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문제 정의
- 본 연구에서는 실용적인 일회용 파라세타몰 센서의 대량생산에 활용될 수 있는 스크린프린트법에 의한 바이오센서용 전극 제작법과 센서의 감응도와 선택성을 증폭시킬 수 있는 광폴리머 하이드로젤을 이용한 전극 표면위로의 다중효소 고정화법을 활용한 바이오센서를 제작하였다. 제작한 바이오센서를 이용하여 실제 혈액시료에 첨가된 파라세타몰을 분석하였으며, 표준분석법과 결과를 비교하여 현장적응성을 검토하였다.
- 본 연구에서는 다중효소가 고정화된 일회용 전기화학적 파라세타몰 바이오센서를 개발하였다. 센서의 전극을 제작하기위하여 막프린트법을 이용하였으며 광폴리머 하이드로젤을 사용하여 3가지 종류의 다른 효소를 간단하면서도 효과적인 방법으로 전극 표면 위에 고정화 시켰으며 고정화된 효소들의 다단계의 유기적인 효소반응을 통하여 낮은 전위에서 전기화학적으로 직접 검출이 어려운 파라세타몰의 검출을 구현하였다.
제안 방법
- 본 연구에서는 실용적인 일회용 파라세타몰 센서의 대량생산에 활용될 수 있는 스크린프린트법에 의한 바이오센서용 전극 제작법과 센서의 감응도와 선택성을 증폭시킬 수 있는 광폴리머 하이드로젤을 이용한 전극 표면위로의 다중효소 고정화법을 활용한 바이오센서를 제작하였다. 제작한 바이오센서를 이용하여 실제 혈액시료에 첨가된 파라세타몰을 분석하였으며, 표준분석법과 결과를 비교하여 현장적응성을 검토하였다.
- . 효소 horseradish perocidase(HRP, Aldrich Co.)가 고정화 된 전극(HRP-SPCE)은 본 논문의 저자가 발표한 논문[20]에서와 같은 방법으로 카본 잉크(Gwent Co.)와 HRP를 조합하여 제조된 HRP-카본 잉크를 SPCE의 작업 전극 위에 직접 프린팅 하여 제작하였다. 파라세타몰의 검출을 위한 다중효소 바이오센서는 제작된 HRP-SPCE와 추가로 사용된 두 종의 효소, tyrosinase (Ty.
- )와 HRP를 조합하여 제조된 HRP-카본 잉크를 SPCE의 작업 전극 위에 직접 프린팅 하여 제작하였다. 파라세타몰의 검출을 위한 다중효소 바이오센서는 제작된 HRP-SPCE와 추가로 사용된 두 종의 효소, tyrosinase (Ty. Aldrich Co.)와 aryl acylamidase (AAA, Aldrich Co.)를 광폴리머 하이드로젤인 poly(vinyl alcohol) bearing stryrylpyridinium groups (PVA-sbQ)를 사용하여 작업 전극(HRP-SPCE) 표면위에 drop-coating하여 제작하였다(PVA-SbQ/Ty./AAA)-HRP-SPCE). PVE-SbQ(Ty.
- 폴리머 하이드로젤막 제작을 위하여 준비된 Ty./AAA 용액 400μl와 같은 양의 PVA-SbQ prepolymer[20]를 잘 섞은 후 2.5 μl의 효소/폴리머 혼합물을 HRP-SPCE의 작업 전극 위에 drop-coating 한 후 long wave UV (365 nm, 주사거리: 10cm)를 2시간 쪼여주어 polymer hydrogel 막을 전극표면에 형성시킨 후, 약 5 ℃에서 12시간 동안 건조시켜 센서를 제작하였다.
- )를 통하여 측정된다. 이와 더불어 본 연구에서 개발된 센서시스템은 센서감도를 증폭시키기 위하여 추가의 효소, HRP를 catechol의 산화를 촉진하였다. 전기화학적으로 생성된 hydrogen peroxide(H2O2)에 의해 산화된 HRP는 양성자주개 역할을 할 수 있는 catechol과 같은 페놀류의 화합물을 효소반응의 치환체(substance) 로 사용하여 원래의 환원된 형태로 변환된다.
