이종 심장 판막 이식편에서 효과적인 탈세포화 방법에 관한 연구; 저장성 용액(hypotonic solution)의 삼투압 처치법 효과 A Study on an Effective Decellularization Technique for a Xenograft Cardiac Valve: the Effect of Osmotic Treatment with Hypotonic Solution원문보기
배경: 조직판막에 남아있는 세포물질은 환자의 면역반응과 관련이 있고 석회화의 원인이 된다고 알려져 있으며 탈세포화 된 판막조직의 세포외 기질은 숙주세포(host cell)가 부착되고 내피화(endothelialization)되어 조직으로 재구성되게 하는 생물학적 지자체로도 사용될 수 있다. 그러므로 탈세포화는 조직판막의 면역반응 최소화와 지자체의 형성에 가장 중요한 부분이다. 탈세포화를 위해 많은 방법과 약제들이 개발 되어 왔다. 그러나 화학적 혹은 효소적 탈세포화 방법에 앞서 삼투압(osmolality)을 이용한 저장성 용액 처치에 대한 효과를 보여준 논문은 드물다. 본 연구는 탈세포화에 있어서 저장성 용액 처치의 효과를 밝히고 아울러 탈세포화 시 적절한 온도, 처치시간, sodium dodecylsulfate (SDS)의 농도를 밝히고자 시행되었다. 대상 및 방법: 돼지 판막을 여러 조건 즉 SDS농도(0.25%, 0.5%), 저장성용액 처치시간(6, 12, 24시간), 온도($4^{\circ}C$, $20^{\circ}C$)를 달리하여 일종의 이온세정 용매인 SDS를 이용하여 탈세포화를 하였다. 저장성 용액에 노출시키지 않은 군을 B군으로 하고 동 수의 돼지 판막을 같은 조건에서 SDS에 처치하기 전에 저장성용액에 노출 시켰다(A군). 저장성 용액에의 노출은 4, 7, 14시간, $4^{\circ}C$와 $20^{\circ}C$로 구분하여 각각 탈세포화의 정도를 조사하였다. 탈세포화와 세포외 기질의 보존 정도는 hematokylin-eosin (H-E) 염색으로 표본을 관찰하였다. 결과: SDS의 두 농도, 0.25%, 0.5%에서 탈세포화의 정도의 차이는 발견할 수 없었다. $4^{\circ}C$ 환경에서 24시간 SDS로 처치한 것이 A, B군 모두에서 가장 양호한 탈세포화를 소견을 보였고 $20^{\circ}C$에서는 탈세포화 정도에 차이가 없었다. 저장성 용액으로 처치한 A군 모두에서 같은 조건의 처치하지 않은 B군에 비래 더 양호한 탈세포화 소견을 보였다. $4^{\circ}C$, 14시간 저장성용액에 노출된 판막이 가장 좋은 탈세포화의 소견을 보였고, $20^{\circ}C$의 저장성 용액에 노출된 판막은 양호한 탈세포의 소견을 보였으나 심한 세포외 기질의 파괴를 관찰할 수 있었다. 결론: 판막조직의 탈세포화에 있어서 삼투압처리를 이용한 저장성 용액 처치는 매우 효과적인 방법으로서, 돼지 판막조직의 탈세포화에 꼭 적용되어야 할 방법으로 생각된다 저장성 용액에의 노출이 탈세포화에 필요한 화학적 세정제(chemical detergent)의 농도를 줄이고 이러한 세정제의 농도나 노출시간을 줄일 수 있는지 그리고 세포외 기질의 변화에 어느 정도 영향을 주는지에 대해 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
