선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 그러나 광노화 과정에 깊이 관여하는 활성산소 소거활성과 그 생리활성 성분에 대한 연구는 미미한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 땅빈대를 구입하여 땅빈대의 전초 추출물과 분획을 제조하고 이들 추출물(혹은 분획)의 활성산소 소거 활성 및 1O2에 대항한 실질적인 적혈구 세포 보호 효과 그리고 땅빈대 추출물의 주요 생리활성 물질을 밝혀내어 항산화제로서의 땅빈대 추출물의 가능성을 검토하였다.
- 본 연구에서는 땅빈대 추출물의 세포 보호 작용, 항산화능 및 성분 분석에 관한 조사를 수행하였다. 땅빈대 추출물의 free radical 소거활성(FSC50)은 ethyl acetate 분획과 aglycone 분획이 각 각 3.
제안 방법
- 1O2으로 유도된 사람 적혈구의 파괴에 대한 세포보호 효과 −땅빈대 ethyl acetate 분획과 aglycone 분획의 활성산소에 의한 세포 손상에 대한 보호 효과를 적혈구 광용혈법으로 측정하였고 aglycon 분획의 농도에 따른 세포 보호 효과를 Fig. 3에 나타내었다.
- TLC 및 HPLC를 이용한 땅빈대 추출물의 플라보노이드 분석 −땅빈대 추출물 분획 중에서 활성산소종 소거능과 1O2에 대항한 세포 보호 효과가 우수하게 나타난 algycone 분획 (deglycosylated 분획)을 100% 에탄올에 녹인 후, syringe filter (Milopore 0.45 μm)를 이용하여 여과하고 이 여액을 TLC 및 HPLC 분석을 위한 시료로 이용하였다.
- 45 μm)를 이용하여 여과하고 이 여액을 TLC 및 HPLC 분석을 위한 시료로 이용하였다. TLC 분석에서 algycone 분획의 전개용매는 n-hexane : ethyl acetate : acetic acid = 21 : 14 : 5 (v/v)을 사용하여 분석하였다. 성분 확인은 이미 보고된 분광학적 자료, 플라보노이드 표준 물질의 Rf 값과 자외선 및 NP-PEG 발색법을 이용한 분리된 띠의 색상 등으로 확인하였다.
- 크로마토그램은 2개의 peak로 나타났다. 각각의 peak를 동정하기 위하여, Fig. 5에 있는 TLC 크로마토그램에서 분리된 띠를 긁어서 추출여과하고 용매를 감압 건조시킨 후 얻은 파우더를 에탄올로 녹인 후 HPLC 분석을 위한 시료로 사용하였다. 그 결과 땅빈대 추출물 중 aglycon 분획에 대한 Fig.
- 광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 15 min 동안 광조사 하였다.
- 광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 15 min 동안 광조사 하였다. 광조사가 끝난 후 암반응(post-incubation) 시간에 따른 적혈구의 파괴정도를 15 min 간격으로 700 nm에서 투광도(transmittance, %)로부터 구하였다. 이 파장에서 적혈구 현탁액의 투광도의 증가는 적혈구의 용혈정도에 비례한다.
- 2 mM DPPH 용액 1 mL에 에탄올 1 mL를 첨가하고 여러 농도의 추출물 1 mL을 첨가하여 섞은 다음 실온에서 10 min 동안 방치 후 spectrophotometer로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 활성의 크기는 시료를 넣지 않은 경우를 대조군(control)으로 하고 시료를 넣은 것을 실험군(experiment)으로 하여 다음 식에 의해 DPPH의 소거 활성 저해율을 나타내었다. Free radical 소거 활성은 DPPH의 농도가 50% 감소되는데 필요한 시료의 농도(free radical scavenging activity, FSC50, g/mL)로서 표기하였다.
- 기기 및 시약 − UV-visible spectrophotometer는 Varian (Australia)사의 Cary 50, pH meter는 Istek (Korea)사의 pH213 Micro processor pH Meter를 사용하였고 High performance liquid chromatography는 Dionex (USA)사의 HPLC 9001series를 사용하였다.
- 대조군(control)은 시료 용액 대신에 증류수를 넣고, 공시험(blank)은 시료군과 조건이 동일하나 H2O2와 FeCl3·6H2O를 첨가하지 않은 것으로 하였다.
- DPPH 실험법은 이러한 free radical의 소거능을 확인하는 대표적인 실험으로, 비교적 간편하다는 장점이 있다. 땅빈대 추출물 또한 free radical 소거활성을 DPPH법을 통하여 확인하였다. 실험방법은 methanol에 용해시킨 0.
- 땅빈대 추출물에 대하여 rose-bengal로 증감된 사람 적혈구의 광용혈에 대한 억제 효과를 측정하였고, 농도 의존적(5~25 μg/mL)으로 세포보호 효과를 나타내었다.
