목 적 : 듀시엔/베커형 근이영양증(Duchenne and Becker type muscular dystrophy; DMD/BMD)은 남아에게 나타나는 일반적인 X 염색체 연관 유전성 근육 질환으로 DMD(dystrophin) 유전자의 돌연변이로 인해 생긴다. 그 중 큰 exon 결실이 전체 DMD 환자의 약 50-60%에서 발견된다. 이 유전자의 돌연변이를 찾기 위해 여러 방법들이 사용되고 있지만 결실 돌연변이를 찾아내기 위한 가장 일반적인 방법으로 복합적 중합효소연쇄반응을 이용하고 있다. 하지만 이 방법의 단점은 하나의 시험관 안에 복합적인 시발체가 존재하여 정확한 반응 조건을 찾기 힘들 뿐 아니라 시발체 상호간의 간섭으로 중합효소 연쇄반응의 비특이적 생성물을 빈번하게 일으켜 잘못된 음성 또는 양성 결과를 가져올 수 있다. 이런 문제를 보완하고자 Dual Primer Oligonucleotide(DPO) 방법을 도입하였다. DPO는 polydeoxyinosine 연결에 의해 두 영역으로 분리된 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)로 표적 DNA 염기서열과의 교잡반응에 높은 특이적 반응을 보여 복합 중합효소 연쇄반응의 정확도를 높여준다. 본 연구에서는 3 그룹을 대상군으로 DMD 유전자의 결실돌연변이 검색을 위한 DPO-복합 중합효소 연쇄반응법의 특이성과 민감성을 알아보고자 하였다. 방 법 : 50명의 건강한 남자 대조군, 50명의 결실 돌연변이를 갖고 있는 양성반응 환자그룹 그리고 20명의 결실 돌연변이를 가지고 있지 않은 음성반응 환자 그룹으로 구성된 3 그룹을 대상으로 DPO-복합 중합효소 연쇄반응법을 이용하여 실험하였다. 이들 120명의 실험군 모두 PMter영역과 exon 3, 4, 6, 8, 12, 13, 17, 19, 43-48, 50-52, 60을 포함하는 18개의 exon에서의 결실의 여부와 결실 범위를 확인하였다. 결 과 : DPO-복합 중합효소 연쇄반응법은 결실 여부를 발견하는데 100%의 특이성과 민감성을 보였다. 하지만 결실 범위의 결정에는 97.1%의 민감성과 특이성을 보였다. 결 론 : DPO-복합 중합효소 연쇄반응법은 기존의 복합 중합효소 연쇄반응법 보다 높은 분석 확실성을 보일뿐 아니라 빠르고 저렴한 비용으로 쉽게 할 수 있기 때문에 듀시엔/베커형 근이영양증 환자의 DMD 유전자의 결실돌연변이 여부를 확인하는데 유용한 방법이다.
