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문제 정의
- 하지만 아직까지 RABC 공정에서 악취가 적게 발생하는 기작에 대한 연구 결과는 보고된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 RABC 공정으로부터 암모니아성 악취의 제거능이 우수한 세균을 분리하고 이의 특성 및 제거능을 평가함으로써, 이 공정에서 암모니아성 악취가 저감되는 기작에 대하여 고찰하고자 한다.
제안 방법
- 0 프로그램을 사용하여 NeighborJoining method를 사용하여 계통수를 작성하였다.11) 이러한 결과로부터 분리된 암모니아 제거세균의 분류학적 위치를 추정하였다.
- 2 mM). 24시간 배양 후 배지 중에 있는 암모니아의 잔류 농도를 측정하였다. 최종 농도가 초기에 비해 50% 이상 감소한 시료에 접종한 세균을 암모니아 제거능이 뛰어난 세균으로 판단하였다.
- 세균으로부터 chromosomal DNA를 추출한 후, phenolchloroform 법으로 정제하였다.8) 정제된 DNA를 사용하여 세균의 16S rRNA 유전자의 특정 부위를 PCR로 증폭하였으며, 이때 primer는 27F와 1492R을 사용하였다.9) PCR 산물을 정제한 후, DNA 염기서열분석기(Megabase 1000, GE Healthcare)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.
- 8) 정제된 DNA를 사용하여 세균의 16S rRNA 유전자의 특정 부위를 PCR로 증폭하였으며, 이때 primer는 27F와 1492R을 사용하였다.9) PCR 산물을 정제한 후, DNA 염기서열분석기(Megabase 1000, GE Healthcare)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. 이러한 과정을 통하여 획득한 염기서열을 RDP II(ribosomal database project II)에 입력하여 기존에 알려진 염기서열과 비교 분석하였다.
- 고농도 식품폐수 처리시설로부터 분리한 암모니아 제거세균을 배양한 후 DNA를 추출하여 세균의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하였다. RDPII에 수록된 데이터베이스의 자료를 사용하여, 분석된 염기서열과 계통분류학적으로 가장 근접한 세균을 구하였다(Table 1, Fig. 2). 암모니아 제거능이 뛰어난 것으로 밝혀진 모든 세균은 V-proteobacteria에 속하는 것으로 밝혀졌다.
- 고농도 식품폐수 처리시설로부터 분리한 암모니아 제거세균을 배양한 후 DNA를 추출하여 세균의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하였다. RDPII에 수록된 데이터베이스의 자료를 사용하여, 분석된 염기서열과 계통분류학적으로 가장 근접한 세균을 구하였다(Table 1, Fig.
- 고농도 식품폐수의 처리 시설이 안정화된 후 채취한 활성슬러지로부터 암모니아 제거능이 뛰어난 세균을 분리하였다. 채취한 활성슬러지를 phosphate-buffered saline(PBS, pH 7.
- Bacillus sp.를 농화시킨 RABC 처리 공정을 사용하여 고농도 식품폐수를 처리할 때 악취가 적게 발생하는 기작을 밝히기 위하여, RABC 공정으로부터 암모니아성 악취의 제거능이 우수한 세균을 분리하고 이의 특성 및 제거능을 평가한 결과는 다음과 같다.
- 분리된 세균은 최소한천배지에서 한천을 제외한 액체 배지가 들어있는 serum vial에 접종하고 고무마개로 막은 후, 주사기를 사용하여 암모니아 수를 공급하였다(최종농도, 0.2 mM). 24시간 배양 후 배지 중에 있는 암모니아의 잔류 농도를 측정하였다.
-
4. 분리된 세균의 분류학적 특성 분석
분리된 세균의 16S ribosomal RNA(rRNA) 유전자의 염기서열을 분석하여 세균의 분리학적 위치를 추정하였다
. 세균으로부터 chromosomal DNA를 추출한 후, phenolchloroform 법으로 정제하였다. - 분리된 세균의 암모니아 제거능을 평가하기 위하여 세균을 배양한 후 암모니아를 주입한 후 시간에 따른 암모니아의 잔류량을 측정하였다. 암모니아의 농도를 1.
