[논문]전기화학적 방법을 이용한 다중 효소 전극 제작 및 글루코스 검출 특성에 관한 연구

한경호; 신인성; 윤도영

doi:10.5229/jkes.2020.23.3.66

전기화학적 방법을 이용한 다중 효소 전극 제작 및 글루코스 검출 특성에 관한 연구
A Study on the Detection Characteristics in Glucose and Fabrication of Bi-Enzyme Electrode using Electrochemical Method 원문보기

전기화학회지 = Journal of the Korean Electrochemical Society, v.23 no.3, 2020년, pp.66 - 72

한경호 (광운대학교 공과대학 화학공학과) , 신인성 (지앤지인텍 중앙연구개발센터) , 윤도영 (광운대학교 공과대학 화학공학과)

초록
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본 연구에서는 글루코스 검출을 위한 HRP (horseradish peroxidase)와 GOD (glucose oxidase)를 혼합한 형태의 다중 효소 반응 바이오센서 개발연구를 수행하였다. 바이오센서는 제작 시간 단축을 위하여 전기전착법을 이용하여 제작하였으며, 경제적인 센서 제작을 위하여 SPE (screen printed electrode)를 사용하였다. 다중 효소 바이오센서의 효과를 확인하기 위하여 단일 효소 바이오센서를 제작하여 비교 및 분석하였다. 센서의 특성을 평가하기 위해서 주사전자현미경(scanning electron microscopy, SEM), 순환전위법(cyclic voltammetry, CV), 전기화학적 임피던스 분광법(electrochemical impedance spectroscopy, EIS), 시간대전류법(chronoamperometry, CA), 흐름 주입분석법(flow injection analysis, FIA)를 수행하였다. SEM, CV, EIS의 분석결과로부터 효소가 전극 표면에 고정화가 잘 된 것을 확인하였고, CA로부터 제작된 다중 효소 바이오센서가 단일 효소 바이오센서에 비해 신호성능이 200% 향상된 것을 확인하였다. 이로부터 HRP와 GOD가 서로 촉매적으로 반응한다는 것을 설명할 수 있었다. 또한, FIA의 결과에서 동일한 농도의 글루코스 용액을 4회 나누어 주입하였을 때, 전류신호량이 일정함을 확인하였고, 농도에 따른 전류신호량을 분석하여 신호민감성, 재현성, 안정성 등이 우수함을 설명할 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, the development of biosensors capable of bi-enzyme reactions by including Horseradish peroxidase and glucose oxidase was carried out for detection of glucose. The sensors were manufactured using electro deposition method to reduce production time, and screen printed electrodes (SPE) were used to produce economical sensors. To check the bienzyme effect, the sensor was compared and analyzed with single enzyme biosensor. The characteristics of the sensor were evaluated using scanning electron microscopy(SEM), cyclic voltammetry(CV), electrochemical impedance spectroscopy(EIS), chronoamperometry(CA), and flow injection analysis(FIA). Analysis results from SEM, CV and EIS confirmed that the enzymes are well fixed to the electrode surface. In addition, it was confirmed that bi-enzyme biosensors manufactured from the CA method improved signal performance by 200% compared to single enzyme biosensors. From this results, we were able to explain that HRP and GOD react catalyzed to each other. And the results of FIA showed that the intensity of each current signal was constant when the same concentration of glucose was injected four times. In addition, by analyzing the intensity of current signals for glucose concentrations, the biosensors manufactured in this study showed excellent trends in signal sensitivity, reproducibility and stability.

주제어

표/그림 (8)

그림 Fig. 1. Electrodeposition mechanism of : (a) step 1; (b) step 2.
그림 Fig. 2. SEM images of SPE
그림 Fig. 3. Cyclic voltammetry graph of the modified electrode in electrodeposition
그림 Fig. 4. (a) Nyquist plot of the modified electrode in electrodeposition; (b) equivalent circuit of the impedance spectroscopy
그림 Fig. 6. Current response by the glucose reaction of enzyme sensor
그림 Fig. 5. Cyclic voltammetry graph of the modified electrode in PBS buffer
그림 Fig. 7. FIA Current response by 1 M glucose injection
그림 Fig. 8. FIA Current response by glucose concentration

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 GOD, HRP 효소간의 촉매적 역할을 이용한 bi-enzyme 센서를 개발하여 그 특성을 전기화학적, 분광학적 방법으로 확인하였다. 전극 개질 방법으로는 전기전착법과 drop-coating 두 가지 방법으로 개질하여 비교 분석하였다.
그러나 작업전극이 탄소 성분으로 구성되어 전극저항이 매우 큰 편이며, 전기화학 반응 속도가 다소 낮다는 단점이 있다. 이에 미세 전류 신호를 감지하기 위한 센서로서 사용하기에는 어려움이 있으므로 전기전착법을 이용하여 전극을 개질 하여 전기화학적 성능을 향상시키고자 하였다.

