[논문]즉석조리식품에서의 Bacillus cereus오염실태조사 및 생육 pattern 분석

김순한; 김미경; 강민철; 손영욱; 이창희; 김인복; 이영자; 최수영

doi:10.5352/jls.2004.14.4.664

즉석조리식품에서의 Bacillus cereus오염실태조사 및 생육 pattern 분석
Isolation and Growth Pattern of Bacillus cereus from Ready-to-Eat Foods. 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.14 no.4 = no.65, 2004년, pp.664 - 669

김순한 (부산지방식품의약품안전청) , 김미경 (부산지방식품의약품안전) , 강민철 (부산지방식품의약품안전) , 손영욱 (부산지방식품의약품안전) , 이창희 (부산지방식품의약품안전) , 김인복 (부산지방식품의약품안전) , 이영자 (부산지방식품의약품안전) , 최수영 (부산지방식품의약품안전청)

초록
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국민 다소비 식품인 생선회, 패류 등의 횟감류 118건, 김밥, 햄버거 등의 도시락류 82건 및 기타 ready-to-eat(RTE) 식품 40건, 총 240건을 대상으로 Bacillus cereus의 오염실태를 조사한 결과, 횟감류 16건(13.6%), 도시락류 17건(20.7%), 기타 RTE 식품에서 3건(7.5%), 총 36건(15.0%)에서 B. cereus가 검출되었다. B. cereus의 검출은 polymyxin B를 첨가한 TSB배지를 사용한 증균배양 후, MYP agar에서 전형적인 집락을 선별하였으며, 선별된 균주들을 대상으로 그람염색, oxidase test, 혈액한천배지에서의 rhizoid growth, $\beta$-용혈성 유ㆍ무등을 통해 추정 균주들을 분리하였다. API 50CHB/20E system을 통한 생화학적 분석과 motility시험 등을 행하여 최종적으로 B. cereus로서 동정ㆍ확인하였다. 확인된 36균주 중 28균주(77.8%)가 BCET-RPLA 시험을 통해 BHI broth에서 설사형 독소를 생성하는 것으로 나타났다. 아울러 항생제 감수성 시험 결과 분리균들은 ampicillin (100%), penicillin G (100%) 및 rifampicin (69.5%)에 내성을 보였으며, gentamicin (100%), vancomycin (100%), bacitracin (86.1%), chloram-phenicol (97.2%), erythromycin (69.4%), kanamycin (86.1%) 및 streptomycin (97.2%)에 감수성을 나타내었다. B. cereus의 생육은 온도와 시간에 밀접한 관련성을 보였는데, 냉장온도인 1$0^{\circ}C$이하에서는 균의 생육이 상당히 저해된 반면, 2$0^{\circ}C$ 및 3$0^{\circ}C$에 보관시에는 급격한 증식을 보여 기온이 상승하는 하절기에 특히 많은 주의가 필요하다고 판단되었다.

Abstract ▼ AI-Helper

The contamination of Bacillus cereus was investigated in 240 RTE (ready-to-eat) food samples including 118 seafoods, 82 Korean packaged meals and 40 other RTE foods. Many B. cereus presumptive strains were isolated from the enrichment culture in Tryptic Soy Broth (TSB) added polymyxin, followed by selective culture in Mannitol Egg Yolk Polymyxin (MYP) agar and Gram staining. A total of 36 strains (16 in seafoods, 17 in Korean pack-aged meals and 3 in other RTE foods) were identified as B. cereus by the analysis of 61 biochemical tests of the API 50CHB/20E system test and supplementary tests of $\beta$-hemolysis, rhizoid growth, motility and oxidase activity. The 28 strains out of 36 B. cereus isolates produced diarrhoeal enter-otoxin in Brain Heart Infusion (BHI) broth. All isolates were resistant to ampicillin and penicillin antibiotics, and most of them were susceptible to gentamicin, vancomycin, bacitracin, chloram-phenicol, kanamycin and streptomycin. The growth of B. cereus was affected by environmental temperature and incubation time. Culture with temperature under 1$0^{\circ}C$ effectively restricted the growth of B. cereus.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