- 제작된 파라세타몰 센서의 특성 분석과 최적화를 위하여, 0.0 mM 부터 5.0 mM까지 농도 범위의 파라세타몰 측정용액을 phosphate 완충용액(PBS, 50mM, pH 7.4)을 사용하여 제조하였다. PVA-SbQ 하이드로젤 고분자 막에 고정된 두 효소(Ty.
- 4)을 사용하여 제조하였다. PVA-SbQ 하이드로젤 고분자 막에 고정된 두 효소(Ty. 와 AAA)의 효소작용의 검증을 위하여 세 종류의 다른 센서를 제조하였다. 첫째로 HRP-SPCE 표면 위에 효소를 첨가하지 않은 PVA-SbQ만을 코팅시킨 센서(PVA-SbQ-HRP-SPCE), 둘째로, PVA-SbQ 하이드로젤과 tyrosinase만을 사용하여 만든 센서(PVA-SbQ(Ty.
- 와 AAA)의 효소작용의 검증을 위하여 세 종류의 다른 센서를 제조하였다. 첫째로 HRP-SPCE 표면 위에 효소를 첨가하지 않은 PVA-SbQ만을 코팅시킨 센서(PVA-SbQ-HRP-SPCE), 둘째로, PVA-SbQ 하이드로젤과 tyrosinase만을 사용하여 만든 센서(PVA-SbQ(Ty.)-HRP-SPCE) 및 마지막으로 3가지의 모든 효소를 사용한 센서(PVA-SbQ(Ty./AAA)-HRP-SPCE)를 각각 제조하였다. 준비된 파라세타몰 표준용액을 이용하여 각 센서 특성을 측정한 결과를 그림 2에 나타내었다.
- 01 mML-1 감응도(resolution)를 가져야 함을 알 수 있다. 이에 대한 검증을 위하여 의약용 파라세타몰을 실제 혈액(whole blood)시료에 가하여 측정용액을 제조한 다음, 다중효소 바이오센서(PVA-SbQ(Ty./AAA)-HRP-SPCE)를 이용하여 혈액 중 파라세타몰 농도에 대한 감응 특성을 측정하였으며 그 결과를 그림 3에 나타냈다.
- 본 연구에서 개발된 센서의 의료용 진단법으로의 검증을 위하여 현재 병원에서 사용되는 상업용 파라세타몰 Assay Kit과의 간단한 휘귀분석(regression anaysis)을 수행하였다. 사용된 Assay Kit는 영국 CLS사에서 제공 받은 Paracetamol Assay Kit, 모델 PA-22를 사용하였으며 UV-광분석법을 이용해야하는 Assay Kit의 특성상 파라세타몰 측정용액은 혈장을 용질로 사용하여 제조하였다.
- 그림 4에 나타난 바와 같이 상업용 파라세타몰 Assay Kit과 다중효소 바이오센서의 분석 결과 사이에는 우수한 선형 상관관계가 있음을 확인하였으며 바이오센서시스템이 의료용 파라세타몰 분석법으로서 활용될 수 있는 높은 가능성을 확인 하였다. 또한 본 센서시스템은 혈액과 같은 생체 시료(pH 7.4)에서 낮은 전극전위인 -50 mV(vs. Ag/AgCI)를 사용함으로써, H2O2에만을 사용하는 다른 시스템에 비교하여 혈액 내에 방해물질로 작용하는 화합물로부터 발생하는 방해 작용을 제거하였다.
- 본 연구에서는 다중효소가 고정화된 일회용 전기화학적 파라세타몰 바이오센서를 개발하였다. 센서의 전극을 제작하기위하여 막프린트법을 이용하였으며 광폴리머 하이드로젤을 사용하여 3가지 종류의 다른 효소를 간단하면서도 효과적인 방법으로 전극 표면 위에 고정화 시켰으며 고정화된 효소들의 다단계의 유기적인 효소반응을 통하여 낮은 전위에서 전기화학적으로 직접 검출이 어려운 파라세타몰의 검출을 구현하였다. 또한 본 센서시스템은 혈액과 같은 생채 시료(pH 7.