배경: 조직판막에 남아있는 세포물질은 환자의 면역반응과 관련이 있고 석회화의 원인이 된다고 알려져 있으며 탈세포화 된 판막조직의 세포외 기질은 숙주세포(host cell)가 부착되고 내피화(endothelialization)되어 조직으로 재구성되게 하는 생물학적 지자체로도 사용될 수 있다. 그러므로 탈세포화는 조직판막의 면역반응 최소화와 지자체의 형성에 가장 중요한 부분이다. 탈세포화를 위해 많은 방법과 약제들이 개발 되어 왔다. 그러나 화학적 혹은 효소적 탈세포화 방법에 앞서 삼투압(osmolality)을 이용한 저장성 용액 처치에 대한 효과를 보여준 논문은 드물다. 본 연구는 탈세포화에 있어서 저장성 용액 처치의 효과를 밝히고 아울러 탈세포화 시 적절한 온도, 처치시간, sodium dodecylsulfate (SDS)의 농도를 밝히고자 시행되었다. 대상 및 방법: 돼지 판막을 여러 조건 즉 SDS농도(0.25%, 0.5%), 저장성용액 처치시간(6, 12, 24시간), 온도($4^{\circ}C$, $20^{\circ}C$)를 달리하여 일종의 이온세정 용매인 SDS를 이용하여 탈세포화를 하였다. 저장성 용액에 노출시키지 않은 군을 B군으로 하고 동 수의 돼지 판막을 같은 조건에서 SDS에 처치하기 전에 저장성용액에 노출 시켰다(A군). 저장성 용액에의 노출은 4, 7, 14시간, $4^{\circ}C$와 $20^{\circ}C$로 구분하여 각각 탈세포화의 정도를 조사하였다. 탈세포화와 세포외 기질의 보존 정도는 hematokylin-eosin (H-E) 염색으로 표본을 관찰하였다. 결과: SDS의 두 농도, 0.25%, 0.5%에서 탈세포화의 정도의 차이는 발견할 수 없었다. $4^{\circ}C$ 환경에서 24시간 SDS로 처치한 것이 A, B군 모두에서 가장 양호한 탈세포화를 소견을 보였고 $20^{\circ}C$에서는 탈세포화 정도에 차이가 없었다. 저장성 용액으로 처치한 A군 모두에서 같은 조건의 처치하지 않은 B군에 비래 더 양호한 탈세포화 소견을 보였다. $4^{\circ}C$, 14시간 저장성용액에 노출된 판막이 가장 좋은 탈세포화의 소견을 보였고, $20^{\circ}C$의 저장성 용액에 노출된 판막은 양호한 탈세포의 소견을 보였으나 심한 세포외 기질의 파괴를 관찰할 수 있었다. 결론: 판막조직의 탈세포화에 있어서 삼투압처리를 이용한 저장성 용액 처치는 매우 효과적인 방법으로서, 돼지 판막조직의 탈세포화에 꼭 적용되어야 할 방법으로 생각된다 저장성 용액에의 노출이 탈세포화에 필요한 화학적 세정제(chemical detergent)의 농도를 줄이고 이러한 세정제의 농도나 노출시간을 줄일 수 있는지 그리고 세포외 기질의 변화에 어느 정도 영향을 주는지에 대해 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
Background: Cellular remnants in the bioprosthetic heart valve are known to be related to a host's immunologic response and they can form the nidus for calcification. The extracellular matrix of the decellularized valve tissue can also be used as a biological scaffold for cell attachment, endothelia...
