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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 이들의 유전자를 클로닝하여 유전자 조절에 대한 연구를 위해 β-lactamase 유전자 cloning 을 이행하였다.
제안 방법
- 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0)로 투석한 조효소액을 DEAE Sephadex A-50 column chromatography와 Sephadex G-75 gel filtration을 이용하여 β-lactamase 활성 분획을 얻은 다음, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 이행하여 단백질을 확인하였다.
- 37℃에서 18시간 배양 후 white colony이면서 ampicillin에 내성을 보이는 β-lactamase 양성 clone주(β-Lac+)를 선별하였다.
- Ampicillin (2 mg/ml) 또는 tetracycline (30 μg/ml)이 포함된 LB배지 7 ml에서 37℃, 18시간 배양한 E. coli DH5α 또는 HB101 배양액을 1.5 ml tube에 옮겨 원심분리(17,000× g, 5min)하여 균체를 회수하였다.
- coli DH5α에 cloning하였다. Cosmid vector pLAFR3을 이용하여, Sau3AI 으로 부분 분해한 chromosomal DNA와 BamHI으로 처리한 pLAFR3을 ligation하였다. In vitro packaging kit를 사용하여 E.
- E. coli 에서 발현된 β-lactamase의 세포 내외 존재 비율 분석 E. coli에서 β-lactamase의 균체 내외의 존재 시험은 Neu[16] 의 방법을 변형하여 실험하였다.
- E. coli에서 재조합 β-lactamase (pKL11/ pKL11-ΔB/pKL11-Δ4.6)의 발현 확인과 세포 내외 존재 비율을 분석하였다.
- E. coli의 형질전환은 Cohen 과 Chang의 방법[6]을 변형한 방법으로, 5 ml의 LB배지에서 37℃, 18시간 전배양한 배양액 0.2 ml를 LB배지 20 ml에 접종하고 660 nm에서 O.D.값이 0.4가 될 때까지 진탕 배양하였다. 배양액을 15,000× g에서 10분간 원심분리하고 얻어진 균체를 50 mM CaCl2 (pH 8.
- In vitro packaging kit를 사용하여 E. coli에 형질도입 하였으며 β-lactamase양성 clone주를 획득 하였다.
- J105 균주가 생산하는 세포 외 β-lactamase와 형질 전환된 E. coli HB101에서 생산되는 β-lactamase 간의 동일성 비교를 위해 조효소액을 조제한 후 아래와 같은 방법에 의하여 정제를 하였다.
- J105 유래의 β-lactamase 유전자를 클로닝하여 유전자의 특성을 분석하고 E. coli 내에서 발현 양상을 분석하였다.
- Bacillus sp. J105균주의 chromosomal DNA 분리는 Murray 와 Thompson [15]의 방법을 변형하여 다음과 같은 방법으로 분리하였다. Ampicillin (2 mg/ml)을 함유한 LB배지 100 ml 에 Bacillus sp.
- J105균주의 chromosomal DNA를 분리하여 약 50～70 μg의 DNA를 Sau3AI으로 부분 분해하여 sucrose용액으로 원심관에 5～20%까지 밀도를 형성시켜 50,000× g에서 16시간 동안 슈크로즈 밀도 원심분리(sucrose density ultracentrifugation)를 행하였다.
- J105균주의 세포외 β-lactamase의 유전자는 chromosomal DNA 상에 존재하고 있는 것으로 판단되어 본 균주의 chromosomal DNA를 Murray와 Thompson [15]의 변형된 방법으로 분리하였고 분리한 chromosomal DNA를 Sau3AI으로 부분 분해하여 sucrose density ultracentrifugation을 행한 후 20～30 kb 단편만을 모았다.
- J105의 배양액에서 β-lactamase 활성을 확인 하였으며 이 효소를 분리하여 그 특성을 연구하였다[4].
- pKL11-ΔB 3 μg을 BamHI과 BglII를 각각 3 unit씩 2시간 동안 반응시키고 0.8% agarose gel 전기영동을 행하였다.
- 그 후 E. coli HB101에 형질전환 시켜 LB agar배지에 도말하였고 37℃에서18시간 배양하여 ampicillin에 내성을 보이는 β-lactamase 양성 subclone주를 선별하였다.
- 그리고 E. coli에서 βlactamase (pKL11, pKL11-ΔB, pKL11-Δ4.6)의 발현 확인은 먼저 재조합 plasmid를 보유한 E. coli HB101 균주를 LB 배지에서 37℃, 18시간 배양한 뒤 Neu [16]의 방법으로 세포를 파쇄한 뒤 세포내 단백질을 SDS-PAGE를 통하여 재조합 β-lactamase 단백질의 발현을 조사하였으며 Fig. 7에서 나타내었다.
- 농축되어진 활성부분을 0.15 M의 NaCl이 함유된 상기의 buffer로 평형화 시킨 Sephadex G-75가 충진된 column (1.6×140cm)을 사용하여 gel filtration을 행하였다.
