C형 간염바이러스(HCV) 유전체를 특이적으로 변형할 수 있는 Trans-Splicing Aptazyme 발굴 Development of Trans-Splicing Aptazyme Which Can Specifically Modify Hepatitis C Virus Genome원문보기
C형 간염바이러스(hepatitis C virus; HCV) 복제를 효과적이며 특이적으로 제어할 수 있는 유전산물을 개발하기 위하여 특정 리간드 존재에 의해 allosteric하게 그 활성이 조절될 수 있는 HCV 유전체 표적 trans-splicing 리보자임(trans-splicing aptazyme)을 발굴하였다. 이러한 trans-splicing aptazyme은 특정 리간드와 특이적으로 결합하는 RNA aptamer 부위, aptamer와 리간드와의 결합에 의해 리보자임 활성을 유도할 수 있도록 구조적 변이를 전달할 수 있는 communication module부위 및 HCV IRES의 +199 nt를 인지하는trans-splicing리보자임 등으로 구성되도록 설계하였다. 특히 trans-splicing 리보자임의 catalytic core의 P6과 P8 부위에 aptamer와 communication module을 삽입하였을 때 가장 allosteric하게 리보자임 활성이 유도되었다. 이러한 리보자임은 리간드가 없거나 대조 리간드가 존재할 때에는 trans-splicing 반응을 유도하지 못하였으나 특정 리간드가 존재할 때에만 효과적이며 특이적으로 trans-splicing 반응을 유도하여 표적 RNA를 변형시킬 수 있음을 관찰하였다. 이러한 aptazyme은 HCV 증식에 대해 특이적이며 효과적인 억제를 위한 선도물질로 이용 가능할 뿐 아니라 HCV 치료선도 물질의 스크리닝용 도구로서도 활용될 수 있을 것이다.
C형 간염바이러스(hepatitis C virus; HCV) 복제를 효과적이며 특이적으로 제어할 수 있는 유전산물을 개발하기 위하여 특정 리간드 존재에 의해 allosteric하게 그 활성이 조절될 수 있는 HCV 유전체 표적 trans-splicing 리보자임(trans-splicing aptazyme)을 발굴하였다. 이러한 trans-splicing aptazyme은 특정 리간드와 특이적으로 결합하는 RNA aptamer 부위, aptamer와 리간드와의 결합에 의해 리보자임 활성을 유도할 수 있도록 구조적 변이를 전달할 수 있는 communication module부위 및 HCV IRES의 +199 nt를 인지하는trans-splicing리보자임 등으로 구성되도록 설계하였다. 특히 trans-splicing 리보자임의 catalytic core의 P6과 P8 부위에 aptamer와 communication module을 삽입하였을 때 가장 allosteric하게 리보자임 활성이 유도되었다. 이러한 리보자임은 리간드가 없거나 대조 리간드가 존재할 때에는 trans-splicing 반응을 유도하지 못하였으나 특정 리간드가 존재할 때에만 효과적이며 특이적으로 trans-splicing 반응을 유도하여 표적 RNA를 변형시킬 수 있음을 관찰하였다. 이러한 aptazyme은 HCV 증식에 대해 특이적이며 효과적인 억제를 위한 선도물질로 이용 가능할 뿐 아니라 HCV 치료선도 물질의 스크리닝용 도구로서도 활용될 수 있을 것이다.
For the development of specific and effective basic genetic materials to inhibit replication of hepatitis C virus (HCV), HCV genome-targeting trans-splicing aptazyme, which activity is allosterically regulated by a specific ligand, was developed. The aptazyme was designed to be comprised of sequence...
For the development of specific and effective basic genetic materials to inhibit replication of hepatitis C virus (HCV), HCV genome-targeting trans-splicing aptazyme, which activity is allosterically regulated by a specific ligand, was developed. The aptazyme was designed to be comprised of sequence of RNA aptamer to the ligand, communication module sequence which can transfer structural transition for inducing ribozyme activity upon binding the ligand to the aptamer, and trans-splicing ribozyme targeting +199 nt of HCV IRES. Especially, when the aptamer and the communication module was inserted at both P6 and P8 catalytic domain of the specific ribozyme, allosteric activity of the aptazyme was the most induced. The aptazyme was shown to induce activity of trans-splicing reaction specifically and efficiently only in the presence of the specific ligand, but neither in the absence of any ligand nor in the presence of control ligand. This aptazyme can be used as a specific and effective genetic agent against HCV, and a tool for the isolation of anti-HCV lead compounds.