이번 연구의 목적은 점차적으로 증가하고 있는 세레우스식중독의 발생가능성에 대한 기초자료를 제공하기 위하여, 다양한 식품 중 특히 국민 다소비 식품이며 B. cereus의 오염가능성이 높은 생선회, 패류 등의 횟감류와 김밥, 햄버거 등의 도시락류 및 기타 ready-to-eat (RTE) 식품들을 대상으로 B. cereusS] 오염실태를 조사하였다. 아울러 세레우스 식중독발생예방에 활용하고자 분리균에 대한 독소생성능과 온도 및시간에 따른 생육 pattern 분석을 실시하였다.

가설 설정

Fig. 2. Isolation rates of B. cereus with variable seasonal temperature. Table 3.

제안 방법

3 (bioMerieux, Marcy KEtoile, France)로서 처리되었다. API 50 CHB를 사용하여 49개의 당발효능을 조사하였고, API 20E를 사용하여 12가지 의 생화학적 시험 (ONPG, ADH, LDC, ODC, CIT, H₂S, URE, TDA, IND, VP, GEL and NIT)을 행하였으며, 실험은 제조사의 지시에 따라 실험하였다.
B. cereus 분리용 배지인 MYP agar에서 혼탁한 환을 가지는 분홍색의 전형적인 집락을 대상으로 그람염색, oxidase test 및 혈액한천배지에서의 B-용혈성 및 rhizoid growth여부를 조사하여, 그람양성의 간균이고 oxidase 음성 및 혈액한천배지에서 6-용혈성을 보이며 rhozoid growth를 보이지않는 균주들을 분리하였다. 분리된 균주를 대상으로 API 50CHB/ 20E test kit를 사용한 생화학 시험을 실시하여 API LAB Plus softwares.
MYP Agar에서 혼탁한 환을 갖는 분홍색의 전형적인 집락들을 선별하여 혈액한천배지(아산제약, Korea)에이식하였고, 30℃에서 24시간 배양 후 그람염색을 실시하여그람양성의 긴 간균으로, oxidase 음성 및 B-용혈성을 보이 며 rhizoid growth를 보이지 않는 균주들을 분리하였다.
동정된 36균주를 디스크법에 따라 항생제 감수성검사를 실시하였다. Mueller-Hinton broth (Difco) 에 접종하여 30℃ 에서 24시간 배양시킨 균을 멸균된 액체배지로 희 석하여 표준탁도액 (McFarland No. 0.5)의 농도와 같도록 한 훅, 멸균된 면봉을 이용하여 Mueller-Hinton agar (Difco)에 균등하게 도말하였다. 곧이어 항생제 감수성 실험용 disc (Oxoid)들을 배지위에 놓고 가볍게 밀착시킨 후, 32 C에서 18시간동안 배양한 후 저지환을 측정하였다.
각 시료들로부터 분리된 분리균은 61개의 생화학적 시험들을 통해서 동정되었으며, data는 APILAB Plus software V3.3.3 (bioMerieux, Marcy KEtoile, France)로서 처리되었다. API 50 CHB를 사용하여 49개의 당발효능을 조사하였고, API 20E를 사용하여 12가지 의 생화학적 시험 (ONPG, ADH, LDC, ODC, CIT, H₂S, URE, TDA, IND, VP, GEL and NIT)을 행하였으며, 실험은 제조사의 지시에 따라 실험하였다.
5)의 농도와 같도록 한 훅, 멸균된 면봉을 이용하여 Mueller-Hinton agar (Difco)에 균등하게 도말하였다. 곧이어 항생제 감수성 실험용 disc (Oxoid)들을 배지위에 놓고 가볍게 밀착시킨 후, 32 C에서 18시간동안 배양한 후 저지환을 측정하였다. 이번 연구에 사용한 항생제는 ampicillin (10 pg), bacitracin (10 units), chloramphenicol (30 pg), erythromycin (15 jig), gentamicin (10 Jig), kanamycin (30 jig), penicillin G (10 units), rifampicin (5 Ug), streptomycin (10 jig), tetracycline (30 pg) 및 vancomycin (30ug)이며, 결과의 판독은 National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) 법 [12] 에준하였다.