목 적 : 듀시엔/베커형 근이영양증(Duchenne and Becker type muscular dystrophy; DMD/BMD)은 남아에게 나타나는 일반적인 X 염색체 연관 유전성 근육 질환으로 DMD(dystrophin) 유전자의 돌연변이로 인해 생긴다. 그 중 큰 exon 결실이 전체 DMD 환자의 약 50-60%에서 발견된다. 이 유전자의 돌연변이를 찾기 위해 여러 방법들이 사용되고 있지만 결실 돌연변이를 찾아내기 위한 가장 일반적인 방법으로 복합적 중합효소연쇄반응을 이용하고 있다. 하지만 이 방법의 단점은 하나의 시험관 안에 복합적인 시발체가 존재하여 정확한 반응 조건을 찾기 힘들 뿐 아니라 시발체 상호간의 간섭으로 중합효소 연쇄반응의 비특이적 생성물을 빈번하게 일으켜 잘못된 음성 또는 양성 결과를 가져올 수 있다. 이런 문제를 보완하고자 Dual Primer Oligonucleotide(DPO) 방법을 도입하였다. DPO는 polydeoxyinosine 연결에 의해 두 영역으로 분리된 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)로 표적 DNA 염기서열과의 교잡반응에 높은 특이적 반응을 보여 복합 중합효소 연쇄반응의 정확도를 높여준다. 본 연구에서는 3 그룹을 대상군으로 DMD 유전자의 결실돌연변이 검색을 위한 DPO-복합 중합효소 연쇄반응법의 특이성과 민감성을 알아보고자 하였다. 방 법 : 50명의 건강한 남자 대조군, 50명의 결실 돌연변이를 갖고 있는 양성반응 환자그룹 그리고 20명의 결실 돌연변이를 가지고 있지 않은 음성반응 환자 그룹으로 구성된 3 그룹을 대상으로 DPO-복합 중합효소 연쇄반응법을 이용하여 실험하였다. 이들 120명의 실험군 모두 PMter영역과 exon 3, 4, 6, 8, 12, 13, 17, 19, 43-48, 50-52, 60을 포함하는 18개의 exon에서의 결실의 여부와 결실 범위를 확인하였다. 결 과 : DPO-복합 중합효소 연쇄반응법은 결실 여부를 발견하는데 100%의 특이성과 민감성을 보였다. 하지만 결실 범위의 결정에는 97.1%의 민감성과 특이성을 보였다. 결 론 : DPO-복합 중합효소 연쇄반응법은 기존의 복합 중합효소 연쇄반응법 보다 높은 분석 확실성을 보일뿐 아니라 빠르고 저렴한 비용으로 쉽게 할 수 있기 때문에 듀시엔/베커형 근이영양증 환자의 DMD 유전자의 결실돌연변이 여부를 확인하는데 유용한 방법이다.
Purpose : Large exon deletions in the DMD gene are found in about 60% of DMD/BMD patients. Multiplex PCR has been employed to detect the deletion mutation, which frequently generates noise PCR products due to the presence of multiple primers in a single reaction as well as the stringency of PCR cond...
Purpose : Large exon deletions in the DMD gene are found in about 60% of DMD/BMD patients. Multiplex PCR has been employed to detect the deletion mutation, which frequently generates noise PCR products due to the presence of multiple primers in a single reaction as well as the stringency of PCR conditions. This often leads to a false-negative or false-positive result. To address this problematic issue, we introduced the dual primer oligonucleotide (DPO) system. DPO contains two separate priming regions joined by a polydeoxyinosine linker that results in high PCR specificity even under suboptimal PCR conditions. Methods : We tested 50 healthy male controls, 50 patients with deletion mutation as deletion-positive patient controls, and 20 patients with no deletions as deletion-negative patient controls using DPO-multiplex PCR. Both the presence and extent of deletion were verified by simplex PCR spanning the promoter region (PM) and 18 exons including exons 3, 4, 6, 8, 12, 13, 17, 19, 43-48, 50-52, and 60 in all 120 controls. Results : DPO-multiplex PCR showed 100% sensitivity and specificity for the detection a deletion. However, it showed 97.1% sensitivity and 100% specificity for determining the extent of deletions. Conclusion : The DPO-multiplex PCR method is a useful molecular test to detect large deletions of DMD for the diagnosis of patients with DMD/BMD because it is easy to perform, fast, and cost-effective and has excellent sensitivity and specificity.
