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문제 정의
- 또한 식물형질전환이 어려운 작물의 경우 일반적으로 선발마커의 최적화, 배양재료의 선택, Agrobacterium의 최적공동 배양조건 및 항산화제 등과 같은 형질전환효율을 증가시키기 위한 연구가 더욱 요구된다 (Olhoft and Somers 2001). 본 연구에서는 포도의 형질전환 체계 확립을 위하여 재분화 효율 향상을 위한 조건 및 Agrobacterium 형질전환 방법을 이용한 포도 품종 리자마트에 대한 GUS reporter gene의 도입 조건을 구명하고자 하였다.
제안 방법
- 1). 1년생 휴면지를 채취하여 약 30 cm 길이로 잘라 polyethylene film으로 포장하여 5℃에서 8주간 저온 처리하여 휴면을 타파시켰다. 약 10 cm 길이의 삽수를 수삽하여 발생한 신초를 3cm길이로 잘라 중성세제로 세척한 다음 1.
- 1987). 24시간 후 70% 알코올 용액으로 탈색 시킨 후 GUS 양성반응을 나타낸 잎 절편체와 엽병, 줄기를 조사하였다. 대조구로서는 Agrobacterium과 공동 배양하지 않은 잎, 엽병, 줄기를 사용하였다.
- 3). Agrobacterium을 이용한 포도의 GUS 유전자 발현 효율에 영향을 미치는 요인 중 박테리아의 농도를 조사하였다. 박테리아의 전처리 배양 농도와 최종 접종 농도는 다음과 같은 차이를 나타냈다.
- 2011). Agrobacterium을 접종하지 않은 잎 절편체는 항생제가 포함되지 않은 배지 (MS salts, LS vitamin, TDZ 5 mg/L, IBA 0.1 mg/L, cefotaxime 350 mg/L, Daishin agar 7 g/L, pH5.8)에 치상하여 형질전환 대조구로 사용하였다. 공동배양 후에 잎 절편체를 항생제가 첨가된 선발 재분화 배지 (TDZ 5 mg/L, kanamycin 100 mg/L, cefotaxime 350 mg/L)에 치상하였고, 4주간 25℃, 암상태에서 배양하였다.
- 0%의 sodium hypochlorite 용액에서 1분간 3회씩 살균하였다. Clean bench 내에서 멸균수로 완전히 세척한 후 생장점 부위를 채취하여 BA 1 mg/L, sucrose 30 g/L이 첨가된 MS (Murashige and Skoog, 1962) 배지에 접종하여 다신초를 유도하였고, 이들을MS배지에 무기염류, BA 1 mg/L, IBA 0.1 mg/L, Sucrose 30 g/L, Plant agar 8 g/L를 첨가한 후에 pH를 5.8로 조정하여 121℃, 1.2 기압에서 15분간 고압 멸균하여 사용하였다. 신초 배양은 형광등 아래 25±2℃로 조절되는 배양실에서 2,000 μmol･m2･sec1의 광도로 16시간 광주기, 8시간 암주기로 하였다.
- 그러나, 세부적으로는 포도의 품종이나 selection marker, 배양조건 및 배지조성 등에서 차이가 있었다. 공동 배양된 포도의 잎 절편체 (300개), 엽병 (300개), 줄기 (300개)에서 엽병으로부터 신초가 발생하였으며, 이들 형질전환체 (T0)의 잎 절편체와 줄기에서 GUS양성반응을 확인하였다 (Fig. 3). Agrobacterium을 이용한 포도의 GUS 유전자 발현 효율에 영향을 미치는 요인 중 박테리아의 농도를 조사하였다.
- 8)에 치상하여 형질전환 대조구로 사용하였다. 공동배양 후에 잎 절편체를 항생제가 첨가된 선발 재분화 배지 (TDZ 5 mg/L, kanamycin 100 mg/L, cefotaxime 350 mg/L)에 치상하였고, 4주간 25℃, 암상태에서 배양하였다. 2주 동안 1000 μmol･m2･sec1 광도로 배양하고 다음 2주 동안 2000 μmol･m2･sec1 광도로 배양하였다.
- 그 후 5주 동안 2000 μmol･m2･sec1 광도로 배양한 후 신초 형성률을 측정하였다.
