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문제 정의
- 따라서, 본 연구는 강원도 정선에서 채취한 땅빈대에 대하여 항산화효과와 항염증효과 및 결장암, 위암, 유방암 세포종 등을 이용하여 암세포에 대한 세포독성을 평가하여, 땅빈대의 활용가치를 높이며, 그 우수성을 알리고자 한다.
제안 방법
- 16) 96 well plate의 각 well에 세포 부유액 0.1 mL (105 cells/mL)을 접종하여 37℃의 CO2 배양기에서 24시간 배양한 후 0.3 mg/mL 농도의 추출물 0.1 mL를 넣고 48시간 배양한 후 상등액을 제거하고, PBS (pH 7.4)에 5 mg/mL의 농도로 녹인 MTT 용액 10 µL에 배지 90 µL를 더하여 각각 well에 넣어 주고, 빛을 차단하고 3시간 반응 후 상층액을 버리고 DMSO를 100 µL씩 넣고 10분 동안 실온에서 방치한 후 ELISA reader (ELx800, Bio-Tek, USA)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교하여 cell viability를 측정하였다.
- 2으로 조정한 다음 총량을 10 mL로 하였다. 37℃에서1시간 동안 반응시킨 다음 1 mL를 취하여 여기에 2% 초산용액을 5 mL을 첨가하고 Griss 시약 (30% 초산으로 1% sulfanilic acid와 1% naphthylamine을 각각 조제하여 1:1의 비율) 0.4 mL를 가하여 실온에서 15분 동안 방치한 후, 520 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산염의 양을 산출하였다. 대조구는 시료 대신 증류수를 1 mL 가하여 상기와 같은 방법으로 실시하며, 아질산염 소거능은 추출액을 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우의 아질산염 백분율 (%)로 나타내었다.
- 발암물질인 nitrosamine 생성물질의 원인이 되는 nitrite 소거활성 평가를 통해 농도의존적으로 소거활성이 증가하는 것을 확인하였다. LPS에 의해 유도된 NO 생성도 저해효과도 RAW264.7세포주를 통해 확인하였다. 또한 현대 여성의 높은 발병률을 나타내는 유방암 대해 항암효과를 나타내고 있다.
- NO 생성 저해 효과 − RAW264.7 macrophages에 LPS를 처리한 후에 땅빈대 메탄올 추출물을 25 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL, 400 µg/mL 의 농도로 처리했을 때의 NO 생성량을 비교함으로 항염증 효과를 비교하였다.
- NO소거활성을 측정하기 위하여 RAW 264.7세포를 96 well에 well당 1×105 cells을 분주한 다음 시료를 10 µg/mL 및 100 µg/mL의 농도가 되도록 세포배양 well에 첨가하여 37℃, 48시간 동안 5% CO2의 공기조건에서 배양하였다.
- 4 mL를 가하여 실온에서 15분 동안 방치한 후, 520 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산염의 양을 산출하였다. 대조구는 시료 대신 증류수를 1 mL 가하여 상기와 같은 방법으로 실시하며, 아질산염 소거능은 추출액을 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우의 아질산염 백분율 (%)로 나타내었다.12-13)
- 하지만 결장암세포 (HT-29)에 대해서는 항암활성을 보이지 않았다. 또한 땅빈대 추출물은 정상 신장 세포 (293)를 이용하여 세포에 대한 독성을 나타내는지를 검토하였다. 25 µg/mL − 400 µg/mL의 농도에서는 세포생존율 100.
- 배양 후, 상등액 100 µL를 회수하고 여기에 동량의 Griess reagent를 첨가하여 15분 동안 방치한 다음 상등액의 발색도를 ELISA reader (ELx800, Bio-Tek, USA)를 사용하여 550 nm의 흡광도로 측정하였다. 세포가 생산한 NO를 정량하기 위하여 Sodium nitrate를 사용하여 표준곡선을 작성하였다.