Purpose : Large exon deletions in the DMD gene are found in about 60% of DMD/BMD patients. Multiplex PCR has been employed to detect the deletion mutation, which frequently generates noise PCR products due to the presence of multiple primers in a single reaction as well as the stringency of PCR conditions. This often leads to a false-negative or false-positive result. To address this problematic issue, we introduced the dual primer oligonucleotide (DPO) system. DPO contains two separate priming regions joined by a polydeoxyinosine linker that results in high PCR specificity even under suboptimal PCR conditions. Methods : We tested 50 healthy male controls, 50 patients with deletion mutation as deletion-positive patient controls, and 20 patients with no deletions as deletion-negative patient controls using DPO-multiplex PCR. Both the presence and extent of deletion were verified by simplex PCR spanning the promoter region (PM) and 18 exons including exons 3, 4, 6, 8, 12, 13, 17, 19, 43-48, 50-52, and 60 in all 120 controls. Results : DPO-multiplex PCR showed 100% sensitivity and specificity for the detection a deletion. However, it showed 97.1% sensitivity and 100% specificity for determining the extent of deletions. Conclusion : The DPO-multiplex PCR method is a useful molecular test to detect large deletions of DMD for the diagnosis of patients with DMD/BMD because it is easy to perform, fast, and cost-effective and has excellent sensitivity and specificity.
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문제 정의
DPO는 polydeoxyinosine 연결에 의해 두 영역으로 분리된 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)로 표적 DNA 염기서열과의 교잡반응에 높은 특이적 반응을 보여 복합 중합효소 연쇄반응의 정확도를 높여준다. 본 연구에서는 3 그룹을 대상군으로 DMD 유전자의 결실돌연변이 검색을 위한 DPO-복합 중합효소 연쇄반응법의 특이성과 민감성을 알아보고자 하였다.
본 연구에서는 건강한 남자 정상군과 기존의 복합 중합효소 연쇄반응에서 양성반응과 음성반응이 확인된 환자들을 대상으로 DPO-복합 중합효소 연쇄반응법의 특이성과 민감성을 알아보고자 하였다.
그러나 이러한 복합 중합효소 연쇄반응은 하나의 시험관에 여러 개의 시발체에 해당하는 DNA 조각(oligonucleotide)이 포함되어 이들 DNA 조각들 서로 간의 간섭에 의한 위양성 및 위음성의 PCR 증폭 가능성을 내포하고 있다. 최근에 개발된 poly(I) linker를 이용한 DPO 방법을 도입하여 중합효소 연쇄반응의 priming 과정을 훨씬 정교하게 함으로써 DMD 유전자의 복합 중합효소 연쇄반응에서 나타는 문제점을 해결하고자 하였다.
제안 방법
DPO 복합적 중합연쇄반응의 조건으로는 50 ng의 주형 DNA와 DMD mix, 8-Mop solution, master mix(See Gene, Seoul, Korea) 등을 혼합하여 총 양을 20 µL로, 94 ℃에서 30초의 변성, 60℃에서 90초 교잡, 그리고 72℃에서 90초 신장과정을 35회 반복하였다.
DPO-복합 중합효소 연쇄반응에 사용된 시발체는 씨젠 (SeeGen, Seoul, Korea)에서 개발한 DPO 방식을 바탕으로 poly(I) linker로 연결된 안정판과 결정판을 갖는 시발체로 구성된 PM부위와 exons 3, 4, 6, 8, 12, 13, 17, 19, 43-48, 50-52, 60을 포함하는 19쌍들을 세 개의 그룹으로 나누었다(Fig. 2). DPO 복합적 중합연쇄반응의 조건으로는 50 ng의 주형 DNA와 DMD mix, 8-Mop solution, master mix(See Gene, Seoul, Korea) 등을 혼합하여 총 양을 20 µL로, 94 ℃에서 30초의 변성, 60℃에서 90초 교잡, 그리고 72℃에서 90초 신장과정을 35회 반복하였다.
기존 방법의 복합 중합효소 연쇄반응은 18쌍의 DMD 유전자 exon 및 PMter에 대한 시발체를 사용하여 6세트의 복합적 중합효소 연쇄반응으로 확인하였다10, 14). 결실 돌연변이에 대한 검증을 위하여 18쌍의 각각의 시발체를 GJB2(13q11)에 대한 시발체를 PCR 증폭 대조군으로 포함하여 이중 중합효소 연쇄반응(duplex PCR)을 하였다. 중합효소 연쇄반응 과정은 최종용적이 20 µL로, 100 ng의 주형 DNA, 1 µM의 각 시발체들, 200µM의 dNTP와 1 unit의 Taq 중합효소(Promega, WI, USA)를 사용하여 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 교잡, 그리고 72℃에서 45초간 신장반응을 30회 반복하여 증폭하였다.
