청국장 내에 B. cereus을 효과적으로 저지하기 위한 생물학적제어 방법의 개발을 위하여 전통적 방법으로 제조한 백태 및 흑태 청국장으로부터 총 20종의 Bacillus 속 균주를 분리하였고, 이중에서 24시간 배양액에서 B. cereus에 대한 길항활성이 가장 높은 Bacillus sp. SC-8 균주를 선별하였다. 이 균주를 B. cereus와 혼합하여 청국장을 제조한 후 길항능을 분석한 결과 청국장 발효 중에는 B. cereus에 대한 길항효과가 있었으나, 발효 후 $4^{\circ}C$ 저장 중에는 균체수가 감소하여 억제효과가 감소하는 것으로 분석되었다. 또한 대조군으로 사용하였던 Bacillus sp. SC-15 균주에서는 배양액에서는 B. cereus에 대한 길항 활성이 낮았으나 청국장 내에서는 길항효과를 보임에 따라 청국장 발효에 관여하는 균들은 배양 환경에 따라 길항물질의 생성에 차이가 있음을 보였다.
청국장 내에 B. cereus을 효과적으로 저지하기 위한 생물학적제어 방법의 개발을 위하여 전통적 방법으로 제조한 백태 및 흑태 청국장으로부터 총 20종의 Bacillus 속 균주를 분리하였고, 이중에서 24시간 배양액에서 B. cereus에 대한 길항활성이 가장 높은 Bacillus sp. SC-8 균주를 선별하였다. 이 균주를 B. cereus와 혼합하여 청국장을 제조한 후 길항능을 분석한 결과 청국장 발효 중에는 B. cereus에 대한 길항효과가 있었으나, 발효 후 $4^{\circ}C$ 저장 중에는 균체수가 감소하여 억제효과가 감소하는 것으로 분석되었다. 또한 대조군으로 사용하였던 Bacillus sp. SC-15 균주에서는 배양액에서는 B. cereus에 대한 길항 활성이 낮았으나 청국장 내에서는 길항효과를 보임에 따라 청국장 발효에 관여하는 균들은 배양 환경에 따라 길항물질의 생성에 차이가 있음을 보였다.
For the development of a biological control method against B. cereus in cheonggukjang, 20 Bacillus spp. were isolated from the naturally fermented baektae and heuktae cheonggukjang, identified by using 16S rDNA sequences. Among the isolated strains, Bacillus sp. SC-8 was selected using the B. cereus...
For the development of a biological control method against B. cereus in cheonggukjang, 20 Bacillus spp. were isolated from the naturally fermented baektae and heuktae cheonggukjang, identified by using 16S rDNA sequences. Among the isolated strains, Bacillus sp. SC-8 was selected using the B. cereus lawn cell assay as an antagonistic microorganism against B. cereus. The culture medium of Bacillus sp. SC-8 after 24 hr of incubation at $37^{\circ}C$ also evidenced a high level of antagonistic activity. In cheonggukjang fermented with the mixed culture of Bacillus sp. SC-8 and B. cereus, antagonistic effect against B. cereus was maintained during the fermentation of cheonggukjang, while its effect was reduced during storage at $4^{\circ}C$ due to the decrement of cell population of Bacillus sp. SC-8. In Bacillus sp. SC-15, which was utilized a control, antagonistic activity against B. cereus was not demonstrated on the lawn cell plate assay and culture medium, but its effects were detected in cheonggukjang. Therefore, the production of antagonistic substances of Bacillus spp. depends on the fermentative environment.