- 시료에 대한 대조구로는 10 µg/mL의 LPS (Lipopolysaccharide) 처리하여 활성화를 유도한 세포를 사용하였다.
- ·OH 소거능 측정 − Hydroxyl radical 소거능 측정은 Fenton 반응으로 생성된 ·OH에 의해 핵산의 구성당인 deoxyribose가 분해되는 정도를 TBA 발색법을 이용하여 측정하였다. 시험관에 각 부위별 추출물 0.2 mL에 10 mM FeSO4/EDTA 용액 (0.2 mL, 10 mM 2-deoxyribose 0.2 mL, 0.1 M phosphate buffer pH 7.4) 1 mL를 잘 혼합한 후, 10 mM H2O2 0.2 mL를 가하고 37℃에서 4시간 반응시킨후 2.8% TCA (trichloroacetic acid)용액 1 mL과 1.0% TBA (Thiobarbituric acid)를 첨가하여 100℃에서 10분 동안 가열한 후 급속 냉각시켜 532 nm에서 UV-Visible spectrophotometer (Optizen 2120UV, Mecasys, Korea)에서 흡광도를 측정하였다.
- 아질산염 소거능 측정 − 추출물이 발암성 nitrosamine 생성의 전구물질인 아질산염을 소거하거나 또는 분해하는 작용을 알아보기 위하여 1 mM NaNO2 용액 1 mL에 시료 용액 1 mL를 첨가하고, 0.1 N HCl을 사용하여 반응용액의 pH 를 1.2으로 조정한 다음 총량을 10 mL로 하였다.
- 암세포주 및 배양조건 − 항암활성 실험에 이용된 HT-29(colon carcinoma cell, 결장암세포), NCI-N87 (stomach carcinoma cell, 위암세포), 293 (normal kidney cell, 정상신장세포)은 10% FBS (fetal bovine serum, Gibco, Rocville, MD, USA)와 1% penicillin-streptomycin (100 IU-100 µg/ mL)이 첨가된 RPMI 1640 medium에 접종하여 37℃, 5% CO2, 배양기에서 배양하였다.
- 총 플라보노이드 화합물 함량 − 1 mg/mL의 농도로 추출물을 제조하여, 20 mg/mL의 aluminum trichloide을 함유하는 100% 에탄올 (ethanol)용액 잘 혼합하여 40분 동안 실온에서 반응시킨 후 UV/VIS 분광도계 (Optizen 2120UV, Mecasys, Korea)를 이용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 9-10) 즉, 1 mg/mL로 조제한 추출물 1 mL에 Folin-Denis 시액 2 mL을 잘 넣고, 35%의 탄산나트륨 (Na2CO3)용액을 2 mL을 넣은 다음 잘 혼합하여 실온에서 30분 간 반응 후, 분광도계(ELx800, Biotec, USA)를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 탄닌산 (tannic acid)을 이용하여 작성된 표준곡선을 이용하여 검량선을 작성하여 총 페놀성 화합물의 함량을 계산하였다.
대상 데이터
- NO 생성 저해 효과 탐색 − NO소거활성은 마우스의 대식세포 세포주인 RAW264.7세포를 지시세포로 이용하여 측정하였다.
- 땅빈대 추출물의 결장암(HT-29), 위암(NCI-N87) 및 유방암세포(MDA-MB-231)에 대한 항암활성은 Fig. 3과 같고 대조군으로는 5-FU(5-Fluorouracil) 25 µg/mL을 사용하였다.
- 실험재료 − 본 실험에 사용한 땅빈대는 2008년 8월에 정선군에서 채취하여 뿌리를 포함한 전체를 음건하여 사용하였으며, 시료의 추출방법은 시료 중량 대비 20배의 메탄올을 가하여 24시간 동안 실온에서 침지하여 추출하였으며, 각 추출물은 Advantec No. 2 여과지로 여과하여 감압 농축하여 본 실험의 시료로 사용하였다.