방법 : 50명의 건강한 남자 대조군, 50명의 결실 돌연변이를 갖고 있는 양성반응 환자그룹 그리고 20명의 결실 돌연변이를 가지고 있지 않은 음성반응 환자 그룹으로 구성된 3 그룹을 대상으로 DPO-복합 중합효소 연쇄반응법을 이용하여 실험하였다. 이들 120명의 실험군 모두 PMter영역과 exon 3, 4, 6, 8, 12, 13, 17, 19, 43-48, 50-52, 60을 포함하는 18개의 exon에서의 결실의 여부와 결실 범위를 확인하였다.
DPO 복합적 중합연쇄반응의 조건으로는 50 ng의 주형 DNA와 DMD mix, 8-Mop solution, master mix(See Gene, Seoul, Korea) 등을 혼합하여 총 양을 20 µL로, 94 ℃에서 30초의 변성, 60℃에서 90초 교잡, 그리고 72℃에서 90초 신장과정을 35회 반복하였다. 복합 중합효소 연쇄반응의 산물을 에티디움브로마이드가 포함된 1.5% 아가로오스 겔에 전기영동하여 PCR 증폭의 여부로 결실 돌연변이를 확인하였다.
방법 : 50명의 건강한 남자 대조군, 50명의 결실 돌연변이를 갖고 있는 양성반응 환자그룹 그리고 20명의 결실 돌연변이를 가지고 있지 않은 음성반응 환자 그룹으로 구성된 3 그룹을 대상으로 DPO-복합 중합효소 연쇄반응법을 이용하여 실험하였다. 이들 120명의 실험군 모두 PMter영역과 exon 3, 4, 6, 8, 12, 13, 17, 19, 43-48, 50-52, 60을 포함하는 18개의 exon에서의 결실의 여부와 결실 범위를 확인하였다.
이러한 단점을 보완하기 위해 Dual Priming Oligonucleotide(DPO) system을 DMD 유전자의 결실돌연변이 검색에 도입하였다. DPO는 polydeoxyinosine linker(poly(I) linker)를 시발체 사이에 삽입함으로써 길이가 서로 다른 두개의 시발체 부위(5'-말단 안정판과 3'-말단 결정판)를 가져 기존의 시발체와 구조적, 기능적으로 차별화 된다.
하지만 이 방법의 단점은 하나의 시험관 안에 복합적인 시발체가 존재하여 정확한 반응 조건을 찾기 힘들 뿐 아니라 시발체 상호간의 간섭으로 중합효소 연쇄반응의 비특이적 생성물을 빈번하게 일으켜 잘못된 음성 또는 양성 결과를 가져올 수 있다. 이런 문제를 보완하고자 Dual Primer Oligonucleotide(DPO) 방법을 도입하였다. DPO는 polydeoxyinosine 연결에 의해 두 영역으로 분리된 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)로 표적 DNA 염기서열과의 교잡반응에 높은 특이적 반응을 보여 복합 중합효소 연쇄반응의 정확도를 높여준다.
중합효소 연쇄반응 과정은 최종용적이 20 µL로, 100 ng의 주형 DNA, 1 µM의 각 시발체들, 200µM의 dNTP와 1 unit의 Taq 중합효소(Promega, WI, USA)를 사용하여 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 교잡, 그리고 72℃에서 45초간 신장반응을 30회 반복하여 증폭하였다.
중합효소 연쇄반응 과정은 최종용적이 20 µL로, 100 ng의 주형 DNA, 1 µM의 각 시발체들, 200µM의 dNTP와 1 unit의 Taq 중합효소(Promega, WI, USA)를 사용하여 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 교잡, 그리고 72℃에서 45초간 신장반응을 30회 반복하여 증폭하였다. 증폭 산물은 에티디움브로마이드가 포함된 1.2% 아가로오스 겔에서 전기영동하여 exon의 결실여부를 확인하였다.