1 ml를 10 ml TSB에 접종하여 각 온도별(4℃, 10℃, 20℃ 및 30℃)로 보관하면서 시간별 (4시간 후, 7시간 후, 24시간 후)로 균수를 측정하였다. 균수의 측정은 멸균생리식염수를 사용하여 단계별로 희석한 액을 pour plate method로서 MYP agar에 접종하여 30℃ 24 — 48시간 배양하여 혼탁한 환을 가지는 분홍색의 전형적인 집락의 수를 측정하였다.
다양한 즉석조리식품에서의 미생물 위해 관리를 위해 온도-시간의 요소는 실제 생산 및 유통단계에서 중요한 관리요소(critical control point)라는 판단에서 B. cereus KCCM 40935와 분리균인 18PE (독소생 성균) 및 228SF (독소비 생 성균)의 3균주를 선정하여 온도-시간에 따른 생육 pattern을 조사하였다. Fig.
cereus로 확인 . 동정된 36균주를 디스크법에 따라 항생제 감수성검사를 실시하였다. Mueller-Hinton broth (Difco) 에 접종하여 30℃ 에서 24시간 배양시킨 균을 멸균된 액체배지로 희 석하여 표준탁도액 (McFarland No.
cereus의 검출은 polymyxin B를 첨가한 TSB배지를 사용한 증균배양 후, MYP agar에서 전형적인 집락을선별하였으며, 선별된 균주들을 대상으로 그람염색, oxidase test, 혈액한천배지에서의 rhizoid growth, 。-용혈성 유 . 무등을 통해 추정 균주들을 분리하였다. API 50CHB/20E system을 통한 생화학적 분석과 motility시험 등을 행하여최종적으로 B.
유 . 무를 확인하였으며, oxidase test는 filter paper 상에서 oxidase reagent (bioMerieux)를 사용하여 조사하였으며, 운동성을 알아보기 위하여 0.1% beef extract# 첨가한 motility test medium (Difco, U.S.A.)를 사용하여 30℃ 에서 24시간동안 배양하면서 관찰하였다.
cereus 분리용 배지인 MYP agar에서 혼탁한 환을 가지는 분홍색의 전형적인 집락을 대상으로 그람염색, oxidase test 및 혈액한천배지에서의 B-용혈성 및 rhizoid growth여부를 조사하여, 그람양성의 간균이고 oxidase 음성 및 혈액한천배지에서 6-용혈성을 보이며 rhozoid growth를 보이지않는 균주들을 분리하였다. 분리된 균주를 대상으로 API 50CHB/ 20E test kit를 사용한 생화학 시험을 실시하여 API LAB Plus softwares. 확인하였다.
설사형 장독소의 생성유무는 30℃, 24시간동안 Brain Heart Infusion broth (Oxoid, England)에서 배양한 배양액을 원심분리(10, 000 rpm, 20 min)하여 균체를 제거한 배양상등액을대상으로 B. cereus enterotoxin reverse passive latex agglutination (BCET-RPLA) test kit (Oxoid)를 사용하여 조사하였으며, 실험방법은 제조사의 지시에 따랐다.
cereusS] 오염실태를 조사하였다. 아울러 세레우스 식중독발생예방에 활용하고자 분리균에 대한 독소생성능과 온도 및시간에 따른 생육 pattern 분석을 실시하였다.
온도 및 시간에 따른 생육특성의 분석을 위해 표준균주인 B. cereus KCCM 40935와 분리균인 18PE (독소생 성균) 및 228SF(독소비생성균)의 3균주를 선정하여 각각 TSB에서 하룻밤동안 전 배 양한 후 배 양액 0.1 ml를 10 ml TSB에 접종하여 각 온도별(4℃, 10℃, 20℃ 및 30℃)로 보관하면서 시간별 (4시간 후, 7시간 후, 24시간 후)로 균수를 측정하였다. 균수의 측정은 멸균생리식염수를 사용하여 단계별로 희석한 액을 pour plate method로서 MYP agar에 접종하여 30℃ 24 — 48시간 배양하여 혼탁한 환을 가지는 분홍색의 전형적인 집락의 수를 측정하였다.