For the development of a biological control method against B. cereus in cheonggukjang, 20 Bacillus spp. were isolated from the naturally fermented baektae and heuktae cheonggukjang, identified by using 16S rDNA sequences. Among the isolated strains, Bacillus sp. SC-8 was selected using the B. cereus lawn cell assay as an antagonistic microorganism against B. cereus. The culture medium of Bacillus sp. SC-8 after 24 hr of incubation at $37^{\circ}C$ also evidenced a high level of antagonistic activity. In cheonggukjang fermented with the mixed culture of Bacillus sp. SC-8 and B. cereus, antagonistic effect against B. cereus was maintained during the fermentation of cheonggukjang, while its effect was reduced during storage at $4^{\circ}C$ due to the decrement of cell population of Bacillus sp. SC-8. In Bacillus sp. SC-15, which was utilized a control, antagonistic activity against B. cereus was not demonstrated on the lawn cell plate assay and culture medium, but its effects were detected in cheonggukjang. Therefore, the production of antagonistic substances of Bacillus spp. depends on the fermentative environment.
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문제 정의
이에 본 연구에서는 환경 친화적인 생물학적 제어 방법 개발의 일환으로 자연 발효된 청국장으로부터 발효 미생물을 분리 동정하고, B. cereus에 길항능이 우수한 균주를 선별하여 청국장을 제조한 후 B. cereus에 대한 저지능을 분석함으로써 산업적 장류 생산의 안전성에 대한 자료를 제시하고자 한다.
제안 방법
들을 5 mL LB 액체배지에 37℃에서 24시간 동안 전배양을 하고, 1×107 cells/mL의 B. cereus KCTC 1012가 깔려 있는 LB 한천 고체배지 위에 직경 6 mm 종이 디스크를 올려놓고 여기에 24시간 동안 1×107 cells/mL 농도로 전배양된 각 균주 10 µL를 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였으며, B. cereus의 생육저지환의 생성 유무에 따라 길항 균주를 선별하였다.
분리된 균주들의 염기서열 결정을 위하여 universal primer인 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')와 1492R(5'-GGYTACCTTGTTACGACTT-3')을 이용하여 PCR 반응을 실시하였다.
선별 균주의 배양액을 이용하여 B. cereus에 대한 길항능을 분석하였다. 선별된 균주를 LB 액체배지 50 mL에 접종하여 37℃ 에서 12, 24, 36, 48시간 배양한 후, 배양액을 12,000×g에서 10분간 원심분리 후 그 상등액을 0.
선별균주의 B. cereus에 대한 길항능이 청국장 제조 시에도 동일한 길항효과가 나타나는지를 분석하기 위하여 선별 균주와 B. cereus를 혼합 발효하여 청국장을 제조하였고, 각 균주 수의 변화를 분석하였다. 대조군으로 배양액에서의 길항효과가 낮은 Bacillus sp.
선별된 균주를 LB 액체배지 50 mL에 접종하여 37℃ 에서 12, 24, 36, 48시간 배양한 후, 배양액을 12,000×g에서 10분간 원심분리 후 그 상등액을 0.2 µm membrane filter를 이용하여 여과하였다.
여과한 배양액과 LB 액체배지를 1:1로 혼합하고, 여기에 1×107 cells의 B. cereus KCTC 1012를 접종하였다.
증폭된 DNA 밴드는 Gene Clean Kit(WelPrepTM Gel Extraction Kit, Daegu, Korea)를 이용하여 정제하고, (주)마크로젠 유전자 해석센터(Seoul, Korea)에 염기서열 분석을 의뢰하였다. 염기서열 분석을 통하여 얻은 각 균주의 염기서열은 Blast Network Service를 이용하여 NCBI GenBank database의 염기서열과 비교함으로써 계통분류학적 유연관계를 분석하였다.
cereus KCTC 1012를 접종하였다. 접종 후 4시간 단위로 600 nm에서 흡광도를 측정하여 길항 미생물이 분비하는 길항물질의 길항능을 분석하였다.
제조 직후 및 4℃ 냉장실에 보관하면서 24시간 간격으로 3일 동안 청국장 3 g씩을 채집하여 MYP 고체배지(DifcoTM MYP Agar 900 mL, DifcoTM Egg Yolk 12.5 mL)에 10−5-10−7배 희석 도말하고 24시간 배양 후 콜로니 형태를 통해 B. cereus에 대한 선별 균주의 길항능을 분석하였다.
