 유황은 항균효과에 있어서는 유효한 수치를 나타내지 못하였으나 항염, 항산화작용에는 유효한 효과가 있었으며 이는 염증이 생긴 이후에 염증을 억제하는 효과가 있을 것으로 판단되며 여드름의 치료에 응용될 수 있을 것으로 생각된다.
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