- 5 ml tube에 옮겼다. 동량의 phenol/chloroform/isoamyl alcohol (v/v/v, 25:2:1)로 상층액 추출하고, 추출액 동량의 chloroform/isoamyl alcohol (v/v, 24:1)을 혼합하여 상층액을 추출하였다. 에탄올 침전방법으로 최종 DNA를 침전시키고 TE 완충액에 녹여 -20℃에 보관하였다.
- 분석 최종적으로 subcloning된 프라즈미드 pKL11-Δ4.6을 분리 하여 β-lactamase의 염기서열을 결정하였다.
- DNA 염기서열 분석은 dideoxynucleotide method [20]로 이행하였으며 기질로 plasmid DNA를 사용하였다. 염기서열 분석은 DNASIS (Hitachi Software Engineering America, Ltd., San Bruno, Calif) program과 NIH BLASTA program을 이용하였다. E.
- J105균주의 chromosomal DNA를 분리하여 약 50～70 μg의 DNA를 Sau3AI으로 부분 분해하여 sucrose용액으로 원심관에 5～20%까지 밀도를 형성시켜 50,000× g에서 16시간 동안 슈크로즈 밀도 원심분리(sucrose density ultracentrifugation)를 행하였다. 원심분리 후 크기별로 분리된 chromosome DNA 단편이 포함된 용액을 0.5 ml씩 분취하여 0.5% agarose 전기영동을 통하여 DNA 크기를 측정 하여, 20～30 kb 크기의 DNA단편을 모아 TE buffer에 24시간 동안 투석하여 sucrose를 제거한 후 -20℃ 보관하였다. 준비된 cosmid vector arms 1 μg과 20～30 kb chromosomal DNA단편 3 μg을 T4 ligase (Promega, USA)로 18℃에서 6시간동안 ligation하였다.
- 이 recombinant plasmid (β-lac＋)를 pACYC184 (4.2 kb) vector를 사용하여 subcloning 하여 최종 β-lactamase의 활성이 있는 6.4 kb 단편이 포함된 pKL11-Δ4.6을 제작하였다.
- 이 단편과 cosmid vector의 양쪽 arm과 ligation하여 in vitro packaging을 거쳐 λ phage의 형질도입방법으로 E. coli DH5α 에 재조합 plasmid를 형질도입 하였다.
- 6)의 발현 확인과 세포 내외 존재 비율을 분석하였다. 존재 비율 분석은 Neu [16]의 방법을 변형하여 실험하였고 재조합 plasmid를 보유한 E. coli HB101균주를 LB 배지에서 18시간 배양한 뒤 세포외와 세포 내에서의 활성을 비교하여 Bacillus유래의 유전자가 E. coli에서의 발현될 때 세포 내외에 있어서 존재비율을 비교하여 Table 2에 나타내었다. 모든 recombinant plasmid (pKL11, pKL11-ΔB, pKL11-Δ4.
- 클로닝된 단편의 크기가 40 kb 이상으로 다루기 힘들기 때문에 β-lactamase 유전자의 subcloning을 위해 E. coli DH5α (pKB89)를 100 ml LB 배지에서 37℃, 18시간 배양 후 alkaline lysis 방법으로 pKB89를 대량조제 하였다.
- coli HB101에 형질전환 시켜 LB agar배지에 도말하였고 37℃에서18시간 배양하여 ampicillin에 내성을 보이는 β-lactamase 양성 subclone주를 선별하였다. 획득한 subclone주의 recombinant plasmid를 분리하여 제한효소를 처리하여 확인한 후 E. coli HB101에 다시 형질전환 시켜 plasmid의 안정성을 검토하였다. Subclone된 β-lactamase 유전자가 포함된 plasmid는 숙주균에서 안정하게 유지되었으며 이 plasmid를 pKL11로 명명하였다.
대상 데이터
- β-Lactamase 유전자 cloning을 위한 E. coli DH5α균주는 X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-galactopyranoside), IPTG (Isopropyl-thiogalactoside), 그리고 ampicillin (2 mg/ml)이 포함된 LB (1% bacto trypton, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl) agar 배지를 사용하였다.
- J105균주는 부산 일대의 토양에서 분리하였으며 β-lactamase의 단백질 분리 및 유전자의 클로닝에 이용하였다.
- Plasmid pLAFR3은 tetracycline 내성유전자(Tcr)와 multi cloning site (MCS)를 가지고 있는 22 kb의 cosmid vector이며 Bacillus sp. J105균주의 genomic library의 제작에 사용하였다. Plasmid pACYC184는 4.
- Plasmid pACYC184는 4.2 kb의 크기를 가지며 cloning한 βlactamase 유전자의 subcloning vector로 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 균주와 plasmid는 Table 1에 나타내었다. Bacillus.
이론/모형
- β-Lactamase 활성 측정은 Micro-iodometric assay 방법[21]을 이용하였다.
- 이 단편을 염기서열분석에 이용하였다. DNA 염기서열 분석은 dideoxynucleotide method [20]로 이행하였으며 기질로 plasmid DNA를 사용하였다. 염기서열 분석은 DNASIS (Hitachi Software Engineering America, Ltd.