증자된 대두(백태, (주)상촌식품) 30 g에 각각 1×107 cells/mL의 선별된 균주와 B. cereus KCTC 1012를 10−5배 희석하여 100 µL 접종하고, 청국장 발효기(엔유씨 전자, NY-7500, Daegu, Korea)에 넣어 24시간 동안 37℃에서 청국장을 제조하였다.
PCR 실험 조건은 97℃에서 5분 동안 변성시킨 후 94℃에서 1분, 56℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초 동안 DNA 증폭 반응을 30회 실시하고, 마지막으로 72℃에서 4분간 반응시켰다. 증폭된 DNA 밴드는 Gene Clean Kit(WelPrepTM Gel Extraction Kit, Daegu, Korea)를 이용하여 정제하고, (주)마크로젠 유전자 해석센터(Seoul, Korea)에 염기서열 분석을 의뢰하였다. 염기서열 분석을 통하여 얻은 각 균주의 염기서열은 Blast Network Service를 이용하여 NCBI GenBank database의 염기서열과 비교함으로써 계통분류학적 유연관계를 분석하였다.
대상 데이터
대조군으로 배양액에서의 길항효과가 낮은 Bacillus sp. SC-15 균주를 사용하였다. Bacillus sp.
cereus에 대한 길항활성이 가장 높은 Bacillus sp. SC-8 균주를 선별하였다. 이 균주를 B.
발효균주의 분리 및 동정을 위해 (주)상촌 식품(Yongin, Korea)으로부터 제공받은 자연 발효된 백태 및 흑태 청국장 3 g을 시험관에 넣고, 멸균수 30 mL을 가한 후 80℃에서 15분간 중탕하였다. 이 후 상등액을 LB(DifcoTM Luria Bertani, Detroit, MI, USA) 고체배지에 도말하고 호기적 조건하 37℃에서 12시간 배양하여 콜로니 형태의 차이를 기준으로 균주를 분리하였다.
성능/효과
또한 대조군으로 사용하였던 Bacillus sp. SC-15 균주에서는 배양액에서는 B. cereus에 대한 길항 활성이 낮았으나 청국장 내에서는 길항효과를 보임에 따라 청국장 발효에 관여하는 균들은 배양 환경에 따라 길항물질의 생성에 차이가 있음을 보였다.
subtilis NBRC 13719와 Bacillus sp. SC-15는 B. subtilis 보다는 B. amyloliquefaciens ATCC 23350과 높은 유사도를 보였으며, 이는 부분 염기서열 분석에 의해 동정된 결과와 일치함을 보였다. 이들의 계통분류학적 유연관계는 Fig.
SC-15는 배지와 배양액을 이용한 길항능력 분석에서는 B. cereus의 성장을 억제하지 못하였으나, 직접적인 청국장 발효에서는 발효 시점부터 후숙 기간동안 균수가 1×107 cells/mL 이상을 유지되면서 지속적으로 B. cereus의 성장을 억제하는 결과를 보였다.
cereus에 대한 길항능이 있는 선별 균주 Bacillus sp. SC-8를 24시간 배양한 배양액을 B. cereus 배지에 50% 첨가하여 B. cereus의 성장 저지능을 분석한 결과, 배양 12시간까지 B. cereus균의 성장이 저지됨을 알 수 있었다(Fig. 3). Bacillus sp.
이러한 결과를 통해 청국장 발효에 관여하는 균들은 그 생육환경에 따라 길항물질 생성의 차이를 보이고 있다. 따라서 이러한 길항효과가 높은 균주를 이용하여 청국장을 제조한다면, 안전하고 환경 친화적인 생물학적 방법으로 유해균인 B. cereus의 생장을 억제할 뿐만이 아니라 저장성도 향상시킬 수 있는 것으로 사료된다.