- 센서의 전극을 제작하기위하여 막프린트법을 이용하였으며 광폴리머 하이드로젤을 사용하여 3가지 종류의 다른 효소를 간단하면서도 효과적인 방법으로 전극 표면 위에 고정화 시켰으며 고정화된 효소들의 다단계의 유기적인 효소반응을 통하여 낮은 전위에서 전기화학적으로 직접 검출이 어려운 파라세타몰의 검출을 구현하였다. 또한 본 센서시스템은 혈액과 같은 생채 시료(pH 7.4)를 전처리 과정 없이 사용할 수 있어 빠른 검출시간과 저가의 검출법으로 활용될 수 있으며 상업용 파라세타몰 Assay Kit과의 비교 실험을 통하여 point-of-care 의료 진단용 검출법으로서의 가능성을 확인 하였다.
대상 데이터
- /AAA)-HRP-SPCE). PVE-SbQ(Ty./AAA) 폴리머 막 코팅을 위하여 tyrosinase(8934 Umg-1) 10mg을 1ml의 phosphate 완충 용액(50 mM, pH 6.5)에 녹인 후 영국 Cambridge Life Sciences 사에서 제공받은 AAA 용액(Paracetamol Assay Kit, 모델 PA-22) 1ml와 혼합 하였다. 폴리머 하이드로젤막 제작을 위하여 준비된 Ty.
- 본 연구에서 개발된 센서의 의료용 진단법으로의 검증을 위하여 현재 병원에서 사용되는 상업용 파라세타몰 Assay Kit과의 간단한 휘귀분석(regression anaysis)을 수행하였다. 사용된 Assay Kit는 영국 CLS사에서 제공 받은 Paracetamol Assay Kit, 모델 PA-22를 사용하였으며 UV-광분석법을 이용해야하는 Assay Kit의 특성상 파라세타몰 측정용액은 혈장을 용질로 사용하여 제조하였다. Assay Kit에 의하여 파라세타몰의 검정곡선을 구축하여 얻은 결과를 다중센서 바이오센서의 전기화학적인 검출 결과와 비교하여 그림 4에 회기 분석곡선을 나타내었다.
이론/모형
- 본 연구에서 개발된 전기화학적 다중효소 바이오센서는 막프린트법을 이용하여 미리 제작된 일회용 탄소전극(screen-printed carbon electrode, SPCE)을 기본으로 하여 제작되었다[19]. 효소 horseradish perocidase(HRP, Aldrich Co.
성능/효과
- 이와 같은 HRP의 효소반응을 통하여 catechol의 산화반응을 촉진 시킬 수 있으며[20] 이 과정에서 전극으로의 증폭된 전류의 검출이 가능해진다(그림 1). 이에 본 연구에서 고안된 다중효소 센서는 지금까지 보고된 페놀류 검출을 위한 바이오센서 중 HRP를 사용한 센서시스템에서 널리 사용되는 용액내로 추가 공급된 H2O2 없이 catechol의 산화를 촉진시킬 수 있어 보다 단순화 된 측정방법을 사용하며, 아울러 측정감도를 증가시키는 특성을 나타내었다[20].
- 준비된 파라세타몰 표준용액을 이용하여 각 센서 특성을 측정한 결과를 그림 2에 나타내었다. 파라세타몰 표준용액에서 센서를 구동한 결과 모든 농도의 측정용액에서 센서전극에 전위(- 50 mV vs. Ag/AgCI)를 걸어준 후 7-12분 이내에 전류/시간 곡선이 안정한 상태(steady state)를 나타냈으며, 그림 2에서 나타낸 바와 같이 3가지 효소를 모두 사용한 센서가 다른 센서들에 비해 상대적으로 우수함을 확인 하였다. 측정 용액의 파라세타몰의 농도 범위가 0.
- Ag/AgCI)를 걸어준 후 7-12분 이내에 전류/시간 곡선이 안정한 상태(steady state)를 나타냈으며, 그림 2에서 나타낸 바와 같이 3가지 효소를 모두 사용한 센서가 다른 센서들에 비해 상대적으로 우수함을 확인 하였다. 측정 용액의 파라세타몰의 농도 범위가 0.0 mM에서 3.0 mM 사이일 경우 센서의 감도는 우선, PVA-SbQ-HRP-SPCE만 사용한 경우 0.18 nAμM-1cm-2로 확인되어 가장 낮은 값을 나타냈으나 PVA-SbQ(Ty.)-HRP-SPCE를 사용한 경우 1.06 nAμM-1cm-2로 센서의 감도가 더욱 높아짐을 확인했다. 또한 이결과를 통하여 PVA-SbQ(Ty.