- 0 mM이 되도록 하였다. 세균이 아닌 다른 요인에 의한 암모니아 농도 변화 정도를 측정하기 위해 세균을 접종하지 않고 암모니아 만 주입한 시료를 준비하였다. 이렇게 제조된 시료들을 교반배양기(30℃, 150 rpm)에 넣고 배양하면서 일정시간 간격으로 시료를 채취하여 용액 중 암모니아의 농도변화를 측정하였다.
- 암모니아 제거능이 뛰어난 것으로 판단된 5종의 분리세균과 대조군으로 사용하기 위한 2 종의 세균에 대하여 암모니아 제거능을 평가하였다. 대조군으로 사용된 세균은 Bacillus megaterium M12와 Bacillus subtilis KCTC3135이었다.
- 9) PCR 산물을 정제한 후, DNA 염기서열분석기(Megabase 1000, GE Healthcare)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. 이러한 과정을 통하여 획득한 염기서열을 RDP II(ribosomal database project II)에 입력하여 기존에 알려진 염기서열과 비교 분석하였다.10) 분리된 세균과 유사성이 높은 것으로 나타난 세균의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 RDPII로부터 내려 받은 후, MEGA 4.
- 세균이 아닌 다른 요인에 의한 암모니아 농도 변화 정도를 측정하기 위해 세균을 접종하지 않고 암모니아 만 주입한 시료를 준비하였다. 이렇게 제조된 시료들을 교반배양기(30℃, 150 rpm)에 넣고 배양하면서 일정시간 간격으로 시료를 채취하여 용액 중 암모니아의 농도변화를 측정하였다. 암모니아의 제거 실험에 사용된 모든 시료는 각 조건별로 3개씩 준비하였으며, 결과는 각 시료에서 측정된 평균값으로 나타내었다.
- 5로 조절한 후 serum vial로 옮기고 고무마개로 막았다. 주사기로 암모니아수를 주입하여 암모니아의 최종농도가 0.16, 0.80, 1.6, 8.0 mM이 되도록 하였다. 세균이 아닌 다른 요인에 의한 암모니아 농도 변화 정도를 측정하기 위해 세균을 접종하지 않고 암모니아 만 주입한 시료를 준비하였다.
대상 데이터
- 대조군으로 사용된 세균은 Bacillus megaterium M12와 Bacillus subtilis KCTC3135이었다. Bacillus megaterium M12는 실험에 사용된 폐수처리 시설의 생물 반응조에서 분리된 것이며, Bacillus subtilis KCTC3135는 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에서 분양받은 것이다.
- 암모니아 제거능이 뛰어난 것으로 판단된 5종의 분리세균과 대조군으로 사용하기 위한 2 종의 세균에 대하여 암모니아 제거능을 평가하였다. 대조군으로 사용된 세균은 Bacillus megaterium M12와 Bacillus subtilis KCTC3135이었다. Bacillus megaterium M12는 실험에 사용된 폐수처리 시설의 생물 반응조에서 분리된 것이며, Bacillus subtilis KCTC3135는 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에서 분양받은 것이다.
- 암모니아 제거 세균의 분리에 사용된 활성슬러지는 고농도 식품폐수의 처리를 위해 고안된 RABC 공정의 pilot plant에서 채취하였다(Fig. 1). Pilot plant에 유입된 폐수는 햄 제조 공장에서 발생하는 폐수로 햄의 재료인 돼지의 도축과정에서 발생하는 부산물을 포함하고 있다.
데이터처리
- 이러한 과정을 통하여 획득한 염기서열을 RDP II(ribosomal database project II)에 입력하여 기존에 알려진 염기서열과 비교 분석하였다.10) 분리된 세균과 유사성이 높은 것으로 나타난 세균의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 RDPII로부터 내려 받은 후, MEGA 4.0 프로그램을 사용하여 NeighborJoining method를 사용하여 계통수를 작성하였다.11) 이러한 결과로부터 분리된 암모니아 제거세균의 분류학적 위치를 추정하였다.