- 땅빈대 추출물의 광용혈에 미치는 효과는 post-incubation 시간과 용혈정도로 구성된 그래프로부터 적혈구의 50%가 용혈되는 시간인 τ50을 구하여 비교하였다.
- 땅빈대의 분획 및 추출 −건조된 땅빈대 200 g을 잘게 자른 후 50% 에탄올 4 L를 이용하여 일주일 동안 침적시킨 후 여과하고 이 여액을 감압 건조하여 파우더를 얻어서 이를 실험에 사용하였다. 또한 50% 에탄올 추출물은 감압 농축한 후 물과 n-hexane을 이용하여 엽록소, 지질 등의 비극성 성분을 제거하였으며, 이후 ethyl acetate로 3회 반복 처리한 분획을 감압 농축하여 파우더를 얻었다.
- TLC 분석에서 algycone 분획의 전개용매는 n-hexane : ethyl acetate : acetic acid = 21 : 14 : 5 (v/v)을 사용하여 분석하였다. 성분 확인은 이미 보고된 분광학적 자료, 플라보노이드 표준 물질의 Rf 값과 자외선 및 NP-PEG 발색법을 이용한 분리된 띠의 색상 등으로 확인하였다.
- 따라서 이 계를 이용하면 여러 가지 활성산소종에 대한 총항산화능을 측정할 수 있다. 총항산화능은 luminol이 활성산소종에 의해 산화되어 나타나는 빛을 화학발광기로 검출하여 측정하였다. 화학발광 측정용 튜브에 증류수 1.
- 추출물을 농도별로 각각 50 μL씩 첨가하고 암소에서 30 min 동안 pre-incubation 시킨 후, 광증감제인 rose-bengal (12 μM) 0.5 mL를 가하고 파라필름(Whatman laboratory sealing film, UK)으로 입구를 막은 후 15 min 동안 광조사 하였다.
- Photohemolysis법을 이용한 세포보호 효과 측정 −사람 적혈구를 대상으로 활성산소에 의한 세포손상 및 파괴 실험은 활성산소에 의한 세포손상 모델로 적합한 점이 많다. 활성산소에 의한 지질 과산화반응, 단백질 산화 그리고 항산화제의 파괴 및 세포의 파괴 등을 이 실험법을 이용하여 알아볼 수 있다. 무엇보다 자외선에 의한 피부노화를 방어할 수 있는 피부 보호물질을 검색하는데 있어서 사람 적혈구 세포를 이용한다는 점이 실질적이다.
대상 데이터
- 기기 및 시약 − UV-visible spectrophotometer는 Varian (Australia)사의 Cary 50, pH meter는 Istek (Korea)사의 pH213 Micro processor pH Meter를 사용하였고 High performance liquid chromatography는 Dionex (USA)사의 HPLC 9001series를 사용하였다. pH 표준용액 그리고 ethanol (EtOH), methanol (MeOH), ethyl acetate (EtOAc), acetic acid, acetonitrile 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다. 플라보노이드의 분석에 사용한 thin layer chromatography (TLC)는 aluminum sheet silica gel 60F254 (0.
- 땅빈대의 분획 및 추출 −건조된 땅빈대 200 g을 잘게 자른 후 50% 에탄올 4 L를 이용하여 일주일 동안 침적시킨 후 여과하고 이 여액을 감압 건조하여 파우더를 얻어서 이를 실험에 사용하였다.
- 비교 물질은 대표적인 수용성 항산화제인 L-ascorbic acid를 사용하였으며 L-ascorbic acid의 총항산화능은 1.50 μg/mL로 나타났다.
- 비교물질로 사용한 (+)-α-Tocopherol, L-ascorbic acid, quercetin, kaempferol은 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하였다.
- 실험 재료 −본 실험에서 사용한 땅빈대는 제주도 서귀포시에서 채취한 것을 2010년 03월 청량리 경동시장에서 구입하여 사용하였다.
- 실험에 사용된 적혈구 현탁액은 700 nm에서 O.D.가 0.6이었으며 이때 적혈구 수는 1.5×107 cells/mL이었다.
- 적혈구 현탁액 제조 −적혈구는 건강한 성인 남녀로부터 얻었다.
- 환류시킨 용액을 5% KOH-MeOH 용액으로 중화 적정한다. 중화 적정 후 다시 ethyl acetate 층을 분획하고 이를 감압 농축하여 얻은 당이 제거된 aglycone 파우더(deglycosylated 분획)를 실험에 사용하였다.
데이터처리
- Rose-bengal을 첨가하고 광조사를 안 했을 경우와 rosebengal을 첨가하지 않고 광조사만 했을 경우는 모두 암반응 120 min까지는 용혈이 거의 일어나지 않았다. 모든 실험은 3회 반복하여 평균하였다.
- 통계처리 −모든 실험은 3회 반복하였고 통계분석은 5% 유의수준에서 Student's t-test를 행하였다.
이론/모형
- HPLC 분석은 기울기 용리법으로 분리하였고, aglycone 분획의 HPLC 분리조건은 Table I에 나타내었다.
