Objective This study was undertaken to determine the effect of Whallak-tang on expression of CD/cytokine Genes. Methods The expression of CD/Cytokine Genes were examined by cDNA microarray using the human mast cell line(HMC-1). Results The expression of ATP5F1, FLJ20671, unknown, KIAA0342, OAS2, unk...
Objective This study was undertaken to determine the effect of Whallak-tang on expression of CD/cytokine Genes. Methods The expression of CD/Cytokine Genes were examined by cDNA microarray using the human mast cell line(HMC-1). Results The expression of ATP5F1, FLJ20671, unknown, KIAA0342, OAS2, unknown genes were increased in $200{\sim}300%$ range. The expression of unknown, MDS006, IFITM1, MRPL3, ZNF207, FTH1, FBP1, NRGN, NR1H2, KIAA0747 genes were decreased in $0{\sim}33%$ range. Conclusion These results would provide important basic data on the possibility of the clinical treatment of Whallak-tang in musculoskeletal disease.
Objective This study was undertaken to determine the effect of Whallak-tang on expression of CD/cytokine Genes. Methods The expression of CD/Cytokine Genes were examined by cDNA microarray using the human mast cell line(HMC-1). Results The expression of ATP5F1, FLJ20671, unknown, KIAA0342, OAS2, unknown genes were increased in $200{\sim}300%$ range. The expression of unknown, MDS006, IFITM1, MRPL3, ZNF207, FTH1, FBP1, NRGN, NR1H2, KIAA0747 genes were decreased in $0{\sim}33%$ range. Conclusion These results would provide important basic data on the possibility of the clinical treatment of Whallak-tang in musculoskeletal disease.
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문제 정의
본 실험에서 活絡湯이 비만세포주에서 ferritin heavy chain 1(``FTH1)의 발현을 저하시켰는데 항산화의 기능이 있는 유전자를 억제한다는 점에서 특이한 결과라고 하겠다. 따라서 活絡湯의 항산화효과는 FTH1를 통하지 않고 다른 유전자를 매개로 이루어지는 것으로 생각되며 추후 심도있는 연구가 필요하다고 하겠다.
본 실험에서 活絡湯이 비만세포주에서 FBP1의 발현을 저하시켰는데 FBP의 결핍이 저혈당을 유발한다는 점에서 특이한 결과라고 하겠다. 즉 임상에서 活絡湯이 저혈당과는 관계없다는 점에서 FBP1 유전자의 발현이 감소된 것에 대해서는 추후 심도있는 연구가 필요하다고 하겠다.
본 실험에서 活絡湯이 비만세포주에서 IFN-IP의 하나인 IFITM1의 발현을 저하시켰는데 신경보호의 기능이 있는 유전자를 억제한다는 점에서 특이한 결과라고 하겠다. 따라서 IFN-IP가 뇌 뿐만 아니라 척수 또는 말초신경세포의 퇴행성 변화도 억제하는지는 추후 심도있는 연구가 필요하다고 하겠다.
본 실험에서 活絡湯이 비만세포주에서 MRPL3의 발현을 저하시켰는데 이는 活絡湯이 일부 암의 억제제로서의 가능성을 시사한다고 하겠다. 그러나 Ou 등은 MRPL3의 과발현이 매우 빨리 분화하는 세포의 특징이지만 종양형성을 직접적으로 의미하는 것은 아니라고 하였으므로27) 추후 심도있는 연구가 필요하다고 하겠다.
이에 活絡湯의 작용기전을 보다 깊이 이해하기 위해 活絡湯이 인간 비만세포의 유전자 발현에 미치는 영향을 microarray를 통해 관찰함으로써 약간의 지견을 얻었기에 보고하는 바이다.
이에 저자는 以上과 같은 이론적 근거를 토대로 活血, 通經活絡, 止痛 등의 효능이 있는 活絡湯이 유전자 발현에 미치는 영향을 파악하고자 본 실험을 시행하였다.
제안 방법
실험군에는 1 mg/ml로 活絡湯을 처치하고, 대조군에는 동량의 vehicle을 처치하였다. 24시간이 지난 후 각각 RNA를 추출하여 Fluorescence probe 합성 과정을 밟았다.
실험에 사용한 HMC-1은 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin이 포함된 IMDM 용액에 배양하였다. 5% CO2, 95% 공기, 37℃ 온도가 유지되는 세포 배양기에서 배양하고, 배양액은 주 3회, 2~3일마다 교환하였다.