수집된 백태 및 흑태 전통발효 청국장들로부터 총 20종류의 균이 분리되었으며, 이 중 백태 청국장에서는 14종, 흑태 청국장에서는 6종이 분리되었다. 분리된 균주들은 1차적으로 400-500 bp의 16S rDNA 부분 염기서열을 분석한 결과 대부분 B. subtilis, B. licheniformis와 97% 이상의 상동성을 보였으며, 백태 청국장으로부터 분리된 14종은 B. subtilis와 B. licheniformis의 비율이 1:1로 나타났으며, 흑태 청국장으로부터 분리된 6종은 1종을 제외하고는 모두 B. subtilis와 높은 상동성을 보였다(Table 1). 이는 같은 발효 장소라 할지라도 재료의 차이에 따라 발효에 관여하는 균의 차이가 있음을 보여주고 있으나, Lee 등(26)에 의한 경기 용인, 안성, 광주 및 강원 오대산 지역의 전통 청국장으로부터 분리된 발효균 대부분이 B.
수집된 백태 및 흑태 전통발효 청국장들로부터 총 20종류의 균이 분리되었으며, 이 중 백태 청국장에서는 14종, 흑태 청국장에서는 6종이 분리되었다. 분리된 균주들은 1차적으로 400-500 bp의 16S rDNA 부분 염기서열을 분석한 결과 대부분 B.
SC-8 균주를 선별하였다. 이 균주를 B. cereus와 혼합하여 청국장을 제조한 후 길항능을 분석한 결과 청국장 발효 중에는 B. cereus에 대한 길항효과가 있었으나, 발효 후 4℃ 저장 중에는 균체수가 감소하여 억제효과가 감소하는 것으로 분석되었다. 또한 대조군으로 사용하였던 Bacillus sp.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
청국장의 생리활성 기능은 무엇인가?
청국장은 대두를 이용한 전통발효식품으로 최근에는 항암, 항산화, 혈당조절, 혈압상승 억제, 면역증강, 혈전용해 및 항균효과 등 각종 유용한 생리활성 기능이 보고됨에 따라 기능성 건강식품으로 관심이 증가하고 있다(1-7). 그러나 청국장은 각 지방 또는 가정마다 제조 방법이 일정하지 않아 품질이 균일하지 못하며, 발효 시 생성되는 암모니아 화합물의 독특한 냄새(8,9), 곰팡이류의 오염 등 저장성 문제로 소비자들이 기피하는 경향이 있다.
토양 등 생활환경 주변에 널리 분포하고 있으며 국내 전통 장류 내 오염균 중 하나인 Bacillus cereus의 특징은 무엇인가?
subtilis 및 B. licheniformis와 같은 속으로, 토양 등 생활환경 주변에 널리 분포하고 있으며, 열처리에 견딜 수 있는 내생포자를 생성하여 일반적인 살균으로는 사멸되지 않으며, 독성 물질을 생성하여 식중독을 유발할 수 있다(11,12). 이에 2006년 식품의약품안전청(KFDA)에서는 장류 식품 중에 유해한 오염균으로 B.
유해균으로부터 장류 내 오염억제 및 저장성을 향상시키기 이한 생물학적 방법으로는 어떤 연구가 진행되고 있는가?
유해한 균으로부터 장류 내 오염억제 및 저장성을 향상시키기 위하여 장류 업체들은 물리적 또는 화학적 방법들을 사용하기도 하지만(13-19), 장류 제품은 그 특성상 발효균의 존재 하에 일정기간 동안 저장하면서 섭취하는 식품이기에 친환경적인 생물학적 방법이 더 적합하다. 생물학적 방법으로 내성에 문제가 많은 항생제를 대체할 수 있는 길항 미생물 및 이 미생물이 생산하는 길항물질에 대한 연구가 많이 진행되고 있다(20,21).
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