대상 데이터

2003년 4월부터 10월까지 부산 및 경남일대의 횟집, 재래시장 등의 소규모제조업소와 백화점, 할인점 등의 대규모 업소에서 생선회, 패류 등의 횟감 118건, 김밥, 햄버거, 샌드위치 등의 도시락류 82건 및 기타 즉석조리식품 40건 등 총 240 건을 구입하여 시료로 사용하였다. 포장된 경우를 제외한 모든 시료들은 sterile sampling bag을 사용하여 채취하였고, 얼음을 채운 ice box에 보관하여 실험실로 운반하였으며, 도착즉시 실험에 사용하였다.
표준균주로는 Bacillus cereus KCCM 40935, B. cereus KCTC 1661, B. cereus KCTC 1092, B. cereus KCTC 3062, Bacillus fhuringiensis KCCM 41613 및 Bacillus mycoides KCCM 41606을 사용하였다.

이론/모형

곧이어 항생제 감수성 실험용 disc (Oxoid)들을 배지위에 놓고 가볍게 밀착시킨 후, 32 C에서 18시간동안 배양한 후 저지환을 측정하였다. 이번 연구에 사용한 항생제는 ampicillin (10 pg), bacitracin (10 units), chloramphenicol (30 pg), erythromycin (15 jig), gentamicin (10 Jig), kanamycin (30 jig), penicillin G (10 units), rifampicin (5 Ug), streptomycin (10 jig), tetracycline (30 pg) 및 vancomycin (30ug)이며, 결과의 판독은 National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) 법 [12] 에준하였다.