For the development of specific and effective basic genetic materials to inhibit replication of hepatitis C virus (HCV), HCV genome-targeting trans-splicing aptazyme, which activity is allosterically regulated by a specific ligand, was developed. The aptazyme was designed to be comprised of sequence of RNA aptamer to the ligand, communication module sequence which can transfer structural transition for inducing ribozyme activity upon binding the ligand to the aptamer, and trans-splicing ribozyme targeting +199 nt of HCV IRES. Especially, when the aptamer and the communication module was inserted at both P6 and P8 catalytic domain of the specific ribozyme, allosteric activity of the aptazyme was the most induced. The aptazyme was shown to induce activity of trans-splicing reaction specifically and efficiently only in the presence of the specific ligand, but neither in the absence of any ligand nor in the presence of control ligand. This aptazyme can be used as a specific and effective genetic agent against HCV, and a tool for the isolation of anti-HCV lead compounds.
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문제 정의
본 연구에서는 aptamer의 가역적인 표적 분자 인지를 통한 표적 분자의 활성 억제 능력을 frara-splicing 리보자임의 비가역적인 표적 RNA 치환 능력과 결합한 새로운 개념의 항 HCV 억제제를 개발하고자 하였다. 특히 fran.
개발하고자 하였다. 특히 fran.s-splicing 리보자임의 활성이 특정 리간드가 aptamer와 결합하여야지만 allosteric하게 유도될 수 있는 즉 리간드가 있는 경우에서만 치료용 유전자 활성을 유도할 수 있는 Jrans-splicing aptazyme을 개발하고자 하였다(Fig. 1). 이러한 새로운 개념의 aptazyme 분자를 개발하기 위해 리보자임의 어느 도메인에 aptamer를 삽입 할 때에 aptamer와 리간드 간의 결합에 의해 리보자임 활성을 유도할 수 있는지 탐색하였으며 그러한 변형된 도메인을 가진 aptazyme이 과연 리간드의 존재 시에만 rrane-splicing 활성을 유도하는지 검증하였다.
제안 방법
과.연 이러한 "splicing 산물이 정확한 mwsplicing 반응에 의해 생성된 산물인지 검증하기 위하여 획득한 trans-sphcing RT-PCR 산물의 염기서열을 결정하였다. 산물들 간의 염기 서열이 서로 다른지 알기 위하여 PCR 산물을 비로 qwig하지 않고 pUC19 vector에 cloning 한 후 clone 20개를 얻은 후 각 clone들의 염기서열을 결정하였다(Fig.
본 과제에서는 aptamer와 theophylline 결합에 의해 리보자임 활성을 induce 시키는데 관여하는 communication module (13)을 이용하였다, 세 번째 modulee HCV IRES 내에서 리보자임에 대한 가장 적합한 부위인 +199 부위를 인지하여 새로운 RNA로 치환할 수 있는 mms-splicing 리보자임 부위(21)이다. RNA aptamei와 communication module 구조를 fra/15-splicing 리보자임의 catalytic 기능을 위한 RNA folding에 주요한 역할(13)을 하는 P6 또는 P8 domain에, 또는 P6과 P8 domain 두 곳 모두에 동시에 부착시켰다. 결론적으로 wild-type 리보자임 (WT), WT의 P6, P8 또는 P6과 P8에 aptamer와 communication module sequence/} 부착된 리보자임(각각 WT-P6H, WT-P8H, WT-P6HP8H) 등 4가지 리보자임을 제작하였다(Fig.
