Agrobacterium공동배양법으로 오이의 기관발생을 통한 형질전환에서 가장 문제점 중 하나는 chimeric 형질전환체의 발생빈도이다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 항생제로서 paromomycin이 첨가된 선발배지에서 "은성" 품종의 배축절편으로부터 체세포배발생을 통한 형질전환시스템을 개발하였다. 배축절편을 pPPTN290발현벡터가 도입된 Agrobacterium 균주 (EHA101)에 30분간 접종한 후 2일간 공동배양 하였고, 선발배지에서 2주 간격으로 5회 계대 배양하면서 항생제 저항성 캘러스 선발, 체세포배발생 및 식물체를 유도하였다. pPPTN290발현벡터의 T-DNA는 reporter유전자로서 Ubi 프로모터에 의해 gus유전자가 발현조절 되도록 그리고 항생제로서 paromomycin에 저항성을 갖는 nptII유전자가 35S 프로모터에 의해 발현되도록 제조하였다. 안정적 형질전환과 빈도는 캘러스의 paromomycin항생제 저항성과 GUS유전자의 발현 여부에 의해 조사하였다. Agrobacterium과 공동배양한 928개의 배축절편에서 paromomycin에 저항성을 갖는 56개의 캘러스 클론을 얻었고, 이중 48개 캘러스 클론 (5.2%)에서 GUS유전자가 안정적으로 발현되고 있음을 확인하였다. 48개의 캘러스 클론중에서 오직 5개의 캘러스 클론으로부터 식물체를 얻어 낮은 빈도 (0.5%)를 나타냈다. 수확한 $T_1$종자에서 GUS양성반응은 gus유전자가 오이 게놈에 안정적으로 도입 및 발현되고 있음을 확인하였다.
Agrobacterium공동배양법으로 오이의 기관발생을 통한 형질전환에서 가장 문제점 중 하나는 chimeric 형질전환체의 발생빈도이다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 항생제로서 paromomycin이 첨가된 선발배지에서 "은성" 품종의 배축절편으로부터 체세포배발생을 통한 형질전환시스템을 개발하였다. 배축절편을 pPPTN290발현벡터가 도입된 Agrobacterium 균주 (EHA101)에 30분간 접종한 후 2일간 공동배양 하였고, 선발배지에서 2주 간격으로 5회 계대 배양하면서 항생제 저항성 캘러스 선발, 체세포배발생 및 식물체를 유도하였다. pPPTN290발현벡터의 T-DNA는 reporter유전자로서 Ubi 프로모터에 의해 gus유전자가 발현조절 되도록 그리고 항생제로서 paromomycin에 저항성을 갖는 nptII유전자가 35S 프로모터에 의해 발현되도록 제조하였다. 안정적 형질전환과 빈도는 캘러스의 paromomycin항생제 저항성과 GUS유전자의 발현 여부에 의해 조사하였다. Agrobacterium과 공동배양한 928개의 배축절편에서 paromomycin에 저항성을 갖는 56개의 캘러스 클론을 얻었고, 이중 48개 캘러스 클론 (5.2%)에서 GUS유전자가 안정적으로 발현되고 있음을 확인하였다. 48개의 캘러스 클론중에서 오직 5개의 캘러스 클론으로부터 식물체를 얻어 낮은 빈도 (0.5%)를 나타냈다. 수확한 $T_1$종자에서 GUS양성반응은 gus유전자가 오이 게놈에 안정적으로 도입 및 발현되고 있음을 확인하였다.
One of the limitation for Agrobacterium-mediated transformation via organogenesis from cotyledon explants routinely in cucumber is the production of chimeric plants. To overcome the limitation, Agrobacterium-mediated transformation system via somatic embryogenesis from hypocotyl explants of cucumber...