성능/효과
- coli에서 형질전환 시켜 발현 양상을 조사해 본 결과 β-lactamase의 secretion efficiency는 약 4～5％였다. E. coli의 세포 내 단백질로부터 β-lactamase를 정제하여 분자량을 확인한 결과 31 kDa로 wild type의 분자량과 일치함을 확인하였다.
- J105균주에서 생산되는 β-lactamase [4]와 동일한 31 kDa의 위치에서 β-lactamase가 발현되고 있음을 확인하였다(Fig. 7).
- 먼저 Bacillus sp. J105균주의 plasmid 존재 유무를 파악하기 위해서 alkaline lysis 방법[2]을 변형하여 plasmid 분리실험 결과, plasmid가 존재하지 않는다는 것을 확인하였다(data not shown). 따라서 Bacillus sp.
- pKL11 3 μg을 3 unit의 BamHI으로 2시간동안 반응 시키고 0.8% agarose gel 전기영동을 행한 결과, 15.2 kb 단편과 1.7 kb 단편을 확인하였다.
- 따라서 모든 재조합 plasmid가 동일한 것으로 판단되었고 β-lactamase의 유전자는 recombinant plasmid 상에 존재하며 이 plasmid는 숙주균 내에서 안정하게 유지되고 있음을 알았다.
- cereus의 β-lactamase와 각각 97%와 94%의 일치를 보였다. 또한 계통도 분석 결과 역시 본 연구에서 클로닝된 β-lactamase의 아미노산을 서열은 B. thuringinesis와 B. cereus 와 유전학적으로 아주 밀접한 관계를 보여주었다.
- 모든 recombinant plasmid (pKL11, pKL11-ΔB, pKL11-Δ4.6)가 E. coli에서 β-lactamase를 발현시켰으며 대부분의 β-lactamase 가 cytoplasm에 존재하였고 약 4～5% 만이 분비되어 세포외에 존재하는 것으로 밝혀졌다.
- 본 연구에서 클로닝된 β-lactamase의 아미노산을 서열을 NCBI BLAST program을 이용하여 분석해 본 결과 B. thuringinesis와 B. cereus의 β-lactamase와 각각 97%와 94%의 일치를 보였다(Fig. 5).
- cereus 유래의 β-lactamase 유전자의 upstream 부위와 97%의 일치를 보였다. 본 연구에서 클로닝된 β-lactamase의 아미노산을 서열을 NCBI BLAST program을 이용하여 분석해 본 결과 B. thuringinesis와 B. cereus의 β-lactamase와 각각 97%와 94%의 일치를 보였다. 또한 계통도 분석 결과 역시 본 연구에서 클로닝된 β-lactamase의 아미노산을 서열은 B.
- 이 pKL11-Δ4.6를 E. coli에서 형질전환 시켜 발현 양상을 조사해 본 결과 β-lactamase의 secretion efficiency는 약 4～5％였다. E.
- 이 recombinant plasmid를 pKB89라 명명하였고 여러 가지 제한효소를 처리 하여 그 분해 형태를 조사한 결과, pKB89의 전체적인 크기는 분자량 marker와 λ phage의 packaging size를 고려해 볼 때 40 kb 이상 될 것으로 추정되었다(data not shown).
- 6×140cm)을 사용하여 gel filtration을 행하였다. 최종 gel filtration후 수율은 세포추출물 비례 44.7% 이였으며, 이때의 활성은 133%를 나타내었다(Table 3). 최종 정제된 활성부분을 12% SDS-PAGE로 확인한 결과 분자량은 31 kDa로 이는 Bacillus sp.
- 클로닝된 β-lactamase 유전자의 upstream 을 포함하는 170 bp의 염기서열을 분석한 결과, B. thuringinesis와 B. cereus 유래의 β-lactamase 유전자의 upstream 부위와 97%의 일치를 보였다(data not shown).
- 클로닝된 β-lactamase 유전자의 upstream을 포함하는 170 bp 의 염기서열을 분석한 결과, B. thuringinesis와 B. cereus 유래의 β-lactamase 유전자의 upstream 부위와 97%의 일치를 보였다.
- 1에 나타내었다. 형질전환된 균주를 50개 선별하여 재조합 plasmid를 확인하였고 SalI으로 처리하여 agarose gel 전기영동으로 확인한 결과, 4개의 단편이 모든 재조합 plasmid에서 발견되었다. 따라서 모든 재조합 plasmid가 동일한 것으로 판단되었고 β-lactamase의 유전자는 recombinant plasmid 상에 존재하며 이 plasmid는 숙주균 내에서 안정하게 유지되고 있음을 알았다.
후속연구
- β-Lactam계 항생물질의 β-lactamase에 대한 유도기구는 아직 명확히 밝혀지지는 않았으나 이들 효소의 구조 유전자와 조절 유전자를 규명함으로서 가능할 것이다.
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