0, 150 mM NaCl, 5mM MgCl2, 100 μM guanosine) 하에서 37℃ 3시간 반응 후 형성된 산물을 RT-PCR 반응을 통하여 분석하였다. Splicing 반응시에 물 또는 0.5 mM caffeine (theophylline 구조 유사체로서 allosteric 효과의 특이성에 대한 대조군), 또는 0.5 mM theophylline과 함께 반응시킴으로써 mms-splicing 반응이 theophylline 특이적으로 allosteric하게 유도되는지 관찰하였다. 이때 RT를 위한 primer는 luciferase 인지부위 (5'-CCCAAGCTTGCGCAACTGCAACTCCGA TAA)이며 PCR을 위한 51 primer는 기질 RNA의 5' end(5'-GGAATTCGCAGCGCTGCGTCCTGCT)를, 3' primer는 luciferase 를 인지하는 부위(*CCCAAGCTTTCACTGCAIACGA CGAIT) 를 이용하였다.
aptamoi.가 결합하는 theophylline과 함께, 또는 대조 리간드로서 caffeine과 함께 반응 후 rrane-splicing 산물 형성 여부를 관찰하였다. Caffeine의 구조는 theophylline] N-7 부위에 메틸기가 첨가된 물질로서 theophylline의 구조와 매우 유사하다.
반면 P6b stem-loop 구조는 다른 hairpin 구조로 치환하여도 효소 활성에는 변화가 없다고 알려져 있다. 따라서 P6b의 tetraloop receptor 부위 바로 아래에 존재하는 stem-loop 구조에 theophylline aptamei와 communication module sequence를 삽입한 리보자임(WT-P6H)을 제작하여 과연 theophylline0] 존재해야지만 allosteric하게 group I intron의 구조가 변형되어 fra/15-splicing 기능이 유도되는지 관찰하였다(Fig. 2B). 또한 역시 다른 stem-loop 구조로 치환하여도 효소 활성에 영향을 끼치지 않는 P8 부위에 theophylline aptamer와 communication module sequence를 삽입한 리보자임(WT-P8H)을 제작 후 allosteric 기능을 관찰하였으며 나아가 P6b와 P8 부위 모두를 aptamer와 communication module sequence로 치환한 리보자임 (WT-P6HP8H)도 제작하여 allosteric 기능을 관찰하였다.
2B). 또한 역시 다른 stem-loop 구조로 치환하여도 효소 활성에 영향을 끼치지 않는 P8 부위에 theophylline aptamer와 communication module sequence를 삽입한 리보자임(WT-P8H)을 제작 후 allosteric 기능을 관찰하였으며 나아가 P6b와 P8 부위 모두를 aptamer와 communication module sequence로 치환한 리보자임 (WT-P6HP8H)도 제작하여 allosteric 기능을 관찰하였다. 대조군으로는 wild type Tetrahymena group I intron의 P6 P8 도메인을 갖고 있는 mwsplicing 리보자임(WT)을 이용하였다(Fig.
luci)를 삽입한 aptazyme construct들을 제조하였다. 리보자임 제작을 위해 우선 WT 리보자임 벡터를 기질로 한 후 overlapping PCR 방법을 이용하여 각 aptazyme 벡터를 제작한 후 T7 RNA 중합효소(TaKaRa, Otsu, Japan)와 37℃에서 3시간 동안 반응하여 in vitro 상에서 전사반응을 수행하여 각 리보자임 RNA를 제조한 후 urea가 포함된 acrylamide gel로부터 정제하였다.
리보자임(50 nM)과 기질 RNA (10 nM)< splicing 조건(50 mM HEPES; pH 7.0, 150 mM NaCl, 5mM MgCl2, 100 μM guanosine) 하에서 37℃ 3시간 반응 후 형성된 산물을 RT-PCR 반응을 통하여 분석하였다. Splicing 반응시에 물 또는 0.
리보자임의 표적 RNA를 제작하기 위하여 HCV lb 타입의 IRES RNA의 +18 nucleotide (nt) 부위부터 +402 nt 부위까지 포함되어 있는 DNA [pH(18-402)CAT] 벡터를 HCV 유전체의 +402 부위를 인지하는 HI으로 절단하였다. 선향화한 DNA 벡터를 T7 RNA 중합효소(TaKaRa, Otsu, Japan)와 37。에서 3 시간 동안 반응하여 in vitro 상에서 전사반응을 수행하여 표적 RNA를 제조한 후 urea가 포함된 acrylamide gel로부터 정제하였다.