- 기내 도입된 식물체를 증식배지로 옮겨 6주 후부터 새로 나온 1 ~ 1.5 cm의 정단부 유엽을 사용하여 증식된 식물체의 잎 절편체와 엽병, 줄기를 BA와 TDZ를 조합한 배지 (Table 1)에 각 처리구당 200개씩 치상하였다. 그 후 5주 동안 2000 μmol･m2･sec1 광도로 배양한 후 신초 형성률을 측정하였다.
- BA 단독 처리구에서 유도된 신초는 외관상 정상적으로 분화하나 신초의 생장이 늦고, TDZ 단독 처리구의 경우는 식물체 재분화 과정에서 외관상 기형을 보인 신초가 발생하였다. 배지 조성에 따른 재분화율 결과를 바탕으로 배지 E와 배지 F에서 탐나라, 흑구슬, 흑보석, 리자마트의 캘러스 형성율과 신초 재분화율을 보았다 (Table 2). BA 2 mg/L을 첨가한 배지보다 TDZ 2 mg/L을 첨가한 배지에서 높은 캘러스 형성율과 신초 재분화율이 관찰되었다.
- 1년생 휴면지를 채취하여 약 30 cm 길이로 잘라 polyethylene film으로 포장하여 5℃에서 8주간 저온 처리하여 휴면을 타파시켰다. 약 10 cm 길이의 삽수를 수삽하여 발생한 신초를 3cm길이로 잘라 중성세제로 세척한 다음 1.0%의 sodium hypochlorite 용액에서 1분간 3회씩 살균하였다. Clean bench 내에서 멸균수로 완전히 세척한 후 생장점 부위를 채취하여 BA 1 mg/L, sucrose 30 g/L이 첨가된 MS (Murashige and Skoog, 1962) 배지에 접종하여 다신초를 유도하였고, 이들을MS배지에 무기염류, BA 1 mg/L, IBA 0.
- 2). 재분화가 잘 되는 리자마트 품종을 이용해서 A. tumefaciens을 이용한 GUS 유전자의 발현 조건을 살펴보았다.
- 2003). 접종 후, 감염된 잎 절편체와 엽병, 줄기의 접종액을 흡수시킨 뒤, acetosyringone 0.2 mM과 proline 1.0 mM이 첨가된 공동배양 배지 (MS salts, LS vitamin, TDZ 5 mg/L, IBA 0.1 mg/L, sorbitol 30 g/L, Daishin agar 7 g/L, pH 5.8)가 들어있는 페트리디쉬에 각 10개의 절편체를 치상한 후, 온도 25℃, 습도 70%, 암 상태에서 3일간 공동 배양하였다 (Jorge et al. 2011). Agrobacterium을 접종하지 않은 잎 절편체는 항생제가 포함되지 않은 배지 (MS salts, LS vitamin, TDZ 5 mg/L, IBA 0.
- 5주 뒤에 동일 조성의 선발 배지 (TDZ 5 mg/L, kanamycin 100 mg/L, cefotaxime 350 mg/L)로 계대배양하였다. 첫 번째 선발배지로부터 10주 뒤에 재분화 된 신초는 항생제가 없는 증식배지 (MS, BA1 mg/L, IBA 0.3 mg/L, GA3 0.5 mg/L, sucrose 30 g/L, plant agar 8 g/L, pH5.8)에 이식하여 증식시킨 뒤, kanamycin 30 mg/L가 첨가된 증식 배지 (MS, IBA 0.1 mg/L, BA 0.1 mg/L, sucrose 30 g/L, plant agar 8 g/L, pH 5.8)에서 재선발하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용한 재료는 농촌진흥청 국립원예특작과학원에서 보존 중인 포도 4품종을 이용하였다. 국내육성품종인 탐나라, 흑구슬, 흑보석과 도입 품종인 리자마트를 기내 도입하여, 유지 증식시킨 식물체를 공시하였다(Fig. 1). 1년생 휴면지를 채취하여 약 30 cm 길이로 잘라 polyethylene film으로 포장하여 5℃에서 8주간 저온 처리하여 휴면을 타파시켰다.
- 24시간 후 70% 알코올 용액으로 탈색 시킨 후 GUS 양성반응을 나타낸 잎 절편체와 엽병, 줄기를 조사하였다. 대조구로서는 Agrobacterium과 공동 배양하지 않은 잎, 엽병, 줄기를 사용하였다.