Background: Cellular remnants in the bioprosthetic heart valve are known to be related to a host's immunologic response and they can form the nidus for calcification. The extracellular matrix of the decellularized valve tissue can also be used as a biological scaffold for cell attachment, endothelialization and tissue reconstitution. Thus, decellularization is the most important part in making a bioprosthetic valve and biological caffold. Many protocols and agents have been suggested for decellularization, yet there ave been few reports about the effect of a treatment with hypotonic solution prior to chemical or enzymatic treatment. This study investigated the effect of a treatment with hypotonic solution and the appropriate environments such as temperature, the treatment duration and the concentration of sodium dodecylsulfate (SDS) for achieving proper decellularization. Material and Method: Porcine aortic valves were decellularized with odium dodecylsulfate at various concentrations (0.25%, 0.5%), time durations (6, 12, 24 hours) and temperatures ($4^{\circ}C$, $20^{\circ}C$)(Group B). Same the number of porcine aortic valves (group A) was treated with hypotonic solution prior to SDS treatment at the same conditions. The duration of exposure to the hypotonic solution was 4, 7 and 14 hours and he temperature was $4^{\circ}C$ and $20^{\circ}C$, respectively. The degree of decellularization was analyzed by performing hematoxylin and eosin staining. Result: There were no differences in the degree of decellularization between the two concentrations (0.25% 0.5%) of SDS. Twenty four hours treatment with SDS revealed the best decellularization effect for both roups A and B at the temperature of $4^{\circ}C$, but there was no differences between the roups at $20^{\circ}C$. Treatment with hypotonic solution (group A) showed a better ecellularization effect at all the matched conditions. Fourteen hours treatment at $4^{\circ}C$ ith ypotonic solution prior to 80S treatment revealed the best decellularization effect. The treatment with hypotonic solution at $20^{\circ}C$ revealed a good decellularization effect, but his showed significant extracellular matrix destruction. Conclusion: The exposure of porcine heart valves to hypotonic solution prior to SDS treatment is highly effective for achieving decellularization. Osmotic treatment with hypotonic solution should be considered or achieving decellularization of porcine aortic valves. Further study should be carried out to see whether the treatment with hypotonic solution could reduce the exposure duration and concentration of chemical detergents, and also to evaluate how the structure of the extracellular matrix of the porcine valve is affected by the exposure to hypotonic solution.
Background: Cellular remnants in the bioprosthetic heart valve are known to be related to a host's immunologic response and they can form the nidus for calcification. The extracellular matrix of the decellularized valve tissue can also be used as a biological scaffold for cell attachment, endothelialization and tissue reconstitution. Thus, decellularization is the most important part in making a bioprosthetic valve and biological caffold. Many protocols and agents have been suggested for decellularization, yet there ave been few reports about the effect of a treatment with hypotonic solution prior to chemical or enzymatic treatment. This study investigated the effect of a treatment with hypotonic solution and the appropriate environments such as temperature, the treatment duration and the concentration of sodium dodecylsulfate (SDS) for achieving proper decellularization. Material and Method: Porcine aortic valves were decellularized with odium dodecylsulfate at various concentrations (0.25%, 0.5%), time durations (6, 12, 24 hours) and temperatures ($4^{\circ}C$, $20^{\circ}C$)(Group B). Same the number of porcine aortic valves (group A) was treated with hypotonic solution prior to SDS treatment at the same conditions. The duration of exposure to the hypotonic solution was 4, 7 and 14 hours and he temperature was $4^{\circ}C$ and $20^{\circ}C$, respectively. The degree of decellularization was analyzed by performing hematoxylin and eosin staining. Result: There were no differences in the degree of decellularization between the two concentrations (0.25% 0.5%) of SDS. Twenty four hours treatment with SDS revealed the best decellularization effect for both roups A and B at the temperature of $4^{\circ}C$, but there was no differences between the roups at $20^{\circ}C$. Treatment with hypotonic solution (group A) showed a better ecellularization effect at all the matched conditions. Fourteen hours treatment at $4^{\circ}C$ ith ypotonic solution prior to 80S treatment revealed the best decellularization effect. The treatment with hypotonic solution at $20^{\circ}C$ revealed a good decellularization effect, but his showed significant extracellular matrix destruction. Conclusion: The exposure of porcine heart valves to hypotonic solution prior to SDS treatment is highly effective for achieving decellularization. Osmotic treatment with hypotonic solution should be considered or achieving decellularization of porcine aortic valves. Further study should be carried out to see whether the treatment with hypotonic solution could reduce the exposure duration and concentration of chemical detergents, and also to evaluate how the structure of the extracellular matrix of the porcine valve is affected by the exposure to hypotonic solution.
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문제 정의
그리고 이들 세포 제거 방법들은 세포를 제거한 후 남은 세포외 기질 지자체 (extracellular matrix scafold)의 생화학적 조성 (biochemical composition), 미세구조, 물리적 성질에 영향을 술 수있으므로 이는 다시 이들 지자체의 이식 후 숙주반응(hosi response)에 영향을 줄 수 있다. 그러므로 탈세포화 방법의 목표는 남아있는 세포외 기질(extracellular matrix)에 대한 조성 (composition), 생물학적 횔-성도(biological activity), 물리적 성질 (mechanical integrity) 에 최소한의 영향을 주면서 모든 세포와 세포핵 물질을 효과적으로 제거할 수 있는 것이라 하겠다.