PCRe denaturation 96℃ 5분, annealing 60℃ 30초, extension 72℃ 30초로 22 cycle 동안 수행하였다. 반응이 끝난 RT-PCR 산물은 3% agarose gel 상에서 전기영동하여 분석하였다.
두 번째 modulee aptamer 의 ligand 결합에 의한 구조적 변이를 리보자임의 구조적 변이로전환시키는데 관여하는 communication module이다. 본 과제에서는 aptamer와 theophylline 결합에 의해 리보자임 활성을 induce 시키는데 관여하는 communication module (13)을 이용하였다, 세 번째 modulee HCV IRES 내에서 리보자임에 대한 가장 적합한 부위인 +199 부위를 인지하여 새로운 RNA로 치환할 수 있는 mms-splicing 리보자임 부위(21)이다. RNA aptamei와 communication module 구조를 fra/15-splicing 리보자임의 catalytic 기능을 위한 RNA folding에 주요한 역할(13)을 하는 P6 또는 P8 domain에, 또는 P6과 P8 domain 두 곳 모두에 동시에 부착시켰다.
이러한 새로운 개념의 aptazyme 분자를 개발하기 위해 리보자임의 어느 도메인에 aptamer를 삽입 할 때에 aptamer와 리간드 간의 결합에 의해 리보자임 활성을 유도할 수 있는지 탐색하였으며 그러한 변형된 도메인을 가진 aptazyme이 과연 리간드의 존재 시에만 rrane-splicing 활성을 유도하는지 검증하였다. 본 연구에선 모델 시스템으로 theophylline에 대한 특이적인 aptamer와 aptamer-리간드의 결합에 의해 allosteric하게 리보자임의 활성을증진시킬 수 있는 communication module 염기서열을 Tetrahymena group I intron의 여러 catalytic 도메인에 삽입한 후 그 활성을 탐색하였다.
연 이러한 "splicing 산물이 정확한 mwsplicing 반응에 의해 생성된 산물인지 검증하기 위하여 획득한 trans-sphcing RT-PCR 산물의 염기서열을 결정하였다. 산물들 간의 염기 서열이 서로 다른지 알기 위하여 PCR 산물을 비로 qwig하지 않고 pUC19 vector에 cloning 한 후 clone 20개를 얻은 후 각 clone들의 염기서열을 결정하였다(Fig. 4). 그림과 같이 msplicing 반응 산물을 sequencing 한 결과 모두 기질 RNA의 표적 부위 다음과 리보자임의 3* exon에 부착된 firefly luciferase RNA가 정확히 접합된 산물이었으며 이러한 결과는 trans-splicing aptazyme 의 반응이 매우 정확히 일어남을 시사한다.
5 mM theophylline과 함께 반응시킴으로써 mms-splicing 반응이 theophylline 특이적으로 allosteric하게 유도되는지 관찰하였다. 이때 RT를 위한 primer는 luciferase 인지부위 (5'-CCCAAGCTTGCGCAACTGCAACTCCGA TAA)이며 PCR을 위한 51 primer는 기질 RNA의 5' end(5'-GGAATTCGCAGCGCTGCGTCCTGCT)를, 3' primer는 luciferase 를 인지하는 부위(*CCCAAGCTTTCACTGCAIACGA CGAIT) 를 이용하였다. PCRe denaturation 96℃ 5분, annealing 60℃ 30초, extension 72℃ 30초로 22 cycle 동안 수행하였다.
1). 이러한 새로운 개념의 aptazyme 분자를 개발하기 위해 리보자임의 어느 도메인에 aptamer를 삽입 할 때에 aptamer와 리간드 간의 결합에 의해 리보자임 활성을 유도할 수 있는지 탐색하였으며 그러한 변형된 도메인을 가진 aptazyme이 과연 리간드의 존재 시에만 rrane-splicing 활성을 유도하는지 검증하였다. 본 연구에선 모델 시스템으로 theophylline에 대한 특이적인 aptamer와 aptamer-리간드의 결합에 의해 allosteric하게 리보자임의 활성을증진시킬 수 있는 communication module 염기서열을 Tetrahymena group I intron의 여러 catalytic 도메인에 삽입한 후 그 활성을 탐색하였다.