One of the limitation for Agrobacterium-mediated transformation via organogenesis from cotyledon explants routinely in cucumber is the production of chimeric plants. To overcome the limitation, Agrobacterium-mediated transformation system via somatic embryogenesis from hypocotyl explants of cucumber (c.v., Eunsung) on the selection medium with paromomycin as antibiotics was developed. The hypocotyl explants were inoculated with Agrobacterium tumefaciens strain EHA101 carrying binary vector pPTN290; then were subsequently cultured on the following media: co-cultivation medium for 2 days, selection medium for $5{\times}14$ days, and regeneration medium. The T-DNA of the vector (pPTN290) carried two cassettes, Ubi promoter-gus gene as reporter and 35S promoter-nptll gene conferring resistance to paromomycin as selectable agent. The confirmation of stable transformation and the efficiency of transformation was based on the resistance to paromomycin indicated by the growth of putative transgenic calli on selection medium amended with 100mg/L paromomycin, and GUS gene expression. Forty eight clones (5.2%) with GUS gene expressed of 56 callus clones with resistance to paromomycin were independently obtained from 928 explants inoculated. Of 48 clones, transgenic plants were only regenerated from 5 clones (0.5%) at low frequency. The histochemical GUS assay in the transgenic seeds ($T_1$) also revealed that the gus gene was successfully integrated and segregated into each genome of transgenic cucumber.
One of the limitation for Agrobacterium-mediated transformation via organogenesis from cotyledon explants routinely in cucumber is the production of chimeric plants. To overcome the limitation, Agrobacterium-mediated transformation system via somatic embryogenesis from hypocotyl explants of cucumber (c.v., Eunsung) on the selection medium with paromomycin as antibiotics was developed. The hypocotyl explants were inoculated with Agrobacterium tumefaciens strain EHA101 carrying binary vector pPTN290; then were subsequently cultured on the following media: co-cultivation medium for 2 days, selection medium for $5{\times}14$ days, and regeneration medium. The T-DNA of the vector (pPTN290) carried two cassettes, Ubi promoter-gus gene as reporter and 35S promoter-nptll gene conferring resistance to paromomycin as selectable agent. The confirmation of stable transformation and the efficiency of transformation was based on the resistance to paromomycin indicated by the growth of putative transgenic calli on selection medium amended with 100mg/L paromomycin, and GUS gene expression. Forty eight clones (5.2%) with GUS gene expressed of 56 callus clones with resistance to paromomycin were independently obtained from 928 explants inoculated. Of 48 clones, transgenic plants were only regenerated from 5 clones (0.5%) at low frequency. The histochemical GUS assay in the transgenic seeds ($T_1$) also revealed that the gus gene was successfully integrated and segregated into each genome of transgenic cucumber.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 궁극적으로 비 생물학적 스트레스 내성 오이 신품종을 개발할 목적으로 먼저 오이의 안정적이 며 재 현성 있는 형질전환방법을 확립하기 위하여 국내 20 개의 품종으로부터 체세포배발생이 가능한 “은성” 품종의 배축 절편을 이용하여 형질전환체를 생산하였기에 보고하 고자 한다
제안 방법
표면 살균 하였다. 2% sucrose와 0.8% agar가 첨가된 MS기본배지 (Murashige and Skoog 1962)에 페트리디쉬 당 10개의 종자를 치상하고 25℃ 암상태에서 10일 동안 발아시켰다. 배양 10일 후 발아된 오이 유식물체로부터 배축절편 (0.
1987). 24시간 후 70% 알코올 용액으로 탈색 시킨 후 GUS 양성반응을 나타낸 캘러스의 빈도를 조사하였으며, 종자에서 GUS 유전자의 발현을 확인하였다. 대조구로서는 Agrobacteriwn 과 공동배양하지 않은 종자를 사용하였다.
mg/L 2, 4-D, 39 mg/L acetosyringone, 3% sucrose, pH 54)에 15개씩 치상하여 3일 동안 공동 배양하였다. 공동 배양한 배 축 절편을 3 - 5회 수세한 후 캘러스 유도배지 (Callus Induction Medium: CIM, MS salt, MS vitamin, 3% sucrose, 1 mg/L 2, 4-D, 100 mg/L paromomycin, 50 mg/L ticarcillin, 50 mg/L cefotaxime, 3 mM MES, pH 5.6) 에 옮겨 6 - 8주 동안 2주 간격으로 계대배양 하였다. 유도된 캘러스 중 배발생 캘러스를 현미경 하에서 선발하여 % MS 기본배지 (% MS salt, 0.