이론/모형
- ·OH 소거능 측정 − Hydroxyl radical 소거능 측정은 Fenton 반응으로 생성된 ·OH에 의해 핵산의 구성당인 deoxyribose가 분해되는 정도를 TBA 발색법을 이용하여 측정하였다.
- MTT assay에 의한 항암효과 측정 − 암세포주에 대한 추출물의 세포독성을 평가하기 위해 MTT assay를 수행하였다.
- 전자공여능 측정 − 시료의 전자공여능은 1,1-diphenyl-2- pycrylhydrazyl (DPPH, Sigma)을 이용한 방법으로 측정하였다.
- 총 페놀성 화합물 함량 − 총페놀성 함량은 페놀성 물질이 phosphomolybdic acid와 반응하여 청색으로 발색되는 것을 이용한 Folin-Denis 방법에 따라 분석하였다.
성능/효과
- 5-FU의 항암활성은 결장암(HT-29)에 대해 53.25±1.57%, 위암(NCI-N87)에 대해 49.23±1.34%, 유방암세포 (MDA-MB231)에 대해 67.32±4.67%의 세포 생존율을 나타냈다.
- 땅빈대 추출물에서 nitrite 제거활성이 100 µg/mL에서 1.42±0.47%, 500 µg/mL에서 19.81±1.44%, 1000 µg/mL에서 46.70±1.19%로 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였다.
- 땅빈대 추출물은 400 µg/mL 이하의 농도에서 정상세포에 대해 독성을 나타내지 않았으며, 유방암세포에 대해 높은 항암효과를 나타냈다.
- 땅빈대 추출물의 ·OH radical 소거능은 14.12%로 나타났으며, 이는 대조군으로 사용된 αtocopherol (93.23%)에 비해 낮은 소거능을 나타났다 (Table II).
- 땅빈대 추출물의 페놀성 화합물의 함량은 68.35±0.16 mg/ g으로 나타났으며, 페놀성 화합물에 속하는 총 플라보노이드 함량은 38.74±1.26 mg/g으로 이는 페놀성 화합물의 약 56.7%를 차지하는 것으로 나타났다.
- 땅빈대 추출물의 항암효과는 위암(NCI-N87)에 대해 800 µg/mL 위암(NCI-N87) 세포 생존율 79.40±3.02%로 나타났으며, 유방암 세포(MDA-MB-231)에 대한 항암효과는 400 µg/mL 에서 66.54±1.91%, 800 µg/mL 에서 43.98±3.35%로 높게 나타났다.
- 또한 LPS처리 후에 NO 생성에 대한 세포독성에 대한 세포보호 효과는 LPS만을 처리한 대조군 (50.79±0.89%)에 비해 추출물을 처리한 군에서 200 µg/mL에서 75.72±5.18%, 400 µg/mL에서 94.12±4.65%로 NO 생성에 대해 세포의 독성을 억제하는 것으로 나타났다.
- 땅빈대(Euphorbia humifusa)는 생리활성을 나타내는 페놀성 화합물을 많이 함유하고 있으며, DPPH radical 소거능 평가를 통해 생체 내 여러 병인으로 작용되는 ROS를 소거 및 차단하는 높은 항산화 효과를 나타내었다. 발암물질인 nitrosamine 생성물질의 원인이 되는 nitrite 소거활성 평가를 통해 농도의존적으로 소거활성이 증가하는 것을 확인하였다. LPS에 의해 유도된 NO 생성도 저해효과도 RAW264.
- 총 페놀성 및 플라보노이드 화합물 함량 − 땅빈대는 메탄올 (methanol)을 이용하여 침지 방법을 이용하여 추출하였으며 추출 수율은 26.16%로 나타났다 (Table I).
후속연구
- 또한 현대 여성의 높은 발병률을 나타내는 유방암 대해 항암효과를 나타내고 있다. 본 연구를 통해 땅빈대를 이용한 기능성 식품 및 의약품 소재로 개발할 수 있는 가능성을 확인하였으며, 앞으로는 추출물 단위가 아닌 땅빈대의 생리활성 물질의 연구가 요구된다.
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