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문제 정의
- 등의 연구旋가 유일하다. 본 연구에서는 치주염 군과 치주적으로 건강한 군에서 치은열구 상피세포를 채취하여 2가지 치주병원균의 존재 여부를 조사하였다.
제안 방법
- 차가운 PBS로 2회 씻어낸 후 1배의 96% 에탄올을 더한 후 -20℃에서 보관하였다. 5//1씩 슬라이드 글라스에 놓은 뒤 건조한 후 50%, 80%, 96%(v/v) 에탄올에서 각각 3분씩 탈수하였다. 그 후 46℃에서 수 분 건조하였다.
- 건강한 군과 치주염 군에서 채취한 세포 내 모든 세균과 세포 내 특이 세균을 기록하였다. 분석은 세포 단위 그리고 개체 단위로 시행하였다.
- 모든 경우에 있어 개별 특이 프로브와 EUB338 프로브를 보색으로 사용하여 함께 보합반응을 시켰으며 특이 프로브의 경우, EUB 프로브에서도 양성으로 나타나야만 양성으로 인정하였다. 예를 들어 치주염 군의 환자의 상피세포 샘플에서 P.
- 모든 진정세균(Eubacteria) 에서 동일한 16S rRNA 부분과 결합하는 EUB338 프로브를 이용하여 전체 세균을 검출 하였고, EUB338 프로브의 역순의 염기서열인 NON338 프로브를 음성대조 프로브로 이용하였다 P0GI 프로브로 P. gingivalie 검출하였으며, B(T)AFO 프로브를 이용하여 T. for浏hie를 동정하였다. 모든 올리고뉴클레오티드 염기서열은 바이오니아(대전, 대한민국)에서 구입하였다.
- 내 특이 세균을 기록하였다. 분석은 세포 단위 그리고 개체 단위로 시행하였다. 정규성 검정은 Shapiro-Wilk test 를 이용하였다
- 아르곤 레이저(488 nm)와 HeNe G laser(543 nm), HeNe R laser(633nm), 그리고 LD405 레이저가 설치된 올림푸스 Fluoview FV-300 공초점 레이저 주사 현미경(Olympus, Japan)을 이용하여 광학 사진을 기록하였다 모든 치은열구상피세포는 공초점 레이저 주사 현미경을 이용하여 조사하였다. 현미경과 함께 제공되는 기본 소프트웨어인 Fluoview FV-300을 이용하여 이미지를 처리하였고 결과는 TIFF 파일로 저장하였다
- 치주염 군에서의 샘플 채취는 치주낭 깊이 5 mm 이상이며 탐침 후 출혈이 관찰되는 부위 3 부위에서 치은연상치태를 제거한 후에 치실을 이용하여 치은연하를 흩어 채취하였다 건강한 군에서의 샘플 채취는 같은 방법을 이용하되 치주낭 깊이가 3 mm 이하이며 탐침 후 출혈이 없는 치은열구세 부위에서 치은연하로 치실을 넣어 치은열구 내연을 흩어 올렸으며, 치실을 바로 3.7%(v/v) paraformaldehyde in phosphate buffered saline(PBS) (pH 7.4)가 들어있는 에펜도르프 튜브에 넣어 채취한 샘플을 고정하였다.
- 현미경과 함께 제공되는 기본 소프트웨어인 Fluoview FV-300을 이용하여 이미지를 처리하였고 결과는 TIFF 파일로 저장하였다
대상 데이터
- 27명의 만성 치주염 환자와 9명의 치주적으로 건강한 지원자들이 본 실험에 참여하였다. 만성 치주염 군에서 3명은 이미지 저장 시의 오류로 T.
- 9명의 건강한 지원자들에서는 198개의 치은열구상피세포를 조사하였고, 27명의 만성 치주염 환자에서는 P. gingi- vali最 조사한 개체 수가 26명, T. forsythi最 조사할 수 있었던 환자가 24명 있었으며 총 468개의 치은열구상피세포를 조사하였다.
- 가톨릭대학교 의료원 강남성모병원 치과를 내원한 만성 치주염 환자 중 실험에 참여하기에 동의한 27명위 환자에서 샘플을 채취하였다 9명의 건강한 지원자에게서.도 샘플을 채취하였다.