국내 20개 오이 품종 중 체세포배발생능을 갖는 “은성” 종자를 70% 알코올에 1분간, 2% sodium hypochlorite용액에 15분간 표면 살균 하였다. 2% sucrose와 0.
오이 형질전환체를 얻기 위하여 약 928개 배축 절편을 pPTN290벡터로 형질전환시킨 25 mL의 Agrobacterium용액 (EHA101)에 30분 동안 침지한 후 공동배양용 배지 (co-cultivation medium : CM, '/io MS salt, 20 mM MES, 100 mg/L cysteine, 1 mg/L 2, 4-D, 39 mg/L acetosyringone, 3% sucrose, pH 54)에 15개씩 치상하여 3일 동안 공동 배양하였다. 공동 배양한 배 축 절편을 3 - 5회 수세한 후 캘러스 유도배지 (Callus Induction Medium: CIM, MS salt, MS vitamin, 3% sucrose, 1 mg/L 2, 4-D, 100 mg/L paromomycin, 50 mg/L ticarcillin, 50 mg/L cefotaxime, 3 mM MES, pH 5.
대상 데이터
8% agar가 첨가된 MS기본배지 (Murashige and Skoog 1962)에 페트리디쉬 당 10개의 종자를 치상하고 25℃ 암상태에서 10일 동안 발아시켰다. 배양 10일 후 발아된 오이 유식물체로부터 배축절편 (0.7 cm)을 절단 한 0grobacteri"m과 공동배양하기 위한 재료로 사용하였다.
al, 1987). 50 mg/L streptomycin과 50 mg/L spectinomycin 이 첨가된 YEP액체배지 50 mL에 각각의 colony를 접종하여 28℃로 8시간 이상 배양한 후 대수기 증식기 (OD㎛ = 0.6 - 1.0)의 균을 사용하였다.
국내에서 재배되는 20개의 오이품종 종자를 무균 발아 시켜 얻은 유식물체의 배축 절편을 1.0 mg/L 2, 4-D를 첨가한 MS배지에서 배양한 결과, 배 발생능 캘러스를 형성하는 오이 (은성) 1품종을 선정 하였다 (결과 미제시). 체세포배 발생 능을 갖는 은성 배축 절편을, Agrobacterisn과 공동배양 한 후 paromomycin이 첨가된 선발배지에서 배양한 결과, 배양 2주 후 배축 절편 가장자리가 점차 팽창되어 상처 부위로부터 노란색의 캘러스가 형성 되기 시작하였다.
24시간 후 70% 알코올 용액으로 탈색 시킨 후 GUS 양성반응을 나타낸 캘러스의 빈도를 조사하였으며, 종자에서 GUS 유전자의 발현을 확인하였다. 대조구로서는 Agrobacteriwn 과 공동배양하지 않은 종자를 사용하였다.
본 연구는 농림부 농림기술관리센타 (ARPC)의 지원을 받아 수행 하였으며, 네브라스카대학 Tom Clemente 박사로부터 pPTN290벡터를 공급받아 수행하였다.
이론/모형
Ubiquitin 프로모터, ^-glucuronidase (GUS) 유전자, 선발표지로서 npf#유전자 (pPTN290, Figure 1)를 freeze-thaw 방법으로 EHA 101에 형질전환하여 균주로 사용하였다 (Jefferson et al, 1987). 50 mg/L streptomycin과 50 mg/L spectinomycin 이 첨가된 YEP액체배지 50 mL에 각각의 colony를 접종하여 28℃로 8시간 이상 배양한 후 대수기 증식기 (OD㎛ = 0.