- 1983)에 형질전환하여 균주로 사용하였다. 박테리아는 액체 YEP 배지 (Nutrient broth 13.3 g/L, Yeast extract 1.0 g/L, Sucrose 5 g/L, MgSO4 0.24 g/L pH 7.5) 50 ml에 항생제 (Rifampicin 100 mg/L, Streptomycin 300 mg/L, Kanamycin 50 mg/L)를 첨가하여 28℃, 220 rpm에서 약 24시간 정도 배양하여 OD600 (optical density) 0.8 ~ 1.0의 균을 사용하였다. 배양액은 22℃에서 10분 동안 원심분리하고, 회수된 pellets을 병원성 유도배지 (citric acid 5.
- 본 연구에 사용한 재료는 농촌진흥청 국립원예특작과학원에서 보존 중인 포도 4품종을 이용하였다. 국내육성품종인 탐나라, 흑구슬, 흑보석과 도입 품종인 리자마트를 기내 도입하여, 유지 증식시킨 식물체를 공시하였다(Fig.
- 포도 형질전환체를 생산하기 위하여 기내 도입된 식물체를 증식배지로 옮겨 6주 후부터 새로 나온 1 ~ 1.5 cm의 정단부 유엽을 사용하였다. Agrobacterium 현탁배지를 22℃에서 150 rpm으로 배양하여 병원성을 유도･촉진한 뒤, 사각으로 자른 잎 절편체와 엽병, 줄기를 침지하여 22℃에서 150 rpm으로 10분 동안 배양하였다 (Seong et al.
이론/모형
- 1995)와 β-glucuronidase (GUS) reporter gene을 포함하고 있다. Freeze-thaw 방법 (Burrow et al. 1990)으로Agrobacterium tumefaciens LBA4404 strain (Hoekema et al. 1983)에 형질전환하여 균주로 사용하였다. 박테리아는 액체 YEP 배지 (Nutrient broth 13.
- 준비된 잎 절편체와 엽병, 줄기를 공동배양 재료로 사용하였으며, 형질전환 방법은 Jorge 등 (2011)의 방법에 따라 수행하였다. 포도 형질전환 방법은 주로 particle bombardment를 이용해서 유전자를 직접적으로 도입하는 방법 (Vidal et al.
성능/효과
- Agrobacterium을 이용한 포도의 GUS 유전자 발현에 있어서 병원성 유도 배지 내에 첨가되는 acetosyringone의 영향을 조사한 바, acetosyringone이 첨가되지 않은 실험구에서는 GUS 유전자가 발현되는 절편체를 얻을 수 없었으나 100 μM 이상의 acetosyringone 을 병원성 유도 배지에 첨가하였을 경우 GUS 유전자의 발현이 나타났으며 (데이터 미제시), 200 μM의acetosyringone을 처리했을 때 97%로 가장 높은 발현율을 나타냈다 (Table 3).
- 배지 조성에 따른 재분화율 결과를 바탕으로 배지 E와 배지 F에서 탐나라, 흑구슬, 흑보석, 리자마트의 캘러스 형성율과 신초 재분화율을 보았다 (Table 2). BA 2 mg/L을 첨가한 배지보다 TDZ 2 mg/L을 첨가한 배지에서 높은 캘러스 형성율과 신초 재분화율이 관찰되었다. 지금까지 TDZ는 cytokinin과 유사한 역할을 하는 물질로 알려져 있으며 난 (Nayak and Rath 1997)에서 식물체 재분화에 매우 유용하다는 결과가 있었다.
- 2000). BA 및 TDZ의 혼합처리구가 식물체 재분화에 미치는 영향을 검토한 결과 배지 조성을 MS+LSvitamin+Sorbitol+IBA 0.1 mg/L+BA 2 mg/L로 만든 배지 E와 MS + LSvitamin + Sorbitol + IBA 0.1 mg/L + TDZ 2 mg/L로 만든 배지 F 처리구에서 거봉, 탐나라, 흑보석, 리자마트, 탐슨 시들리스의 재분화된 식물체가 많이 관찰되었다 (Table 1). BA 단독 처리구에서 유도된 신초는 외관상 정상적으로 분화하나 신초의 생장이 늦고, TDZ 단독 처리구의 경우는 식물체 재분화 과정에서 외관상 기형을 보인 신초가 발생하였다.