제안 방법

5와 같다. 0 V에서 0.6 V의 전압 범위에서 0.1 M, pH 6.8의 인산완충생리식염수(phosphate buffer saline, PBS)를 전해질로 하여 실험을 진행하였으며, 주사속도를 100 mV/s로 고정하였다. Fig.
4는 각 전극의 표면 저항을 측정하기 위한 나이퀴스트(nyquist) 선도(a)와 이에 대한 등가회로(b)이다. 0.1 M 염화칼륨(KCl)과 5 mM 페리시안화칼륨(K₃[Fe(CN₆)])이 혼합된 용액을 전해질로 사용하여 실험을 진행하였으며, 주파수는 10 Hz ~ 100 kHz, 작동 전위는 0.1 V, 진폭은 10 mV로 설정하여 임피던스 측정을 수행하였다. 선도에서 나타난 반원의 지름으로 전자 전달 저항인 R_ct를 평가할 수 있다.
SPE 전극 표면에 키토산, 금나노입자, GOD, HRP 등이 제대로 전착되었는지 확인하기 위해 SEM 분석을 수행하였다. Fig.
글루코스 탐지를 위한 작동 전압을 결정하기 위하여 CV측정을 수행하였으며, 그 결과는 Fig. 5와 같다. 0 V에서 0.
이에 본 연구에서는 HRP 효소와 GOD 효소가 혼합된 형태의 bi-enzyme 센서를 drop-coating 방법과 전기전착법으로 제조하여 GOD의 글루코스분해 반응과 이 때 발생하는 과산화수소의 HRP 효소에 의한 분해 반응을 전기화학적 방법으로 분석하는 실험을 수행하였다. 또한, 순환전위법(cyclic voltammetry, CV), 전기화학적 임피던스 분광법(electrochemical impedance spectroscopy, EIS), 시간대전류법(chronoamperometry, CA), 흐름 주입 분석법(flow injection analysis, FIA)을 통하여 제조된 센서의 성능을 평가하였다.
본 실험에서는 GOD, HRP 두 가지 효소를 키토산 용액과 AuNP를 이용하여 전기전착법으로 전극 표면에 고정하였다. 효소 용액은 앞서 제조된 키토산 용액 2.
이와 같은 실험 방법을 통해 신호 재현성을 확인함에 따라 본 연구에서 제작된 bi-enzyme 센서의 안정성을 입증하였다. 본 연구는 enzyme센서 제작에 있어서 기존의 단일 효소 반응이 아닌 이중효소의 복합적인 반응을 이용함으로서 각 효소가 서로 효과적으로 반응함을 확인하였고, 기존의 제작 방식인 drop-coating이 아닌 전기전착방법을 사용함으로서 더욱 효과적인 방법론을 제시하였다. 이러한 결과는 전기화학반응계의 구성 및 바이오센서 개발, 분석 연구에 있어서 도움이 될 것으로 기대된다.
이러한 bi-enzyme 센서는 각 효소가 서로에게 촉매적으로 반응하여 그 성능을 향상시키며, HRP 효소를 통한 과산화수소 제거로 인하여 GOD 효소의 활성 저하를 막는 장점을 가지고 있다^13-16). 이에 본 연구에서는 HRP 효소와 GOD 효소가 혼합된 형태의 bi-enzyme 센서를 drop-coating 방법과 전기전착법으로 제조하여 GOD의 글루코스분해 반응과 이 때 발생하는 과산화수소의 HRP 효소에 의한 분해 반응을 전기화학적 방법으로 분석하는 실험을 수행하였다. 또한, 순환전위법(cyclic voltammetry, CV), 전기화학적 임피던스 분광법(electrochemical impedance spectroscopy, EIS), 시간대전류법(chronoamperometry, CA), 흐름 주입 분석법(flow injection analysis, FIA)을 통하여 제조된 센서의 성능을 평가하였다.
본 연구에서는 GOD, HRP 효소간의 촉매적 역할을 이용한 bi-enzyme 센서를 개발하여 그 특성을 전기화학적, 분광학적 방법으로 확인하였다. 전극 개질 방법으로는 전기전착법과 drop-coating 두 가지 방법으로 개질하여 비교 분석하였다. 전위주사법과 임피던스 분광법을 통하여 전극 표면에 AuNP, 키토산, 효소가 고정화되었을 때의 표면 저항을 확인하고 불균일 반응속도상수를 구하여 전극 표면이 실험에서 의도한 바대로 개질되었음을 확인하였으며, 고정화된 효소의 신호 민감성 평가를 위하여 CA를 수행하였고, 분석물질인 글루코스의 농도에 따라 전류신호가 선형적으로 증가하는 것을 확인하였다.
전극 표면의 전기화학적 특성을 평가하기 위해 CV 및 EIS 분석을 수행하였다. Fig.
시스템 구성은 연동펌프로는 Cole-Parmer instrument사의 제품을 사용하였으며 control valve는 Diba industries사의 PEEK distribution and loop injection valve를 사용하였다. 전류 신호 응답을 위하여 CA를 실시하였으며, 작동 전압은 0.5 V, flow rate는 2 mL/min, 전해질은 0.1 M, pH 6.8의PBS를 사용하였다.
제조된 enzyme 센서의 글루코스 농도에 따른 전류 응답 및 bi-enzyme 센서의 특성을 평가하기 위하여 CA 분석을 실시하였다. 작동 전위는 0.