2B). 제작한 aptazyme들의 transsplicing 기능을 검증하기 위하여 리보자임의 3' exon에 firefly luciferase (F.luci)를 삽입한 aptazyme construct들을 제조하였다. 리보자임 제작을 위해 우선 WT 리보자임 벡터를 기질로 한 후 overlapping PCR 방법을 이용하여 각 aptazyme 벡터를 제작한 후 T7 RNA 중합효소(TaKaRa, Otsu, Japan)와 37℃에서 3시간 동안 반응하여 in vitro 상에서 전사반응을 수행하여 각 리보자임 RNA를 제조한 후 urea가 포함된 acrylamide gel로부터 정제하였다.
제작한 리보자임 RNA와 기질 RNA를 우선 95, C에서 1분 30 초 동안 변성시킨 후 37C에서 15분 동안 반응시켜 구조를 재형성시켰다. 리보자임(50 nM)과 기질 RNA (10 nM)< splicing 조건(50 mM HEPES; pH 7.
2 pmole M13 forward primer 등을 넣은 후, 96℃ 10초, 50℃ 5초, 60℃ 4초의 조건으로 25 cycle의 PCR을 수행하였다. 최종적으로 획득한 PCR 산물에 template suppression reagent를 넣어주고, 변성 과정을 거친 후 염기 서열 분석 기계 (ABI PRISM, Foster City, USA)를 이용하여 그 염기 서열을 결정하였다.
형질 전환된 군체 중 수십 개를 선택하여 DNA 정제를 수행하였으며, MRT을 사용하여 삽입되어 들어간 clone들을 탐색하였다. 탐색된 이one DNA에 5X sequencing buffer, terminator ready reaction, 3.2 pmole M13 forward primer 등을 넣은 후, 96℃ 10초, 50℃ 5초, 60℃ 4초의 조건으로 25 cycle의 PCR을 수행하였다. 최종적으로 획득한 PCR 산물에 template suppression reagent를 넣어주고, 변성 과정을 거친 후 염기 서열 분석 기계 (ABI PRISM, Foster City, USA)를 이용하여 그 염기 서열을 결정하였다.
Louis, USA) 항생제가 들어있는 agar plate에서 배양했다. 형질 전환된 군체 중 수십 개를 선택하여 DNA 정제를 수행하였으며, MRT을 사용하여 삽입되어 들어간 clone들을 탐색하였다. 탐색된 이one DNA에 5X sequencing buffer, terminator ready reaction, 3.
대상 데이터
또한 역시 다른 stem-loop 구조로 치환하여도 효소 활성에 영향을 끼치지 않는 P8 부위에 theophylline aptamer와 communication module sequence를 삽입한 리보자임(WT-P8H)을 제작 후 allosteric 기능을 관찰하였으며 나아가 P6b와 P8 부위 모두를 aptamer와 communication module sequence로 치환한 리보자임 (WT-P6HP8H)도 제작하여 allosteric 기능을 관찰하였다. 대조군으로는 wild type Tetrahymena group I intron의 P6 P8 도메인을 갖고 있는 mwsplicing 리보자임(WT)을 이용하였다(Fig. 2B).
본 과제에서 제조한 aptazymee 기본적으로 3가지 structural module로 구성되어 있다(Fig. 2A). 첫 번째 modulee theophylline 에 대한 RNA aptamer 부위이다(11).
성능/효과
RNA aptamei와 communication module 구조를 fra/15-splicing 리보자임의 catalytic 기능을 위한 RNA folding에 주요한 역할(13)을 하는 P6 또는 P8 domain에, 또는 P6과 P8 domain 두 곳 모두에 동시에 부착시켰다. 결론적으로 wild-type 리보자임 (WT), WT의 P6, P8 또는 P6과 P8에 aptamer와 communication module sequence/} 부착된 리보자임(각각 WT-P6H, WT-P8H, WT-P6HP8H) 등 4가지 리보자임을 제작하였다(Fig. 2B). 제작한 aptazyme들의 transsplicing 기능을 검증하기 위하여 리보자임의 3' exon에 firefly luciferase (F.