이론/모형
- 분리된 세균의 16S ribosomal RNA(rRNA) 유전자의 염기서열을 분석하여 세균의 분리학적 위치를 추정하였다. 세균으로부터 chromosomal DNA를 추출한 후, phenolchloroform 법으로 정제하였다.8) 정제된 DNA를 사용하여 세균의 16S rRNA 유전자의 특정 부위를 PCR로 증폭하였으며, 이때 primer는 27F와 1492R을 사용하였다.
- 암모니아의 제거 실험에 사용된 모든 시료는 각 조건별로 3개씩 준비하였으며, 결과는 각 시료에서 측정된 평균값으로 나타내었다. 암모니아, 아질산염, 질산염의 농도는 Standard Methods에 따라 분석하였다.7)
성능/효과
- 1) 폐수 처리시설로부터 분리한 암모니아 제거 세균의 16S rRNA 유전자를 이용하여 계통분류학적 특성을 조사한 결과 제거능이 뛰어난 5종의 세균이 모두 -proteobacteria에 속하며, 각각 Citrobacter, Enterobacter, Buttiauxella, Shigella, Aeromonas 속에 속하는 세균과 분류학적으로 가장 근접하였다.
- 13) KCAD-4와 근접한 세균은 진딧물의 내장에서 발견된 Enterobacter asburiae JCM6051이었다.14) KCAD-9의 경우 축사 근처에서 분리된 세균인 Buttiauxella agrestis HS-39와 분류학적으로 유사한 것으로 나타났다.15) KCAD-12와 KCAD-13의 경우 배양된 세균 중에서는 각각 Shigella flexneri ATCC29903T, Aeromonas media ATCC33907T와 분류학적으로 가장 근접하였으나, 16,17) 배양되지 않은 세균으로는 각각 strain aab26f04(GenBank accession number, DQ819167; 유사도, 0.
- 14) KCAD-9의 경우 축사 근처에서 분리된 세균인 Buttiauxella agrestis HS-39와 분류학적으로 유사한 것으로 나타났다.15) KCAD-12와 KCAD-13의 경우 배양된 세균 중에서는 각각 Shigella flexneri ATCC29903T, Aeromonas media ATCC33907T와 분류학적으로 가장 근접하였으나, 16,17) 배양되지 않은 세균으로는 각각 strain aab26f04(GenBank accession number, DQ819167; 유사도, 0.989), aab60f12(GenBank accession number, DQ814163; 유사도, 0.981)와 매우 근접하였다.13)
- 16S rRNA 유전자의 염기서열을 기초로 분류학적 특징을 살펴본 결과 본 연구에서 분리된 세균은 도축 과정에서 발생한 부산물로부터 유래된 것으로 판단된다. 최근의 연구 결과에 따르면 본 연구에서 분리된 세균과 비슷한 특징을 나타내는 Vibrio alginolyticus를 접종하였을 때 이를 접종하지 않은 대조시료에 비하여 암모니아의 제거율이 13.
- 2) 분리된 세균과 분류학적으로 유사한 세균은 모두 동물의 내장에서 발견된 것으로, 폐수 처리시설에 유입된 돼지의 도축 부산물에서 유래한 것으로 판단된다.
- 2) RABC는 망상형 회전 접촉제에 Bacillus 종을 부착시켜 우점 배양시킨 후 유입수와 접촉시켜 유기물, 질소 및 인을 제거하고 다음 공정인 생물 반응조에서 미처리된 오염물질을 처리하는 방법이다.3) Bacillus가 우점화된 공정을 도축 폐수 또는 축산 폐수의 처리에 사용하였을 때 유기물과 질소, 인의 제거 효과가 우수한 것으로 보고되었다.4,5) 또한 이 공정에서 Bacillus를 첨가한 슬러지가 일반 활성슬러지 보다 침강성이 개선되었고, 수중의 대장균 제거 효율도 증가하는 것으로 보고되었다.
- 3) RABC 공정의 생물반응조의 용존산소 농도가 낮으며 암모니아 제거 과정에서 아질산염 또는 질산염의 농도가 변하지 않는 것으로 보아, 분리된 세균은 암모니아 동화과정을 통해 폐수 중 암모니아의 농도를 저감시키는 것으로 판단된다.