성능/효과

B. cereus로서 확인된 36균주들을 대상으로 BCET-RPLA test kit(Oxoid)를 사용하여 diarrhoeal enterotoxin 생 성유무를 검사한 결과, 28균주(77.8%)가 설사형 장독소를 생성하는것으로 나타났으며, 이는 Valero 등[16]이 보고한 32균주들 중 23균주(71.9%)가 설사형 장독소를 생성한다는 결과와 유사하였다.
2%)에 감수성을 나타내었다. B. cereus의생육은 온도와 시간에 밀접한 관련성을 보였는데, 냉장온도인 10℃이하에서는 균의 생육이 상당히 저해된 반면, 20℃ 및 30℃에 보관시에는 급격한 증식을 보여 기온이 상승하는하절기에 특히 많은 주의가 필요하다고 판단되었다.
Fig. 1에서 보는 바와 같이 총 240건의 조사대상 식품들 중 36건에서 B. cereus가 검출되어 평균 15.0%의 검출율을 나타내었는데, 이를 시료의 종류에 따라 살펴보면, 횟감류는 총 118건 중 16건(13.6%)에서, 도시락류는 총 82건 중 17건(20.7%) 에서, 기타 식품공전상 도시락류에 속하지 않는 ready-to-eat (RTE) 식품 40건에 대해서는 3건(7.5%)에서 B. cerei/s균이 검출되었다. 실제적으로 B.
cereus KCCM 40935와 분리균인 18PE (독소생 성균) 및 228SF (독소비 생 성균)의 3균주를 선정하여 온도-시간에 따른 생육 pattern을 조사하였다. Fig. 3은 B. cereus KCCM 40935의 결과로서 4℃ 및 10℃에서는 24시간까지 균의 증식이 상당히 저해되었으나, 20℃에서는 4시간 보관 시 B. cereus 균수에서 10배의 증식을보였고, 7시간 후에는 200배 이상의 증식을 보였으며, 30℃에서 보관시에는 매우 급속히 증식하여 7시간 만에 최고 균수를 나타내었으며, 분리균인 18PE 및 228SF의 경우도 유사한결과를 나타내었다(data not shown). 이러한 결과는 B.
Table 3은 B. cereus로 확인된 36균주에 대한 항생제 감수성 시험 결과로 분리 균들은 ampicillin (100%), penicillin G (100%) 및 rifampicin(69.5%)에 내성을 보였으며, gentamicin (100%), vancomycin (100%), bacitracin (86.1%), chloramphenicol (97.2%), erythromycin (30.6%), kanamycin (86.1%), streptomycin (97.2%) 및 tetracycline (66.7%)에 감수성 을 나타내었다. B.
국민 다소비 식품인 생선회, 패류 등의 횟감류 118건, 김밥, 햄버거 등의 도시락류 82건 및 기타 ready-to-eat(RTE) 식품 40건, 총 240건을 대상으로 Bacillus cere“s의 오염실태를 조사한 결과, 횟감류 16건(13.6%), 도시락류 17건(20.7%), 기타 RTE 식품에서 3건(7.5%), 총 36건(15.0%)에서 B. cereus가 검출되었다. B.
cereus의 subspecies로 고려되어야 한다고 보고하였다. 실제 표준균주들을 대상으로 API 50CHB/ 20E test kit를 사용한 생화학 시험의 결과도 유사한 결과를보이고 있는데, B. cercus KCTC 3062를 제외한 다른 B. cereus 3 균주(KCCM 40935, KCTC 1661 및 KCTC 1092)는 B. cereus/ B. mycoides의 intermediate에 속하는 것으로 조사되어, APILAB system을 이용한 B. cereus group의 정확한 분류에는 부가적인 실험들을 필요로 하였다(Table 1). Granum[기은 운동성시험을 통해 B.
8%)가 BCET-RPLA 시험을 통해 BHI broth에서 설사형 독소를 생성하는 것으로 나타났다. 아울러 항생제감수성 시험 결과 분리균들은 ampicillin (100%), penicillin G (100%) 및 rifampicin (69.5%)에 내성을 보였으며, gentamicin (100%), vancomycin (100%), bacitracin (86.1%), chloramphenicol (97.2%), erythromycin (69.4%), kanamycin (86.1%) 및 streptomycin (97.2%)에 감수성을 나타내었다. B.
an- f/zrads의 intermediate에 속하는 것으로 조사되었다. 운동성시험을 통해 B. cereus를 B. mycoides와 B. anthracis로부터 구분할 수 있었으며, 또한 oxidase 음성반응은 분리균들이 B. thurigiensise. 가능성을 배제시켜 B.
cereus 균수에서 10배의 증식을보였고, 7시간 후에는 200배 이상의 증식을 보였으며, 30℃에서 보관시에는 매우 급속히 증식하여 7시간 만에 최고 균수를 나타내었으며, 분리균인 18PE 및 228SF의 경우도 유사한결과를 나타내었다(data not shown). 이러한 결과는 B. cereiB의 생육이 온도와 시간에 매우 밀접하게 관련되어 있음을 확인시켜 주는 것으로, 특히 여름철과 같이 외기의 온도가 높아질 때 B. cereus에 의한 식중독 발생가능성이 상재하고 있어 식중독 예방을 위해선 보존 및 유통과정에서 10℃ 이하의 저온 보존이 필수적인 것으로 판단되었다. 실제 김밥을 생육배지로 이용하여 B.
cereusS] % ID (percentage of identification)7} 높은 분리균을 선택하여 그 결과를 Table 2에 나타내었다. 총 36균주들 중 15균주(41.7%)가 B. cereus로서 확인되었고, 나머 지 21균주(58.3%)가 B. cereus와 B. mycoides 및 B. an- f/zrads의 intermediate에 속하는 것으로 조사되었다. 운동성시험을 통해 B.
확인하였다. 확인된 36균주중 28균주(77.8%)가 BCET-RPLA 시험을 통해 BHI broth에서 설사형 독소를 생성하는 것으로 나타났다. 아울러 항생제감수성 시험 결과 분리균들은 ampicillin (100%), penicillin G (100%) 및 rifampicin (69.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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