3A). 대조구로서 리보자임 없이 표적 RNA만 반응시에는 어떠한 산물도 형성되지 않았으며 비특이적인 RNA와 각각의 리보자임을 theophylline과 함께 반응 시에도 역시 어떠한 rrans-splicing 산물도 형성되지 않았다(Fig. 3B). 즉 생성된 Zrane-splicing 산물은 리보자임과 표적 RNA 간의 특이적인 반웅에 의한 결과물임을 알 수 있디WT-P6HP8H 리보자임에 의한 rra/15-splicing 반응은 caifeine이 있을 경우엔 아무런 리간드가 없는 경우와 같이 거의 형성되지 않으나 theophylline이 존재할 때에는 caffeine 존재할 때보다 30배 이상 rrae-splicing 반응이 더 잘 일어났다.
있다(3, 18). 본 연구를 통하여 Tetrahymena group I intron의 P6 및 P8 도메인 모두에 aptamei를 부착시에 특정 리간드의 aptamer와의 결합에 의해 리보자임 구조를 비활성화 상태에서 활성화 상태로 변이시킬 수 있는 allosteric 리보자임으로 변환될 수 있음을 알았다 이러한 결과는 RNA가 구조적으로 다이내믹한 특성을 함유함으로써 aptamer와 리보자임이라는 두 가지 다른 RNA 저해제들을 융합하여 새로운 구조적 특성 및 새로운 기능을 가진 유전 산물을 개발할 수 있음을 시사한다. 본연 구진은 이전 연구를 통하여 RNA aptamer0!] ligand가 결합 시에 aptam의 구조적 변이를 유발할 수 있음을 알았으며 그러한 결과는 곧 구조적 변이에 의해 그 활성이 조절되는 aptazyme을개발할 수 있는 이론적 근거가 될 수 있다(10).
상기 결과로부터 theophylline aptmer가 P6과 P8 domain 모두에 부착된 group I 리보자임은 theophylline 의존적으로 transsplicing 활성이 allosteric하게 유도될 수 있음을 알았다. 과.
따라서 group I intron의 P6과 P8 domain 모두에 theophylline aptamei와 communication module 서열을 삽입 했을 때에는 보통 상태에서는 비활성화 상태로 존재하다 theophylline 을 처리한 경우에만 allosteric하게 그리고 효과적으로 transsplicing 반응이 유발되어 기질 RNA를 변형 시킬 수 있었다. 이 결과는 P6과 P8 domain 모두가 alloeiic하게 리보자임 활성을 조절할 수 있는 주요 domain임을 시사한다.
3B). 즉 생성된 Zrane-splicing 산물은 리보자임과 표적 RNA 간의 특이적인 반웅에 의한 결과물임을 알 수 있디WT-P6HP8H 리보자임에 의한 rra/15-splicing 반응은 caifeine이 있을 경우엔 아무런 리간드가 없는 경우와 같이 거의 형성되지 않으나 theophylline이 존재할 때에는 caffeine 존재할 때보다 30배 이상 rrae-splicing 반응이 더 잘 일어났다. 더구나 WT-P6HP8H 리보자임에 의한 theophylline 의존성 Zrazis-splicing 반응은 WT 리보자임에 의한 rra/15-splicing 반응과 유사하도록 효과적으로 일어났다(Fig.
후속연구
본연 구진은 이전 연구를 통하여 RNA aptamer0!] ligand가 결합 시에 aptam의 구조적 변이를 유발할 수 있음을 알았으며 그러한 결과는 곧 구조적 변이에 의해 그 활성이 조절되는 aptazyme을개발할 수 있는 이론적 근거가 될 수 있다(10). 특히 본 연구를 통하여 발견한 giwp I intim의 allosteric donwn?l P6과 P8 부위에 다른 리간드에 대한 aptamer와 communication module의 삽입, 즉 modular engineering을 통하여 다양한 리간드에 대한 aUosteric mns-splicing 리보자임 개발이 가능할 것으로 예상된다.