Cy3(GHeNe laser)는 543 nm에서, Cy5(RHeNe laser)는 632 nm을 사용하였다. ImaGene과 ScanAlyze를 이용하여 각각의 spot에 대한 data를 저장한 후 median값을 사용하여 각 spot의 pixel intensity 에서 local background intensity를 감하고 microarray 상의 house-keeping gene의 intensity 값을 이용하여 녹색과 적색 파장에서의 두 형광영상을 normalization한 후 처치군과 대조군 사이에서 각 microarray상의 각 gene의 발현정도에 대한` ratio를 얻었다. 처치군과 대조군에서의 신호강도 차이가 3배 이상 차이나는 것을 유의한 것으로 보았다.
본 실험에서 사용된 活絡湯은 정확한 출전은 보이지 않으며 동의대학교 부속한방병원 처방집1)을 기준으로 한 것으로써 木瓜, 白屈菜가 君藥, 玄胡, 羌活이 臣藥, 威靈仙, 獨活, 當歸, 乾地黃, 赤芍藥이 佐藥, 蒼朮, 陳皮, 乳香, 沒藥, 紅花, 砂仁, 甘草, 生薑, 大棗가 使藥으로 구성된 처방이다.(Table1)
실험군에는 1 mg/ml로 活絡湯을 처치하고, 대조군에는 동량의 vehicle을 처치하였다. 24시간이 지난 후 각각 RNA를 추출하여 Fluorescence probe 합성 과정을 밟았다.
총 RNA 100 ug(total)인 22 ul을 500 ug/ml의 oligo dT 2 ul과 혼합하여 70℃에서 10분간 반응시킨 후 얼음에 방치하였다. 이 반응액에 5X reaction buffer 10 ul, 10X dNTP(즉 5 mM d(ACG)TP와 2 mM TTP) 5 ul, fluore-scent nucleotide(대조군은 1 mM Cy3-dUTP, 실험군은 1 mM Cy5-dUTP) 2 ul, 1.5 ul RNAsin, 2.5 ul의 superscript II reverse transcriptase(200U/ul) 등을 첨가하여 37℃에서 2시간 반응시켰다. 이후 이 반응액에 3 N NaOH 6 ul을 첨가하고 65℃에서 30분간 반응시켜 RNA를 제거하고, 다시 1 M TrisHCl(pH 7.
대상 데이터
microarray chip(Crea Hi380-DC101)은 CreaGene Co.(한국)제품을 사용하였다. Confocal laser-scanning microscope Scan Array 5000은 Affimetrix(USA)를 사용하였다.
5000)으로 scan하여 영상을 얻었다. Cy3(GHeNe laser)는 543 nm에서, Cy5(RHeNe laser)는 632 nm을 사용하였다. ImaGene과 ScanAlyze를 이용하여 각각의 spot에 대한 data를 저장한 후 median값을 사용하여 각 spot의 pixel intensity 에서 local background intensity를 감하고 microarray 상의 house-keeping gene의 intensity 값을 이용하여 녹색과 적색 파장에서의 두 형광영상을 normalization한 후 처치군과 대조군 사이에서 각 microarray상의 각 gene의 발현정도에 대한` ratio를 얻었다.
배양액 Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM), fetal bovine serum(FBS), Human Cot-1 DNA, Ribonuclease Inhibitor, Superscript Ⅱ reverse transcriptase, 100 u/ml penicillin and 100 ug/ml streptomycin 등은 GibcoBRL(USA)에서, poly(dA), oligo(dT), dNTP 등은 Pharmacia, Cy3- dU TP, Cy5-dUTP 등은 Amersham제품을 사용하였다. Hybridization cassette 는 Telechem에서 구입하였다. 일반 시약은 Sigma제품을 사용하였다.
Yellow dots represent genes that show no change in expression. The hybridized microarray was scanned with the confocal laser scanner Scan Array 5000 (General Scanning) at 543 nm (red Cy3, GHeNe laser) and 632 nm (Cy5, RHeNe laser). Two independent experiments were performed.
藥材는 東義大學校 附屬韓方病院 藥劑課에서 구입한 것을 정선하여 사용하였으며, 處方은 1)에 기재된 것으로 處方內容과 1첩 분량은 Table 1과 같다.