성능/효과
본 연구에서도 paromomycine 노란색의 단단한 형 태를 갖는 빠른 생장을 보이는 캘러스와 생장속도가 느리고 백화현상을 보이는 캘러스로 구분되어 배축절 편으로부터 형질전환 캘러스를 선발하는데 효과적임을 알 수 있었다. Agrobacterium과 공동배양 한 928개의 배 축 절편으로부터 배양 6 - 8주 후 선발된 56개의 캘러스를 대상으로 GUS 유전자의 발현빈도를 조사한 결과 실험군간 발현빈도 (2.1% - 9.1%)는 차이가 있었으나 48개의 캘러스에서 GUS 유전자가 발현되어 5.2%의 높은 빈도를 나타냈다 (Table 1). 이러한 캘러스로부터 체세포배발생을 통한 식물체 재생은 실험I 군에서 2개 (0.
2007). 본 연구에서도 paromomycine 노란색의 단단한 형 태를 갖는 빠른 생장을 보이는 캘러스와 생장속도가 느리고 백화현상을 보이는 캘러스로 구분되어 배축절 편으로부터 형질전환 캘러스를 선발하는데 효과적임을 알 수 있었다. Agrobacterium과 공동배양 한 928개의 배 축 절편으로부터 배양 6 - 8주 후 선발된 56개의 캘러스를 대상으로 GUS 유전자의 발현빈도를 조사한 결과 실험군간 발현빈도 (2.
예외적으로 Woo (2001)등은 배발생캘러스의 현탁배양을 통해 형질전환체 생산을 위한 연구를 시도 하였지만 완전한 형질전환체를 생산하지 못하여 오이의 식물체 재생은 체세포 배보다는 기관발생이 훨씬 쉬운 것으로 보고되어 있다. 본 연구에서도 배양절편으로부터 항생제 저항성 캘러스 선발과 도입 유전자 발현까지는 기관발생시 나타나는 chimeric현싱이나 높은 비 형질전환체 생산빈도 (Gaba et al. 2004)에 비하여 매우 효과적이었다. 그러나 GUS유전자발현이 확인된 항생제 저항성 캘러스로부터 배발생캘러스 선발, 체세포배유도및 식물체 재생과정은 쉽지 않은 것으로 나타나 향후 오이 형질전환체를 안정적으로 생산하기 위해서는 항생제 저항성 캘러스로부터 식물체 재생에 대한 최적의 배양조건을 확립하는 것이 필수적이라 사료된다.
2%의 높은 빈도를 나타냈다 (Table 1). 이러한 캘러스로부터 체세포배발생을 통한 식물체 재생은 실험I 군에서 2개 (0.7%), 실험Ⅲ 군에서 1개 (0.6%), 실험VI 군에서 2개 (2.1%)를 각각 얻어 총 48개중 오직 5개의 캘러스 클론에서만 식물체가 유도되어 매우 낮은 빈도 (0.5%)를 나타냈다 (Table 1). 체세포배로부터 재생된 5개의 유식 물체 중에서 오직 1 개체에서만 인공수정을 통해, 종자를 수확할 수 있었으며, GUS유전자가 대조군 (Figure 21)에 비해 안정적으로 발현되고 있음을 확인하였다 (Figure 2J).
5%)를 나타냈다 (Table 1). 체세포배로부터 재생된 5개의 유식 물체 중에서 오직 1 개체에서만 인공수정을 통해, 종자를 수확할 수 있었으며, GUS유전자가 대조군 (Figure 21)에 비해 안정적으로 발현되고 있음을 확인하였다 (Figure 2J). 초기 오이의 형질전환 연구가 대부분 잎, 배축 및 자엽절편으로부터 기관발생을 통해 이루어진 이후 (Chee 1990; Dong et al.
후속연구
2004)에 비하여 매우 효과적이었다. 그러나 GUS유전자발현이 확인된 항생제 저항성 캘러스로부터 배발생캘러스 선발, 체세포배유도및 식물체 재생과정은 쉽지 않은 것으로 나타나 향후 오이 형질전환체를 안정적으로 생산하기 위해서는 항생제 저항성 캘러스로부터 식물체 재생에 대한 최적의 배양조건을 확립하는 것이 필수적이라 사료된다. 현재 보다 안정적이고 반복적인 형질전환시스템을 구축하기 위하여 항생제 저항성 캘러스로부터 식물체재분화 빈도를 증가시킬 수 있는 연구를 진행하고 있다.
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