대상 데이터

3은 SPE, Chitosan/AuNP/SPE, 그리고 GOD/HRP/Chitosan/AuNP/SPE 작업전극을 이용하여 전기화학적 특성을 평가한 CV 결과이다. 0.1 M 염화칼륨(KCl)과 5 mM 페리시안화칼륨(K₃[Fe(CN₆)])이 혼합된 용액을 전해질로 사용하여 실험을 진행하였으며, 주사속도(scan rate)는 100 mV/s로 고정하였다. CV 분석 결과는 SPE 전극의 환원peak전압(E_{pc_SPE})은 0.
Horseradish peroxidase (type I, 59 units/mg), glucose oxidase (type X-S, 138.8 units/mg), D-glucose, chitosan, potassium ferricyanide (<10 μm, 99%), potassium chloride는 Sigma-Aldrich에서 구매하였으며, hydrogen tetrachloroaurate (III) hydrate는 Kojima에서 구매하여 사용하였다.
8 units/mg), D-glucose, chitosan, potassium ferricyanide (<10 μm, 99%), potassium chloride는 Sigma-Aldrich에서 구매하였으며, hydrogen tetrachloroaurate (III) hydrate는 Kojima에서 구매하여 사용하였다. 또한, SPE는 Pine research instrument 사의 제품을 사용하였다.
FIA 방법은 전기화학cell 내부에 일정한 흐름을 계속 주어 전극 표면에 반응하는 전류 신호 응답을 확인하는 방법으로서 유량 조절이 편리하고, 분석 물질의 농도 변화가 편리하며, 센서로서의 민감성, 안정성, 재현성을 모두 확인할 수 있다는 장점이 있다. 시스템 구성은 연동펌프로는 Cole-Parmer instrument사의 제품을 사용하였으며 control valve는 Diba industries사의 PEEK distribution and loop injection valve를 사용하였다. 전류 신호 응답을 위하여 CA를 실시하였으며, 작동 전압은 0.
본 실험에서는 GOD, HRP 두 가지 효소를 키토산 용액과 AuNP를 이용하여 전기전착법으로 전극 표면에 고정하였다. 효소 용액은 앞서 제조된 키토산 용액 2.5 mL와 AuNP용액 2.5 mL에 5 mg의 GOD와 5 mg의 HRP를 혼합하여 제조하였다. Bi-enzyme 전극은 다음과 같이 2 step으로 제조하였고 해당 step에서의 전착 원리를 Fig.

이론/모형

이를 통해 single enzyme sensor보다 bi-enzyme 센서가 신호민감성이 뛰어남을 확인하였으며, 특히 HRP를 전기전착법으로 고정화 하고, GOD를 drop-coating 방법으로 고정화 하였을 때 신호민감성이 약 400% 증가하는 것을 확인하였다. 또한 전기전착법으로 제작된 bi-enzyme 센서의 안정성을 확인하기 위하여 FIA 방법을 수행하였다. 2 mL/min의 유량에서 4회 연속 전류 peak가 같음을 확인하였고, 글루코스의 농도를 조절하였을 때 전류 peak가 선형적으로 증가하는 것을 확인하였다.
본 연구에서는 enzyme 센서의 안정성 평가를 위해 FIA 방법을 도입하였다. FIA 방법은 전기화학cell 내부에 일정한 흐름을 계속 주어 전극 표면에 반응하는 전류 신호 응답을 확인하는 방법으로서 유량 조절이 편리하고, 분석 물질의 농도 변화가 편리하며, 센서로서의 민감성, 안정성, 재현성을 모두 확인할 수 있다는 장점이 있다.