본 연구는 돼지 대동맥판막에서 효과적인 탈세포화 방법을 찾는 초기단계의 연구로서 삼투압처리를 이용한 저장성 용액의 처치 유무와 노출 시간 및 온도, SDS 농도와 노출 시간 및 온도에 따른 탈세포화의 정도를 관찰 하였다. 본 연구를 통해서 저자들이 밝히고자 한 내용은 첫째 SDS 단독에 의한 탈세포화가 가능한지, 가능하다면 그 적정 농도와 노출 시간은 어느 정도인지, 둘째, 저장성 용액에 의한 노출이 과연 필요한지, 필요하다면 적정 노출 시간과 온도는 어느 정도인지를 밝히기 위함이었다.
제안 방법
세포가 완전히 파괴되어 흘러나온 핵의 잔유물인 형체가 뚜렷하지 않는 azurophilic substance는 세포핵 수에서 제외하였다. 기질의 보존 정도는 hematoxylin-eosin (H-E) 염색 400배율에서 관찰하였다.
모두 20개의 돼지 대동맥판막을 사용하였으며 SDS 용액에 처리하기 전 저장성 용액(hypotonic solution)에 노출시킨 군을 A군(11=10), 노출 시키지 않은 군을 B군(11=10)로나누고 각 군에서 저장용액에 노출 시간(4, 7, 14시간), 온도(VC, 20℃), sodium dodecylsulfate (SDS) 용액에 노출 시간 및 농도(6, 12, 24시간, 0.25%, 0.5%)에 따라 다시 세분하여 모두 20가지의 조건에서 실험하였다(Table 1).
본 연구를 통해서 저자들이 밝히고자 한 내용은 첫째 SDS 단독에 의한 탈세포화가 가능한지, 가능하다면 그 적정 농도와 노출 시간은 어느 정도인지, 둘째, 저장성 용액에 의한 노출이 과연 필요한지, 필요하다면 적정 노출 시간과 온도는 어느 정도인지를 밝히기 위함이었다. 이를 위해 여러 조건에서 변수실험을 시행하였다.
다른 용액에 옮길 때에는 생리용액(50 mL PBS)에 5분간 3회 이상 세척 후 이동한다. 이와 같이 무세포화 과정의 실험이 끝난 후에는 조직을 생리식염수에 세척 후 10% 포르말린에 고정하여 병리조직검사를 시행한다.
본 실험에서는 10 mM tris buffer solution에 EDTA와 apro- Hniir을 첨가하여 사용하였다. 저장성 용액에 노출 시간은 많은 실험에서 24시간 혹은 36시간 정도 노출시키나 본연구에서는 조금 짧은 4, 7, 시간에 노출시켰다. 저장성 용액에 노출 시킬 때 그 온도도 매우 중요한데 이는 세포 파괴 시 누출되는 세포 내 효소의 활성화 정도가 온도와 관겨] 가 있기 때문이다.
탈세포화와의 정도는 hematoxylin-eosin (H-E) 염색을 한 후 100배 배율의 슬라이드에서 가장 세포핵이 많이 남아있는 부위를 선정하여 200 zzmx200 /zm 내의 세포핵의 수를 세어 탈세포화의 정도로 이용하였다, . 세포가 완전히 파괴되어 흘러나온 핵의 잔유물인 형체가 뚜렷하지 않는 azurophilic substance는 세포핵 수에서 제외하였다.
데이터처리
모든 평 균은 mean土SD로 표현하였고 평 균의 차이는 Microsoft office Excel program을 이용하여 독립변수 T” 검정법을 이용하여 p<0.05 일 때를 의미 있는 것으로 간주하였다
성능/효과
같은 SDS 농도에서 처치시간이 가장 긴 14시간 실험조건에서 세포핵의 제거 효과가 가장 좋았다(Table 1, Fig. 3). 그러나 이는 SDS 용액 처치시간이 같이 길게 설정되어 있었으므로 저 장성 용액 처치시간이 길어 서인지 SDS 용액 처치시간이 길어서 인지를 알 수가 없디、그러나 같은 SDS 용액 처치 시간에서 저장성 용액 처치 군(A군)의 탈세 포화 정도는 저장성 용액으로 처치하지 않은 B군에 비해 좋았다.