성능/효과
- (Table II, Fig. 4) 땅빈대 추출물들의 세포보호 효과는 10 μg/mL에서 ethyl acetate 분획 (107.5 min)에 비하여 aglycon 분획(217.5 min)이 우수하게 나타났고, 비교물질로 사용한 지용성 항산화제 (+)-α-tocopherol의 세포 보호효과는 동일농도 10 μg/mL에서 38.00 min으로 나타났다.
- 5은 땅빈대 추출물의 ethyl acetate 분획을 당제거한 aglycon 분획의 TLC 크로마토그램이며, 2개의 띠로 분리되었다. 공통적으로 확인된 2개의 띠들은 자외선 및 NP-PEG 발색법으로 확인한 결과, Rf값이 0.86인 EH1은 kaempferol로 나타났고, Rf 값이 0.63인 EH2는 quercetin으로 나타났다.
- 5에 있는 TLC 크로마토그램에서 분리된 띠를 긁어서 추출여과하고 용매를 감압 건조시킨 후 얻은 파우더를 에탄올로 녹인 후 HPLC 분석을 위한 시료로 사용하였다. 그 결과 땅빈대 추출물 중 aglycon 분획에 대한 Fig. 5의 TLC (normal phase) 크로마토그램에서 Rf 값이 가장 큰 띠인 EH1 (Rf 0.86)은 Fig. 6의 HPLC (reverse phase) peak 2로, EH2 (Rf 0.63)는 peak 1과 일치함을 확인하였다. HPLC로 밝혀낸 각각의 성분에 대한 정량적인 데이터를 Table III에 정리하여 나타내었다.
- 대조군(control)은 τ50이 31 min으로 오차범위 ±1min 이내로 모든 경우의 실험에서 재현성이 양호하게 나타났다.
- 땅빈대 50% ethanol 추출물의 활성산소 소거활성(총항산화능, OSC50)은 1.65 μg/mL, ethyl acetate 분획의 총항산화능은 0.43 μg/mL으로 나타났으며 aglycon 분획의 총항산화능은 0.35 μg/mL로 나타났다.
- 7배 더 뛰어난 세포보호 작용을 확인할 수 있었다. 땅빈대 추출물 aglycone 분획의 이러한 항산화능과 세포보호 효능은 quercetin과 kaempferol에 의한 작용임을 TLC와 HPLC 분석을 통하여 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로, 땅빈대 추출물은 항산화제로서 충분한 가능성이 있다고 사료된다.
- 50 μg/mL로 나타났다. 땅빈대 추출물의 ethyl acetate 분획 및 aglycon 분획 모두 L-ascorbic acid 보다 약 3~4배 정도의 뛰어난 활성산소 소거활성을 나타내었다.(Fig.
- 땅빈대 추출물의 free radical 소거활성(FSC50)은 ethyl acetate 분획과 aglycone 분획이 각 각 3.68 μg/mL, 3.15 μg/mL로 (+)-α-Tocopherol (8.98 μg/mL)에 비하여 우수하게 나타났다.
- 또한 luminol-의존성 화학발광법을 이용한 Fe3+-EDTA/H2O2계에서 생성된 활성산소종에 대한 땅빈대 추출물의 총항산화능 또한 ethyl acetate 분획(0.43 μg/mL)과 aglycone 분획(0.35 μg/mL)에서 큰 소거 활성을 나타내었다.
- 땅빈대 추출물 aglycone 분획의 이러한 항산화능과 세포보호 효능은 quercetin과 kaempferol에 의한 작용임을 TLC와 HPLC 분석을 통하여 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로, 땅빈대 추출물은 항산화제로서 충분한 가능성이 있다고 사료된다.
- 지용성 항산화제인 (+)-α-tocopherol과 비교하여 볼 때, 땅빈대 추출물의 ethyl acetate 분획은 (+)-α-tocopherol보다 약 2.5배, aglycone 분획은 약 2.8배 더 우수한 free radical 소거활성을 나타내었다.
- 특히 땅빈대의 aglycon 분획은 지용성 항산화제인 (+)-α-tocopherol와 비교하여 볼 때 동일 농도에서 약 5~6배 정도 우수한 세포보호 활성을 나타내었다.
후속연구
- 항산화 물질들은 활성산소종을 제거하거나 생성을 억제 시킴으로써 과량 생성된 활성산소에 의해 발생하는 각종 질병의 예방 및 치료와 피부 노화억제를 목적으로 이용될 수 있을 것이다. 이러한 항산화제에 대한 연구는 1969년 McCord와 Fridovich가 superoxide radical을 소거하는 효소인 SOD를 발견한 이 후 시작되어 최근에는 식품첨가물로서의 항산화제 개발, 각종 질병의 예방을 위한 건강식품, 노화억제를 목적으로 하는 의약품 및 화장품산업으로까지 다양화되고 있는 추세이다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.