대상 데이터
50명의 건강한 남자와 기존 방법의 복합 중합효소 연쇄반응에서 양성결과를 얻은 50명의 환자, 그리고 음성 결과를 얻은 20명의 환자, 3개의 그룹을 대상으로 하였다. 게놈 DNA는 120명의 남자의 말초혈액으로 부터 PureGene Blood Kit(Gentra, MN, USA)를 이용하여 분리하였다.
50명의 건강한 남자와 기존 방법의 복합 중합효소 연쇄반응에서 양성결과를 얻은 50명의 환자, 그리고 음성 결과를 얻은 20명의 환자, 3개의 그룹을 대상으로 하였다. 게놈 DNA는 120명의 남자의 말초혈액으로 부터 PureGene Blood Kit(Gentra, MN, USA)를 이용하여 분리하였다. 기존 방법의 복합 중합효소 연쇄반응은 18쌍의 DMD 유전자 exon 및 PMter에 대한 시발체를 사용하여 6세트의 복합적 중합효소 연쇄반응으로 확인하였다10, 14).
3). 위 2명의 환자는 기존 방법에 의해 exon 13, 17, 19, 43에서 결실을 확인한 환자와 exon 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52에서 결실을 확인했던 환자이다. PM 부분과 exon 8, 12 및 13에 해당하는 exon의 증폭이 불일치하였다.
성능/효과
120명의 정상군과 환자군을 대상으로 DPO-복합 중합효소 연쇄반응을 실험한 결과 PM 부위와 exon 8, 12, 13에 해당하는 증폭이 2명의 환자에게서 동일하게 이루어지지 않았으며, 기존 방법에 의한 결과와 일치하지 않았다. DPO-복합 중합효소 연쇄반응에서 결실된 exon이 불연속성을 보이는 것으로 보아 중합효소 연쇄반응 과정 중의 잘못으로 여겨진다.
따라서 50-60%의 높은 비중을 차지하는 거대 결실돌연변이의 검색이 우선되어져야 하며, 방법적인 면에서 간단하고 저렴해야 한다. DMD 유전자의 exon 3-17 그리고 43-53 범위에서의 고안되어 DMD 유전자 결실돌연변이의 98%를 검출할 수 있는 민감도10)와 DPO 방법에 의해 만들어진 이중의 교잡과정을 통해 priming의 정확도를 높인 이 방법은 높은 수준의 특이도와 민감도를 보이며, 간단한 방법과 저렴한 비용으로 빠른 시간 안에 거대결실변이를 진단할 수 있어 듀시엔/베커형 근이영양증 환자들의 DMD 유전자의 거대 결실돌연변이에 대한 유용한 진단방법으로 생각된다.
결과 : DPO-복합 중합효소 연쇄반응법은 결실 여부를 발견하는데 100%의 특이성과 민감성을 보였다. 하지만 결실 범위의 결정에는 97.
결론 : DPO-복합 중합효소 연쇄반응법은 기존의 복합 중합효소 연쇄반응법 보다 높은 분석 확실성을 보일뿐 아니라 빠르고 저렴한 비용으로 쉽게 할 수 있기 때문에 듀시엔/베커형 근이영양증 환자의 DMD 유전자의 결실돌연변이 여부를 확인하는데 유용한 방법이다.
기존방법에 의해 결실돌연변이를 확인했던 50명의 양성환자와 20명의 결실돌연변이 음성환자를 대상으로 DPO-복합 중합효소 연쇄반응을 이용하여 결실 돌연변이 여부를 확인한 결과, 2명을 제외한 모든 환자에서 기존방법으로 검증된 결실돌연변이 부위와 동일한 결실돌연변이가 확인되었다. 기존 방법에서의 결실돌연변이 부위와 일치하지 않은 결과를 보인 2명의 환자에게서 공통적으로 DPO-복합 중합효소 연쇄반응의 첫 번째 그룹에 해당하는 exon 8, PM, exon 13과 exon 12의 부위가 증폭되지 않았다(Fig. 3). 위 2명의 환자는 기존 방법에 의해 exon 13, 17, 19, 43에서 결실을 확인한 환자와 exon 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52에서 결실을 확인했던 환자이다.