그러고 0.25%, 0.5%의 SDS농도의 차이에 의한 탈세 포화 정도의 차이는 발견할 수 없었다, 본 실험에서 얻은 가장 중요한 결과는 SDS 노출 전 저장성 용액에의 처치가 매우 중요함을 보여주었다. 저장성 용액에 노출된 군이 노출되지 않은 군에 비해 전체적으로 탈세포화의 정도에 큰 차이를 보였으며 노출 시간(4, 7, 匕4시간)이 가장 긴 M시간에 가장 양호한 탈세포화 정도를 보였다(Table 1, Fig.
본 실험에서 SDS 처리 전 저장성 용액으로 처리하는 것이 탈세포화에 매우 효과적이어서 탈세포화 방법 중 하나의 중요한 과정임을 보여주었다. 삼투압처치를 이용한 저장성 용액에 의한 처리는 저체온에서 장시긴-(14시간) 처리하는 것이 세포외 기질의 보호와 함꼐 더 효.
하였다. 본 연구를 통해서 저자들이 밝히고자 한 내용은 첫째 SDS 단독에 의한 탈세포화가 가능한지, 가능하다면 그 적정 농도와 노출 시간은 어느 정도인지, 둘째, 저장성 용액에 의한 노출이 과연 필요한지, 필요하다면 적정 노출 시간과 온도는 어느 정도인지를 밝히기 위함이었다. 이를 위해 여러 조건에서 변수실험을 시행하였다.
본 연구의 결과를 종합해 보면 4℃에서 저장성 용액에 14시간처리 한 다음, 0.25% 혹은 0.5% SDS용액으로 24시간 처리하는 것이 가장 좋은 탈세포화의 효과를 나타낸 것으로 나타났다
이는 2(fC에서 4"C에서 보다 효소들의 활성도가 훨씬 강함을 시사하는 바이다. 본 연구의 결괴에서 보면 저온(4℃)에서는 비록 여러 효소나 세정제등의 활성화나 기능을 약화시킬 수 있지만, 무세포화과정에 비교적 장시간 노출시킴으로서 효소적, 화학적 탈세포화의 효과를 유지하고, 특히 세포외 기질의 손상을 최소화 할 수 있을 것으로 생각되었다.
실험의 결과는 SDS 단독에 의한 탈세포화는 매우 불완전하였다. 그러고 0.
5%의 SDS농도의 차이에 의한 탈세 포화 정도의 차이는 발견할 수 없었다, 본 실험에서 얻은 가장 중요한 결과는 SDS 노출 전 저장성 용액에의 처치가 매우 중요함을 보여주었다. 저장성 용액에 노출된 군이 노출되지 않은 군에 비해 전체적으로 탈세포화의 정도에 큰 차이를 보였으며 노출 시간(4, 7, 匕4시간)이 가장 긴 M시간에 가장 양호한 탈세포화 정도를 보였다(Table 1, Fig. 3). 저장성 용액의 노출 온도에 있어서는 20℃에서 4 ℃보다 탈세포화 정도는 더 양호하게 보이나 2SC에서 세포 외 기질의 파괴가 더 심해 보였다(Tabel 1, Fig.
전체적으로 20℃에서 4℃보다 탈세포화의 효과는 좋은 경향은 보이나 통계학적 의의는 없었고 20℃에서 탈세 포화는 세포외 기질의 파괴가 심한 소견을 보였다(Fig. 4).
후속연구
과적으로 탈세포를 할 수 있음을 보여 주었다. 향후 추가적인 연구를 통해 저장성 용액에의 노출이 탈세포화에 필요한 화학적 세정제(아lemical detergent:)의 농도를 줄이고 노출 시간을 줄일 수 있는지 그리고 세포외 기질의 변화에 어느 정도 영향을 주는지를 밝혀야 할 것이다.
참고문헌 (16)
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