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제안 방법
- 4 그 외 SREB2, solute carrier family 22, Potassium inwardly-rectifying channel등 부자류의효능 및 약리기전과 관계있을 것으로 생각되는 다양한 유전자들을 확인하였다’
- Sprague-Dawley계 흰쥐 간 조직을 적출하여 easy-Blue (iNtron, KOREA)를 사용하여 RNA를 분리하였다. 쥐에서 적출된 간 조직을 적출한 즉시 EP tube에 500M 부피만큼 넣고 easy-BLUE 1ml를 넣어 섞은 후 실온에 5분간 방치해 두었다가 chloroform을 200M 넣고 섞어주고 실온에 5분간 방치시킨 후 4°C, 12, 000rpm으로 15분간 원심분리한상층액 30(加1를 취한 후 동량의 isopropanol을 넣어 섞은 후 실온에서 10분간 방치 시킨 다음 4°C, IQOOOrpm으로 10분간 원심분리하여 얻어진 RNA에 75% DEPC ethanol 1ml 넣어 섞은 후 4°C, 9, 200rpm 으로 5분간 원심분리하여 씻은 다음 실온에서 10분간 ethanol 성분을 휘발시킨 후 DEPOSE 100 M 에 녹여 deep freezer에 보관하여 사용하였다.
- 합성한 cRNA를 air incubator에서 37°C 로 14시간 동안 배양시킨 다음 cRNA를 nuclease free water에 녹여 94°C에서 20분간 heating시킨다. cRNA 를 hydridi'zation 시키기 위하여 cRNA 를 shaker incubator에서 37 °C 로 18시간동안 배양시킨 후 hybridization solution를 넣어 5분간 90°C로 배양한 후 fluorophore를 넣어 codelink kit로 분석하였다.
- 간에서 추출한 RNA를 이용하여 디지털 지노믹스가에 의뢰하여 codelink rat 10k oligonucleotide microany로 유전자발현 양상을 측정하였다. Bacterial mRNA control 과 RNA sample 을 70 'C 에서 5분 동안 배양시킨 후 원심분리하여 5mM dNTP 와 RNase inhibitor, reverse transcriptase를 넣어 4 2°C에서 2시간동안 배양한다.
- 따라서 본 연구에서는 실험용 흰쥐를 이용하여 실제 임상에서 사용되는 용량으로 附子와 草島 龍 虎丸을 3일간 경구투여한 유전자발현 양상과 附子류의 독성성분인 aconitine을 3일간 피하주사하여 간에서의 유전자발현 양상을 Microairay 분석을 통하여 附子류 한약재, 처방과 aconitine의 유전자발현 양상을 비교하였다.
- 흡수되어 체내로 이행하게 된다. 본 연구에서는 부자(草烏)와 초오(草烏), 용호환(龍虎丸)을 실제 임상에서 사용되는 전탕법으로 추출하였다. 용호환(龍虎丸)은 실제 임상에서는 환(丸)으로 복용하지만 환(丸)제를 복용하면 인체에서는 액상의 형태로 흡수된다.
- 한약재의 각 투여용량은 문헌을 근거로 하여 한약재의 통상 투여용량인 60kg 성인 하루 투여 용량을 기준으로 환산하여 투여하였다. 부자와 초오는 4 g/kg /day, 용호환은 5 g/kg/day, aconitine은 200, 100, 50昭/kg/day로 1일 투여하였다7, 13)
- 사육은 온도 22°C+ 2°C, 습도는 50%土 10%의 동물사육실에서 흰쥐용 깔집을 깔고 사육하였으며, 2개군은 대조군, 6개군은 실험군으로 분류하여 사육하였다. 배합사료(삼양유지)와 음용수는 자유롭게 섭취할 수 있도록 충분히 공급하였으며, 사육 기간은 13일이었다.
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1) 동물실험
실험시작 전 10일 동안 실험실 환경에서 적응시킨 후 실험군과 대조군으로 나누어 물과 사료를'충분히 공급하면서 실험하였다. 약재 투여방법은 附子 전탕액과 草烏 전탕액, 龍虎丸 실험군은 경구투여를 하였고, aconitine 실험군은 복강내에 주사하였다.
- 공급하면서 실험하였다. 약재 투여방법은 附子 전탕액과 草烏 전탕액, 龍虎丸 실험군은 경구투여를 하였고, aconitine 실험군은 복강내에 주사하였다. 한약재의 각 투여용량은 문헌을 근거로 하여 한약재의 통상 투여용량인 60kg 성인 하루 투여 용량을 기준으로 환산하여 투여하였다.
- 유독성 한약재인 附子와 草烏의 추출물과 임상에서 사용되는 방제중에 龍虎丸을 실험용 흰쥐를 이용하여 간에서의 유전자발현을 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 약재 투여방법은 附子 전탕액과 草烏 전탕액, 龍虎丸 실험군은 경구투여를 하였고, aconitine 실험군은 복강내에 주사하였다. 한약재의 각 투여용량은 문헌을 근거로 하여 한약재의 통상 투여용량인 60kg 성인 하루 투여 용량을 기준으로 환산하여 투여하였다. 부자와 초오는 4 g/kg /day, 용호환은 5 g/kg/day, aconitine은 200, 100, 50昭/kg/day로 1일 투여하였다7, 13)
- 흰쥐 간에서 분리한 RNA를 이용하여 rRNA의 28S/18S의 integrity ratio가 조직에서 1.0 이상일 경우 실험에 사용할 수 있는데 모든 시료가 ratio 1.0 이 상을 만족하였으므로 후속실험 에 사용하였다. cRNA의 centered size가 草烏 전탕액 4g/kg/day 투여군, 龍虎丸 5g/kg/day 투여군, aconitine 100齒/kg /day과 50(ig/kg/day 투여군에서 1200으로 나타났으며, 附子 전탕액 4g/kg/day은 900으로 나타났다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 附子는 白附片으로 중국산을 사용하였으며, 草烏는 한국 경북에서 2004년의 자연채취 품을 2005년 1월 동서약업사(옴니허브에서 구입하여 외부형태를 확인한 후 사용하였으며, 실험에 사용된 약재는 원광대학교 약학대학 방제학교 실에 보관되어 있다.
- 실험에 사용된 실험동물은 생후 5주, 무게 200〜 220g의 Sprague-Dawley계 횐쥐 숫컷으로 (주)샘 타코 바이오 코리아에서 구입하여 실험시작 1주 전부터 적응시켰다. 사육은 온도 22°C+ 2°C, 습도는 50%土 10%의 동물사육실에서 흰쥐용 깔집을 깔고 사육하였으며, 2개군은 대조군, 6개군은 실험군으로 분류하여 사육하였다.
데이터처리
- 실험결과는 평균과 표준편차로 요약하였고, 통계 학적처리는 SPSS 10.0 program 으로 Student's t-test와 Mann-Whitney법을 이용하였으며, p-value 가 0.05 미만일 경우 유의한 것으로 해석하였다.
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