50명의 정상인을 대상으로 한 DPO-복합 중합효소 연쇄반응에서 모두 결실이 없이 증폭과정이 잘 이루어 졌다. 기존방법에 의해 결실돌연변이를 확인했던 50명의 양성환자와 20명의 결실돌연변이 음성환자를 대상으로 DPO-복합 중합효소 연쇄반응을 이용하여 결실 돌연변이 여부를 확인한 결과, 2명을 제외한 모든 환자에서 기존방법으로 검증된 결실돌연변이 부위와 동일한 결실돌연변이가 확인되었다. 기존 방법에서의 결실돌연변이 부위와 일치하지 않은 결과를 보인 2명의 환자에게서 공통적으로 DPO-복합 중합효소 연쇄반응의 첫 번째 그룹에 해당하는 exon 8, PM, exon 13과 exon 12의 부위가 증폭되지 않았다(Fig.
PM 부분과 exon 8, 12 및 13에 해당하는 exon의 증폭이 불일치하였다. 정상군과 환자군에게서 DPO-복합 중합효소 연쇄반응을 통한 결실돌연변이 검색과정은 결실돌연변이의 존재 여부 확인에는 100%의 특이성과 민감성을 보였지만, 결실돌연변이의 정확한 범위를 결정하는 데는 97.1%(환자군 중 2명의 환자에서 보인 PCR의 오류)의 민감성과 특이성을 보였다(Table 1).
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
듀시엔/베커형 근이영양증은 어떤 질환인가?
듀시엔/베커형 근이영양증(DMD/BMD; OMIM#310200/30076)은 X-염색체 연관 유전질환으로 진행성 근육 퇴화를 가져오는 질환이다. 듀시엔형 근이영양증(DMD)은 어린나이에 일반적으로 나타나는 근육질환으로 남자 신생아의 3,500명 중 한 명 꼴로 발생하고, 증상은 3-4세경에 나타나기 시작한다.
듀시엔/베커형 근이영양증은 무엇을 통해 진단이 가능한가?
듀시엔/베커형 근이영양증은 근육 손상에 의해 증가되는 혈청내의 크레아틴 카이네이즈(creatine kinase, CK)의 활성도를 측정함으로써 진단이 가능하며, 또한 근육 손상의 정도를 예측할 수 있는 지표로 사용된다. 듀시엔형 근이영양증에 대한 여성 보인자의 약 50%에서 CK 값이 증가되는 것을 확인할 수 있으며, 베커형 근이영양증에 대한 여성 보인자의 30%에서 CK 값을 통한 진단이 가능하다3, 4).
듀시엔형 근이영양증의 주 증상은 무엇인가?
듀시엔형 근이영양증(DMD)은 어린나이에 일반적으로 나타나는 근육질환으로 남자 신생아의 3,500명 중 한 명 꼴로 발생하고, 증상은 3-4세경에 나타나기 시작한다. 골반대퇴근 등 하지의 근위부 근육이 먼저 이완되고 보행 장애가 주 증상으로 나타나며 대체로 지능이 저하되고, 12세 이전에 휠체어를 사용하게 되거나 30대에 일찍 사망할 수 있는, 남아에게 치명적인 질병이다1). 반면 베커형 근이영양증(BMD)은 18,500명 중 한 명 정도로 발생하고 약 12세경에 발병하고, 평균 16세 이후에 휠체어를 사용하게 되는 근육질환으로, 듀시엔형에 비하여 비교적 늦게 발병이 되며 진행도 천천히 일어난다2).
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