배양액 Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM), fetal bovine serum(FBS), Human Cot-1 DNA, Ribonuclease Inhibitor, Superscript Ⅱ reverse transcriptase, 100 u/ml penicillin and 100 ug/ml streptomycin 등은 GibcoBRL(USA)에서, poly(dA), oligo(dT), dNTP 등은 Pharmacia, Cy3- dU TP, Cy5-dUTP 등은 Amersham제품을 사용하였다.
본 실험에는 사람 비만세포주(HMC-l)를 이용하였다. HMC-l(human mast cell line)은 leukemia 환자로부터 유래되었으며15), c-kit 수용체를 발현하고 IgE에 대한 FcεRI가 결핍된 세포로, 주로 염증과 알러지 실험에 유용한 세포주이다.
실험에 사용한 HMC-1은 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin이 포함된 IMDM 용액에 배양하였다. 5% CO2, 95% 공기, 37℃ 온도가 유지되는 세포 배양기에서 배양하고, 배양액은 주 3회, 2~3일마다 교환하였다.
성능/효과
1. CD/cytokine 유전자 活絡湯 처치군과 대조군 사이의 유전자 발현강도가 3배 이상 차이나는 것을 유의한 것으로 판단한 결과 活絡湯 처치시 유의하게 발현이 증가하는 유전자는 관찰되지 않았다. 다만, 200~300% 범위로 발현이 항진되는 유전자로는 순서대로 ATP5F1, FLJ20671, unknown, KIAA0342, OAS2, unknown 등이 있었다.
2. 대조군에 비해 0~33%의 범위로 발현이 저하된 유전자는 순서대로 unknown, MDS006, IFITM1, MRPL3, ZNF207, FTH1, FBP1, NRGN, NR1H2, KIAA0747 등이 있었다.
대조군에 비하여 발현 강도가 3배 이상 차이나는 것을 유의한 것으로 했을 때 비만세포에 活絡湯 처치시 대조군에 비해 유의하게 발현이 항진되는 CD/cytokine 유전자는 관찰되지 않았다. 다만, 200~300% 범위로 발현이 항진되는 유전자로는 순서대로 ATP5F1, FLJ20671, unknown, KIAA0342, OAS2, unknown 등이 있었다 (Table2).
발현강도가 3배 이상 차이나는 것을 유의한 것으로 했을 때 비만세포에 活絡湯 처치시 대조군에 비해 유의하게 발현이 저하되는 CD/cytokine 유전자는 대조군에 비해 0~33%의 발현을 보인 유전자로 순서대로 unknown, MDS006, IFITM1, MRPL3, ZNF207, FTH1, FBP1, NRGN, NR1H2, KIAA0747 등이 있었다 (Table3).
발현강도가 3배 이상 차이나는 것을 유의한 것으로 했을 때 비만세포에 活絡湯 처치시 대조군에 비해 유의하게 발현이 저하되는 CD/cytokine 유전자는 대조군에 비해 0~33%의 발현을 보인 유전자로 순서대로 unknown, MDS006, IFITM1, MRPL3, ZNF207, FTH1, FBP1, NRGN, NR1H2, KIAA0747 등이 있었다 (Table3).
유전자 발현에 있어 대조군에 비하여 발현 강도가 3배 이상 차이나는 것을 유의한 것으로 했을 때 비만세포에 活絡湯 처치시 대조군에 비해 유의하게 발현이 항진되는 CD/cytokine 유전자는 관찰되지 않았다. 다만, 200~300% 범위로 발현이 항진되는 유전자로는 순서대로 ATP5F1, FLJ20671, unknown, KIAA0342, OAS2, unknown 등이 있었다(Table 2).
후속연구
본 실험에서 活絡湯이 비만세포주에서 MRPL3의 발현을 저하시켰는데 이는 活絡湯이 일부 암의 억제제로서의 가능성을 시사한다고 하겠다. 그러나 Ou 등은 MRPL3의 과발현이 매우 빨리 분화하는 세포의 특징이지만 종양형성을 직접적으로 의미하는 것은 아니라고 하였으므로27) 추후 심도있는 연구가 필요하다고 하겠다.
본 실험에서 活絡湯이 비만세포주에서 IFN-IP의 하나인 IFITM1의 발현을 저하시켰는데 신경보호의 기능이 있는 유전자를 억제한다는 점에서 특이한 결과라고 하겠다. 따라서 IFN-IP가 뇌 뿐만 아니라 척수 또는 말초신경세포의 퇴행성 변화도 억제하는지는 추후 심도있는 연구가 필요하다고 하겠다.