- 4) 분리된 세균의 암모니아 제거능을 측정한 결과, 도축 부산물로부터 유입되어 처리 시설에 정착한 장내세균이 RABC 폐수 처리 공정의 악취 제거에 중요한 기여를 하고 있는 것으로 보인다.
- 분리된 암모니아 세균의 16S rRNA 유전자 분석 결과에서 특이한 것은 이들이 모두 내장에서 발견된 세균과 분류학적으로 유사하다는 것이다. KCAD-3, 12, 13의 경우에는 zebrafish와 생쥐의 내장에서 발견된 aaa85g06(DQ816008), aab26f04(DQ819167), aab60f12(DQ814163)와 16S rRNA 유전자의 염기서열이 매우 근접하였으며, KCAD-4의 경우 진딧물의 내장에서 분리한 세균과 계통학적으로 매우 가깝게 나타났다. 또한 KCA-9의 경우에는 축사에서 분리된 세균과 분류학적으로 매우 가까운 것으로 나타났다.
- 이후 32시간 동안 암모니아의 농도를 측정하였을 때 더 이상의 제거가 일어나지 않았다. 가장 제거능이 높은 세균은 KCAD-3였으며, KCAD-13, KCAD-12, KCAD-9, KCAD-4의 순서로 암모니아의 제거 정도가 높은 것으로 나타났다. 대조군으로 사용한 Bacillus sp.
- 하지만 암모니아를 단일 질소원으로 공급한 배지에서 성장한 세균 중 Bacillus 속에 속하는 세균이 없고 대부분이 Enterobacteriaceae이었다. 또한 본 실험에서 분리된 세균의 암모니아 제거 능력이 매우 뛰어난 것으로 나타나, 본 폐수 처리 공정에서 이들 세균이 악취 제거에 중요한 역할을 하는 것으로 판단된다.
- 05). 배지 중 아질산염과 질산염의 농도를 측정하였을 때 시간 별로 거의 변화가 없었으며 암모니아에 비해 매우 낮은 농도로 측정되었다.
- 분리된 세균에 의한 암모니아 제거율을 평가하기 위하여 암모니아를 공급한 후 아질산염 및 질산염의 농도를 측정하였으나, 배양 중 암모니아의 농도는 급격히 감소하는 반면 아질산염과 질산염은 생성되지 않았다. 폐수 중 암모니아를 제거하는 4가지의 기작 중 질산화-탈질 및 ANAMMOX의 경우 중간 대사 산물로 질산염을 생성하며, 부분질산화탈질 과정에서도 아질산염이 생성된다.
- 2). 암모니아 제거능이 뛰어난 것으로 밝혀진 모든 세균은 V-proteobacteria에 속하는 것으로 밝혀졌다. 4종류는 family Enterobacteriaceae에 속하며, KCAD-13은 family Aeromonadaceae에 속하였다.
- 암모니아의 농도를 0.16 mM로 주입하였을 경우 8시간 경과하였을 때 암모니아의 94.1 ± 0.56%가 제거되었으며, 16시간 경과 후 95.6 ± 1.1%의 암모니아가 제거되었다(Fig. 3(a)).
- 분리된 세균의 암모니아 제거능을 평가하기 위하여 세균을 배양한 후 암모니아를 주입한 후 시간에 따른 암모니아의 잔류량을 측정하였다. 암모니아의 농도를 1.6 또는 8.0 mM로 주입하였을 경우 실험에 사용된 모든 세균에서 암모니아의 제거가 관찰되지 않았으며, 시간이 지남에 따라 세균이 사멸하는 것으로 나타났다. 이는 암모니아의 농도가 높을 경우 이의 독성에 의해 일어난 현상으로 판단된다.
- 24시간 배양 후 배지 중에 있는 암모니아의 잔류 농도를 측정하였다. 최종 농도가 초기에 비해 50% 이상 감소한 시료에 접종한 세균을 암모니아 제거능이 뛰어난 세균으로 판단하였다.
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