성능/효과

또한 전기전착법으로 제작된 bi-enzyme 센서의 안정성을 확인하기 위하여 FIA 방법을 수행하였다. 2 mL/min의 유량에서 4회 연속 전류 peak가 같음을 확인하였고, 글루코스의 농도를 조절하였을 때 전류 peak가 선형적으로 증가하는 것을 확인하였다. 이와 같은 실험 방법을 통해 신호 재현성을 확인함에 따라 본 연구에서 제작된 bi-enzyme 센서의 안정성을 입증하였다.
1 M 염화칼륨(KCl)과 5 mM 페리시안화칼륨(K₃[Fe(CN₆)])이 혼합된 용액을 전해질로 사용하여 실험을 진행하였으며, 주사속도(scan rate)는 100 mV/s로 고정하였다. CV 분석 결과는 SPE 전극의 환원peak전압(E_{pc_SPE})은 0.0772 V, 산화peak전압(E_{pa_SPE})은 0.1668 V로 나타났다. 이에 따른 산화·환원peak전압차(ΔE)는 0.
SPE 전극의 R_ct는 250 Ω으로 측정되었다. Chitosn/AuNP/SPE 전극의 R_ct는 325 Ω으로 SPE 전극보다 다소 증가하였으며, GOD, HRP를 전극 표면에 고정화 하였을 때 측정된R_ct 값은 475 Ω으로 크게 증가함을 확인할 수 있다.
이는 bi-enzyme 센서에서 각 효소가 서로 촉매적으로 반응하고 GOD의 활성 저하를 막는다는 이론에 잘 부합함을 보여준다^13-16). Drop-coating 방법(D)으로 제작한 bi-enzyme 센서보다 전기전착법(E)으로 제작한 bi-enzyme 센서가 전류응답이 더 큼을 확인할 수 있으며, 이는 전기전착법이 기존의 바이오센서 제작 방식인 drop-coating 방법을 대체할 수 있음을 알 수 있다.
GOD, HRP 효소 모두 전기전착법을 이용하여 전극표면에 고정화하였을 때 ΔE는 더욱 증가하며, peak 전류 값 또한 감소함을 확인하였다.
2(c)에 비해 좀 더 표면이 거칠어지고 큰 입자를 형성하며 전착되었음을 알 수 있다. SEM 분석결과로부터 전기전착법이 키토산, AuNP, GOD, HRP를 전극에 고정시킬 때 충분히 효과적인 방법임을 확인하였다.
6은 글루코스 농도 변화에 따른 전형적인 전류-시간 그래프를 나타낸다. 교반되고 있는 PBS 용액에 글루코스 용액을 주입하였을 때, 산화 전류는 가파르게 증가하며 약 200초 이내에 안정적인 전류를 형성함을 확인하였다. 본 연구에서 제안된 바이오센서는 0.
1 M까지 변화를 주어 글루코스 용액을 2 mL씩 주입하였을 때, 전류 peak가 농도에 따라 선형적으로 증가함을 확인하였다. 따라서 본 연구에서 제작한 bi-enzyme 센서가 민감성, 안정성, 재현성 모두 만족스러운 결과를 보인 것을 확인하였다.
이에 본 연구에서 제작한 bi-enzyme 센서가 신호 재현성 및 안정성을 갖는 것을 확인할 수 있다. 또한, Fig. 8과 같이 글루코스의 농도를 0.3 M에서 0.1 M까지 변화를 주어 글루코스 용액을 2 mL씩 주입하였을 때, 전류 peak가 농도에 따라 선형적으로 증가함을 확인하였다. 따라서 본 연구에서 제작한 bi-enzyme 센서가 민감성, 안정성, 재현성 모두 만족스러운 결과를 보인 것을 확인하였다.
이러한 글루코스검출에 대한 높은 민감성은 키토산과 AuNP가 bi-enzyme 효소반응과정에 효과적인 물질임을 나타낸다. 또한, GOD만 고정하였을 때보다 GOD와 HRP를 함께 고정하였을 때 전류응답이 더 큼을 확인할 수 있다. 이는 bi-enzyme 센서에서 각 효소가 서로 촉매적으로 반응하고 GOD의 활성 저하를 막는다는 이론에 잘 부합함을 보여준다^13-16).
교반되고 있는 PBS 용액에 글루코스 용액을 주입하였을 때, 산화 전류는 가파르게 증가하며 약 200초 이내에 안정적인 전류를 형성함을 확인하였다. 본 연구에서 제안된 바이오센서는 0.005 mM에서 0.08 mM까지 글루코스의 농도에 대하여 선형적인 반응을 나타낸다. 이러한 글루코스검출에 대한 높은 민감성은 키토산과 AuNP가 bi-enzyme 효소반응과정에 효과적인 물질임을 나타낸다.