- 06 nAμM-1cm-2로 센서의 감도가 더욱 높아짐을 확인했다. 또한 이결과를 통하여 PVA-SbQ(Ty./AAA)-HRP-SPCE인 경우 다른 센서에 비하여 좀 더 넓은 선형직선범위(dynamic linear range)를 갖으며, HRP만을 사용한 센서에 비해 8배이상 높은 감도를 나타냈으며 PVA-SbQ(Ty.)-HRP-SPCE와도 비교하여도 37% 이상 센서의 감도가 향상되었다. HRP만을 사용할 경우 소량의 파라세타몰이 o-quinone으로 산화되고 동시에 용액중에 존재하는 과산화수소의 환원이 일어나 매우 작은 전류가 흐르게 되며, Ty.
- 98 mM) 이상일 경우에는 별도의 치료가 필요한 위험한 상태라고 알려져 있다. 즉, 본 연구에서 개발된 파라세타몰 센서가 의료 진단용으로 사용되기 위해서는 0.0 mM-2.5 mM 농도 범위의 파라세타몰 검출이 용이해야하며 0.1mM 이하의 검출 한계와 0.01 mML-1 감응도(resolution)를 가져야 함을 알 수 있다. 이에 대한 검증을 위하여 의약용 파라세타몰을 실제 혈액(whole blood)시료에 가하여 측정용액을 제조한 다음, 다중효소 바이오센서(PVA-SbQ(Ty.
- 실제 혈액시료내의 파라세타몰 검출은 완충용액에서의 결과에 비해 센서의 감도가 50% 이상 저하됨을 확인하였으며 각 조건에서의 다중 효소센서의 검출결과를 표 1에 요약하였다. 표 1에 나타낸 것과 같이 개발된 센서는 센서의 성능이 완충용액에서 보다 감소했음에도 불구하고 의료용 검출법으로서의 요구되는 성능 조건에 만족함을 알 수 있었다. 이와 더불어 혈액에서의 파라세타몰의 검증 가능성은 현재 널리 사용되고 있는 UV를 이용한 분광분석법에 비하여 큰 장점을 나타낸다.
- 이와 더불어 혈액에서의 파라세타몰의 검증 가능성은 현재 널리 사용되고 있는 UV를 이용한 분광분석법에 비하여 큰 장점을 나타낸다. 대부분의 광분석법의 경우 혈액을 원심 분리하여 얻어지는 혈장내의 파라세타몰 검출만이 가능하지만 본 연구에서 개발된 다중효소 바이오센서 시스템인 경우 광분석법에서 필요한 원심분리 과정을 생략할 수 있기 때문에 보다 단순하고 빠른 검출법으로 사용될 수 있음을 확인 하였다.
- Assay Kit에 의하여 파라세타몰의 검정곡선을 구축하여 얻은 결과를 다중센서 바이오센서의 전기화학적인 검출 결과와 비교하여 그림 4에 회기 분석곡선을 나타내었다. 그림 4에 나타난 바와 같이 상업용 파라세타몰 Assay Kit과 다중효소 바이오센서의 분석 결과 사이에는 우수한 선형 상관관계가 있음을 확인하였으며 바이오센서시스템이 의료용 파라세타몰 분석법으로서 활용될 수 있는 높은 가능성을 확인 하였다. 또한 본 센서시스템은 혈액과 같은 생체 시료(pH 7.
후속연구
- 이와 같은 이유로 광분석법에 의한 휴대용 또는 가정용으로 사용할 수 있는 소형의 분석 시스템 개발에는 한계가 있다. 즉, 가정에서의 손쉬운 자가진단용이나 빠른 초기진단을 위한 현장분석(point-of-care, POTC) 용 분석법으로의 활용에 있어서 제한점을 나타낸다.
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