- EUB338 프로브의 경우 각 현미경 시야에 함께 나타나는 세포 외 세균을 양성 대조군으로 삼았다. 각 특이 프로브와 EUB338 프로브를 보색의 형광표지 물질을 부착하여 모든 실험에 함께 사용하였다 일부 샘플에서는 NON338 프로브를 이용하여 EUB338 프로브의 비특이 부착을 조절하였다. Counterstain으로서 세균, 진균, 그리고 숙주의 DNA와 결합하는 4', S'-diamidino -2phenylindole(DAPI)를 이용흐]였다
- for浏hie를 동정하였다. 모든 올리고뉴클레오티드 염기서열은 바이오니아(대전, 대한민국)에서 구입하였다. 형광표지 물질로 녹색의 AlexaFluor 488(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 붉은 색의 Gy3(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 Terminal transferase kit(Roche, Penzberg, Germany)를 이용하여 올리고뉴클레오티드에 부착하여 이용하였다.
- 종 특이 프로브의 양성대조군으로 고정한 P. gingivalis ATCT 33277와 T. forsythia ATCC 43047를 한국 균주 은행에서 분양 받아 사용하였다. EUB338 프로브의 경우 각 현미경 시야에 함께 나타나는 세포 외 세균을 양성 대조군으로 삼았다.
- 도 샘플을 채취하였다. 치주염 환자의 경우는 임상적 부착 상실이 나타나는 부위와 치주낭 깊이가 4 mm 이상인 부위가 6 부위이상인 경우에만 선정하였다. 건강한 지원자의 경우에는 임상적 부착 상실이 관찰되지 않는 경우만을 선정하였다.
- 모든 올리고뉴클레오티드 염기서열은 바이오니아(대전, 대한민국)에서 구입하였다. 형광표지 물질로 녹색의 AlexaFluor 488(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 붉은 색의 Gy3(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 Terminal transferase kit(Roche, Penzberg, Germany)를 이용하여 올리고뉴클레오티드에 부착하여 이용하였다.
데이터처리
- 개별 치은열구상피 세포 내에서 발견되는 세균 수와 빈도를 Table 2에 기록하였다 건강한 군에서의 세균이 발견되는 빈도와 치주염 군에서 새균이 발견되는 빈도는 카이 제곱 검정을 이용하였으며 p<0.05로 분석하였다. 건강한 군의 치은열구세포 내에서 세균이 발견되는 비율이 98.
- 검정은 椭Icoxon two-sample test를 이용하였으며 p <0.05로 산정하였다.
- 분석은 세포 단위 그리고 개체 단위로 시행하였다. 정규성 검정은 Shapiro-Wilk test 를 이용하였다
- forsythia八 발견되는 확률은, 만성 치주염 군에서 더 높게 나타나기는 하였으나, 이 차이는 통계적으로 유의하지는 않았다. 카이 제곱 검정을 이용하였으며 p<0.05로 산정하였다
- 카이 제곱 검정이나 Fisher의 정확 검정, Wilcoxon Rank Sum Test를 이용하였다. 분석 소프트웨어는 The SAS System for Windows v 8.
이론/모형
- 이번 연구에서는 16S rRNA 프로브를 이용한 형광제 자리부합법(fluoresc&nce in situ hybridization; FISH)을 사용하여 치은열구세포 내에서 대표적인 치주 병원균인 P. gin~ givali缉 T, forsy난를 괸찰하고 그 결과를 공초점 레이저 주사현미경을 이용하여 기록하였다.
성능/효과
- T, forsythia 또는 P, gingivalise} 치은열구세포 내에서 발견될 확률은 세포 단위와 개체 단위로 분석하였을 때, 두 경우 모두에 있어서 치주염 이환군에서 더 높게 나타났으며 이는 통계적으로 의미가 있었다. P.
- forsythia가 발견되었을 때를 양성으로 산정하여 Table 4에 기록하였다. 각 피험자 단위로 살펴보았을 때, 건강한 피험자와 만성 치주염 군의 피험자 사이에서 P. gingivalis 또는 T. forsythia 중 어느 하나라도 발견될 가능성에는 통계적으로 유의한 차이가 있었다. 그러나 P.
- 이는 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 건강한 군의 세포 내에서 P gingivalis* 나타날 확률이 10.89%이고 만성 치주염 군의 세포 내에서 P. gingivalis 가 나타날 확률이 29.96%로 통계적으로 유의한 차이가 나타났다. 반면에 T.
- 05로 분석하였다. 건강한 군의 치은열구세포 내에서 세균이 발견되는 비율이 98.99%로 높았으며, 만성 치주염 군에서는 세균이 발견되는 비율이 84.40%였다. 이는 통계적으로 유의한 차이를 보였다.