이러한 리보자임은 HCV RNA 레벨을 감소시킴과 동시에 HCV RNA가 존재하는 곳에서만 치료 유전자 활성을 유도할 수 있으므로 HCV 복제를 보다더 효과적으로 제어할 수 있을 것이다. 그러나 보다 더 안전하고 효과적인 유전자 치료제로서 traav-splicing 리보자임이 활용되기 위해선 보다 더 특이적으로 그리고 보다 더 높은 활성을 가지고 HCV 감염된 세포에서만 치료용 유전자 활성을 유도할 수 있는 새롭게 개선된 리보자임 시스템이 필요하다.
하여도 비가역적으로 리보자임이 표적 RNA를 제거함으로써 항 HCV 기능이 증가되고 동시에 바이러스 감염세포를 제거할 수 있는 항바이러스 유전자 산물의 유도를 꾀할 수 있는 등 보다 특이성과 효능이 개선된 항 HCV 제제 개발이 가능할 것이다. 나아가 trans-splicing aptazyme의 리간드 의존성 활성 유도 성질을 이용, HCV 조절 인자에 특이적으로 결합할 수 있는 small drug 또는 단백질-단백질 상호반응을 할 수 있는 HCV 조절 인자 결합 단백질 등을 고속 그리고 대량으로 스크리닝할 수 있는 시스템으로도 활용이 가능할 것이다.
그러나 각각의 단일 방법만을 이용하여 HCV 복제를 억제하기 위해선 아직 그 특이성 및 안전성과 효능에 한계가 있다. 따라서 보다 특이적이며 효과적으로 HCV 증식을 억제하기 위해선 HCV가 감염된 세포에서만 효과적으로 HCV 복제만을 제어할 수 있는 새로운 유전산물의 개발이 필요하다.
기반 리보자임을 개발하였다(21). 이러한 리보자임은 HCV RNA 레벨을 감소시킴과 동시에 HCV RNA가 존재하는 곳에서만 치료 유전자 활성을 유도할 수 있으므로 HCV 복제를 보다더 효과적으로 제어할 수 있을 것이다. 그러나 보다 더 안전하고 효과적인 유전자 치료제로서 traav-splicing 리보자임이 활용되기 위해선 보다 더 특이적으로 그리고 보다 더 높은 활성을 가지고 HCV 감염된 세포에서만 치료용 유전자 활성을 유도할 수 있는 새롭게 개선된 리보자임 시스템이 필요하다.
또한 HCV 조절 인자 의존적으로 리보자임의 활성을 조절함으로써 off-target과 같은 비특이적인리보자임 활성을 억제할 수 있을 것이며 리보자임의 catalytic 기능에 의해서 aptamer가 가역적으로 리간드와 반응한다. 하여도 비가역적으로 리보자임이 표적 RNA를 제거함으로써 항 HCV 기능이 증가되고 동시에 바이러스 감염세포를 제거할 수 있는 항바이러스 유전자 산물의 유도를 꾀할 수 있는 등 보다 특이성과 효능이 개선된 항 HCV 제제 개발이 가능할 것이다. 나아가 trans-splicing aptazyme의 리간드 의존성 활성 유도 성질을 이용, HCV 조절 인자에 특이적으로 결합할 수 있는 small drug 또는 단백질-단백질 상호반응을 할 수 있는 HCV 조절 인자 결합 단백질 등을 고속 그리고 대량으로 스크리닝할 수 있는 시스템으로도 활용이 가능할 것이다.
향 후 HCV 복제의 주요 조절 단백질에 대한 aptamer (10)와 communication module을 allosteric 도메인에 부착하여 HCV 조절 단백질이 존재해야만 trans-splicing 리보자임의 RNA 치환 활성이 allosteric하게 유도될 수 있는 mms-splicing aptazyme을 개발한다면 aptamer에 의해 HCV 조절 단백질을 sequest할 뿐만 아니라 HCV 조절 인자가 발현되어 작동하는 부위로 리보자임의 localization을 집중함으로써 리보자임의 표적 RNA (HCV 유전체) 에 대한 접근성을 증가, 리보자임의 세포 내 활성을 보다 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다. 또한 HCV 조절 인자 의존적으로 리보자임의 활성을 조절함으로써 off-target과 같은 비특이적인리보자임 활성을 억제할 수 있을 것이며 리보자임의 catalytic 기능에 의해서 aptamer가 가역적으로 리간드와 반응한다.
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