의 발현을 저하시켰는데 항산화의 기능이 있는 유전자를 억제한다는 점에서 특이한 결과라고 하겠다. 따라서 活絡湯의 항산화효과는 FTH1를 통하지 않고 다른 유전자를 매개로 이루어지는 것으로 생각되며 추후 심도있는 연구가 필요하다고 하겠다.
본 실험에서 活絡湯 처치시 NRGN의 발현이 저하되었는데 cell signalling은 매우 복잡하므로 活絡湯이 구체적으로 신호 전달에 있어 어떤 역할을 하는지 추후 심도있는 연구가 필요하다고 하겠다.
본 실험에서 活絡湯 처치시` NR1H2의 발현이 저하되었는데 活絡湯이 구체적으로 지질 대사와 세포 분화에 있어 어떤 역할을 하는지 더 깊은 연구가 필요하다고 하겠다.
F1F0-ATP synthase는 서로 연결된 세 세트의 단백질 집합들로 구성 되어 있다19,20). 본 실험에서 活絡湯이 비만세포주에서 세포내 에너지 생산인자인 ATP5F1의 발현을 상승시켰는데 이는 活絡湯 이 에너지 생성을 촉진하는 역할을 한다고 추정되는데 추후 심도있는 연구가 필요하다고 하겠다.
본 실험에서 活絡湯이 비만세포주에서 전사조절인자인 OASs의 발현을 상승시켰는데 이는 活絡湯이 항바이러스 작용을 할 수 있음을 시사하는 것으로 바이러스 모델 실험을 통해 活絡湯의 효과에 대해 추후 심도있는 연구가 필요하다고 하겠다.
본 실험에서 活絡湯이 비만세포주에서 전사조절인자인 ZNF207의 발현을 저하시켰는데 전사조절인자가 어떤 단백질을 변화시키느냐에 따라 活絡湯의 작용 기전이 달라지는 바 추후 심도있는 연구가 필요하다고 하겠다.
이상에서 HMC-1의 CD/cytokine 유전자 발현을 통하여 活絡湯이 에너지 생성의 촉진, 항바이러스 작용, 종양형성억제 등의 작용을 하여 근골격계 질환의 치료효과를 나타냄을 알 수 있었으며 이는 추후 연구에 대한 기초 자료를 제시할 수 있을 것으로 생각된다.
본 실험에서 活絡湯이 비만세포주에서 FBP1의 발현을 저하시켰는데 FBP의 결핍이 저혈당을 유발한다는 점에서 특이한 결과라고 하겠다. 즉 임상에서 活絡湯이 저혈당과는 관계없다는 점에서 FBP1 유전자의 발현이 감소된 것에 대해서는 추후 심도있는 연구가 필요하다고 하겠다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
痺證란?
痺證은 閉而不通하여 痛症이 발생함을 말하며 대개 風寒濕의 邪氣가 肌表經絡으로 侵入하거나 關節에 凝滯됨으로써 氣血運이 順調롭지 못하여 肌肉, 筋骨, 關節 등에麻木, 疼痛, 屈伸不利, 腫脹, 發赤, 熱感 등의 증상을 나타내며 甚하면 關節의 强直性 變形을 招한다5-7). 治療原則 은 病의 新久虛實을 구분하여 活血通絡, 祛痰散寒, 除濕淸熱, 祛風止痛 등의 治法으로 응용한다8).
活絡湯의 유전자 발현에 미치는 영향을 cDNA microarray를 통해 관찰한 결과 얻은 결론은?
1. CD/cytokine 유전자 活絡湯 처치군과 대조군 사이의 유전자 발현강도가 3배 이상 차이나는 것을 유의한 것으로 판단한 결과 活絡湯 처치시 유의하게 발현이 증가하는 유전자는 관찰되지 않았다. 다만, 200~300% 범위로 발현이 항진되는 유전자로는 순서대로 ATP5F1, FLJ20671, unknown, KIAA0342, OAS2, unknown 등이 있었다.
2. 대조군에 비해 0~33%의 범위로 발현이 저하된 유전자는 순서대로 unknown, MDS006, IFITM1, MRPL3, ZNF207, FTH1, FBP1, NRGN, NR1H2, KIAA0747 등이 있었다.
活絡湯의 효능은?
活絡湯은 活血, 通經活絡, 止痛 등의 효능이 있어 최급성기 및 급성기 요통, 요각통, 견비통 등에 활용되는데 특히 관절염 등 근골격계의 염증성, 동통성 질환에서 광범위 하게 응용되고 있다1,2).
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