- 건강한 피험자의 치은열구세포 내에서 세균이 발견될 확률은 99.17%, 만성 치주염 군에서 세균이 발견될 확률은 82.94%로 통계적으로 유의한 차이가 있었다. 마찬가지로 조사한 치주병원균 중 어느 쪽이라도 발견될 확률이 치주 적으로 건강한 피험자 군에서 10.
- 96%로 통계적으로 유의한 차이가 나타났다. 반면에 T. forsythiae} 건강한 군과 치주염 군에서 나타날 빈도는 12.37%와 18.96%로 치주염 군에서 더 많은 경향을 보였으나 이는 통계적으로 유의한 차이는 아니었다.
- 세포 내 발견되는 세균의 수를 없음 1T9 개 사이, 20-49개 사이, 50개 이상으로 구획 지었을 때, 각 군당 나타나는 비율은 Fisher의 정확 검정으로 분석하였고, 마찬가지로 P<0.05 수준에서 검정하였다 건강한 군과 만성 치주염 군에서의 세포당 나타나는 세균 수의 비율에서는 통계적으로 유의한 차이가 보였다 마찬가지로 P. gingivalis/} 나타나는 세균 수의 군의 비율에서도 통계적으로 차이가 있었다. T.
- 실험군별로 각 피험자당 발견되는 전체 세균과 치주 병원균의 비율을 비교하여 Table 3에 기록하였다 통게상의 편의를 위하여 전체 세균과 특이 세균 중 하나라도 발견되는 비율의 경우는 각 특이 프로브 당 관찰한 피험자를 1인으로 산정하여 EUB338와 특이 프로브를 관찰한 개체 수가 건강한 군에서는 18, 만성 치주염 군에서는 50이 되었다. Universal 프로브의 경우 P.
- 이 번 조사에서는 채취한 상피세포 단위와 개개 피험자 단위로 나누어 통계 분석을 시행하였다 우선 세포 내 세균의 존재 유무를 살폈을 때, 건강한 군에서의 상피세포 내에서는 98.99%에서 세균을 발견할 수 있었는데 비해서, 치주염 군에서 채취한 상피세포 내에서는 84.40%의 세포에서 발견되었다. 피험자 수준에서 조사하였을 때는 건강한 피험자의 99.
- forsythia竺 경우에는 만성 치주염 군에서 더 높게 나타나는 경향이 있었으나, 이 차이는 통계적으로 유효하지 않았다. 피험자 단위로 조사했을 때 P. gingivaliS나 T. for- 砂㎛a가 발견될 확률이나 발견 여부의 차이는 통계적 유의성이 없었는데, 이는 검정하기에 개체 수가 작아서라고 여겨진다.
후속연구
- 또한 같은 치주염 군 내에서도 치은열구 상피세포 내에서 세균이 적거나 거의 발견되지 않았던 피험자들이 있었으므로 이 점이 임상적으로 유의한 차이와 연계되어 있는지도 조사해보아야 할 것이다. in vitro 연구에서의 세균 침입 시의 상피세포의 반응을 in vivo 환경과 연계하여 세포 내 세균의 존재가 치은열구 상피세포에 어떤 영향을 미치는지도 살펴보아야 할 것이다.
- 이외의 다른 어떤 세균들이 치은열구 상피세포 내에 존재하는지와 상피세포 내 세균의 존재와 치주염의 진행과의 관계를 밝히는 것이 앞으로의 숙제가 될 것이다. 또한 같은 치주염 군 내에서도 치은열구 상피세포 내에서 세균이 적거나 거의 발견되지 않았던 피험자들이 있었으므로 이 점이 임상적으로 유의한 차이와 연계되어 있는지도 조사해보아야 할 것이다. in vitro 연구에서의 세균 침입 시의 상피세포의 반응을 in vivo 환경과 연계하여 세포 내 세균의 존재가 치은열구 상피세포에 어떤 영향을 미치는지도 살펴보아야 할 것이다.
- 이 두 세균 종들이 치주염 군에서 더 많이 발견되기는 하나 양적으로 봤을 때 세포 내 세균의 적은 부분만을 차지한다. 이외의 다른 어떤 세균들이 치은열구 상피세포 내에 존재하는지와 상피세포 내 세균의 존재와 치주염의 진행과의 관계를 밝히는 것이 앞으로의 숙제가 될 것이다. 또한 같은 치주염 군 내에서도 치은열구 상피세포 내에서 세균이 적거나 거의 발견되지 않았던 피험자들이 있었으므로 이 점이 임상적으로 유의한 차이와 연계되어 있는지도 조사해보아야 할 것이다.
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