전위주사법과 임피던스 분광법을 통하여 전극 표면에 AuNP, 키토산, 효소가 고정화되었을 때의 표면 저항을 확인하고 불균일 반응속도상수를 구하여 전극 표면이 실험에서 의도한 바대로 개질되었음을 확인하였으며, 고정화된 효소의 신호 민감성 평가를 위하여 CA를 수행하였고, 분석물질인 글루코스의 농도에 따라 전류신호가 선형적으로 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 single enzyme sensor보다 bi-enzyme 센서가 신호민감성이 뛰어남을 확인하였으며, 특히 HRP를 전기전착법으로 고정화 하고, GOD를 drop-coating 방법으로 고정화 하였을 때 신호민감성이 약 400% 증가하는 것을 확인하였다. 또한 전기전착법으로 제작된 bi-enzyme 센서의 안정성을 확인하기 위하여 FIA 방법을 수행하였다.
7과 같은 농도에서 전류 peak가 4회 연속 일정함을 나타내었다. 이에 본 연구에서 제작한 bi-enzyme 센서가 신호 재현성 및 안정성을 갖는 것을 확인할 수 있다. 또한, Fig.
이에 비해 Chitosan/AuNP/SPE 전극의 Epc_SPE는 0.05677 V, Epa_SPE는 0.1778 V로 나타났으며, 이에 따른 ΔE는 0.12103 V로 peak 전위의 차가 SPE 전극에 비해 증가하였으며, peak 전류 값은 감소하였음을 확인하였다.
2 mL/min의 유량에서 4회 연속 전류 peak가 같음을 확인하였고, 글루코스의 농도를 조절하였을 때 전류 peak가 선형적으로 증가하는 것을 확인하였다. 이와 같은 실험 방법을 통해 신호 재현성을 확인함에 따라 본 연구에서 제작된 bi-enzyme 센서의 안정성을 입증하였다. 본 연구는 enzyme센서 제작에 있어서 기존의 단일 효소 반응이 아닌 이중효소의 복합적인 반응을 이용함으로서 각 효소가 서로 효과적으로 반응함을 확인하였고, 기존의 제작 방식인 drop-coating이 아닌 전기전착방법을 사용함으로서 더욱 효과적인 방법론을 제시하였다.
전기전착법으로 제작한 bi-enzyme 센서를 1M의 글루코스를 분석물질로 4회 연속 측정한 결과는 Fig. 7과 같은 농도에서 전류 peak가 4회 연속 일정함을 나타내었다. 이에 본 연구에서 제작한 bi-enzyme 센서가 신호 재현성 및 안정성을 갖는 것을 확인할 수 있다.
전극 개질 방법으로는 전기전착법과 drop-coating 두 가지 방법으로 개질하여 비교 분석하였다. 전위주사법과 임피던스 분광법을 통하여 전극 표면에 AuNP, 키토산, 효소가 고정화되었을 때의 표면 저항을 확인하고 불균일 반응속도상수를 구하여 전극 표면이 실험에서 의도한 바대로 개질되었음을 확인하였으며, 고정화된 효소의 신호 민감성 평가를 위하여 CA를 수행하였고, 분석물질인 글루코스의 농도에 따라 전류신호가 선형적으로 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 single enzyme sensor보다 bi-enzyme 센서가 신호민감성이 뛰어남을 확인하였으며, 특히 HRP를 전기전착법으로 고정화 하고, GOD를 drop-coating 방법으로 고정화 하였을 때 신호민감성이 약 400% 증가하는 것을 확인하였다.

후속연구

본 연구는 enzyme센서 제작에 있어서 기존의 단일 효소 반응이 아닌 이중효소의 복합적인 반응을 이용함으로서 각 효소가 서로 효과적으로 반응함을 확인하였고, 기존의 제작 방식인 drop-coating이 아닌 전기전착방법을 사용함으로서 더욱 효과적인 방법론을 제시하였다. 이러한 결과는 전기화학반응계의 구성 및 바이오센서 개발, 분석 연구에 있어서 도움이 될 것으로 기대된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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