- 따라서 본 연구에서 밝힌 박테리아의 최적 농도는 앞으로 잎 절편체를 이용한 포도 형질 전환 연구에 활용될 수 있을 것으로 생각된다. GUS 발현이 잎, 줄기, 엽병에서 확실하게 나타남으로써 본 연구는 GUS 유전자가 Agrobacterium 공동배양에 의해서 식물체 내에 삽입되어 형질전환이 가능하다는 고무적인 결과를 보여주고 있다. Transient expression system은 DNA 전이가 일어난 후 가급적 빠른 시간 내에 유전자 발현 양상을 측정할 수 있고 형질 전환된 세포가 재분화되기 어려운 경우에 독립적으로 유전자 전이를 분석할 수 있다는 장점을 가지고 있다.
- 박테리아의 전처리 배양 농도와 최종 접종 농도는 다음과 같은 차이를 나타냈다. 균의 전처리 배양 농도 A600nm 0.3에서 최종 접종 농도를 A600nm 0.8로 희석하여 접종한 조건에서 GUS 유전자 발현율이 가장 높게 나타났다. 접종농도 A600nm 1.
- 2002). 따라서 본 연구는 TDZ 2 mg/L의 처리구가 신초 발생 수와 식물체를 분화시키는 조건에 있어 적합하다고 판단된다. 또한 포도 품종에 따른 신초 재분화 상태를 보면 거봉, 탐나라, 탐슨 시들리스, 리자마트의 엽병에서 재분화된 신초의 크기 및 식물체 형성 정도가 리자마트에서 가장 잘 분화되는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig.
- 따라서 포도의 잎을 이용한 GUS유전자 도입 실험에서acetosyringone의 적정 농도는 200 μm로 처리해야 효율적임을 알 수 있었다.
- 따라서 본 연구는 TDZ 2 mg/L의 처리구가 신초 발생 수와 식물체를 분화시키는 조건에 있어 적합하다고 판단된다. 또한 포도 품종에 따른 신초 재분화 상태를 보면 거봉, 탐나라, 탐슨 시들리스, 리자마트의 엽병에서 재분화된 신초의 크기 및 식물체 형성 정도가 리자마트에서 가장 잘 분화되는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. 2). 재분화가 잘 되는 리자마트 품종을 이용해서 A.
- 국내에서는 포도에서 이러한 박테리아의 농도에 따른 외래 유전자나 GUS 유전자의 발현에 대한 보고가 아직 없다. 본 연구에서 나온 결과로 볼 때 식물의 종류 및 품종에 따라 박테리아 농도가 미치는 영향은 현저하게 차이가 나는 것으로 보아, Agrobacterium의 최적 농도를 규명해야 형질전환율을 높일 수 있다고 보여진다. 따라서 본 연구에서 밝힌 박테리아의 최적 농도는 앞으로 잎 절편체를 이용한 포도 형질 전환 연구에 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 8로 희석하여 접종한 조건에서 GUS 유전자 발현율이 가장 높게 나타났다. 접종농도 A600nm 1.0으로 맞춘 조건에서는 GUS 유전자 발현율이 10% 이하로 나타났다 (데이터 미제시). T-DNA의 식물체 내로의 전이에 영향을 미치는 요인 중 Agrobacterium의 농도가 중요하다고 하는 보고가 있는데 (Humara et al.
후속연구
- 본 연구에서 나온 결과로 볼 때 식물의 종류 및 품종에 따라 박테리아 농도가 미치는 영향은 현저하게 차이가 나는 것으로 보아, Agrobacterium의 최적 농도를 규명해야 형질전환율을 높일 수 있다고 보여진다. 따라서 본 연구에서 밝힌 박테리아의 최적 농도는 앞으로 잎 절편체를 이용한 포도 형질 전환 연구에 활용될 수 있을 것으로 생각된다. GUS 발현이 잎, 줄기, 엽병에서 확실하게 나타남으로써 본 연구는 GUS 유전자가 Agrobacterium 공동배양에 의해서 식물체 내에 삽입되어 형질전환이 가능하다는 고무적인 결과를 보여주고 있다.
- 그러나 신초에서 아직 재분화된 식물체(T1)를 얻지 못하여 유전자 도입을 확인하기 위한 PCR과 Southern 확인이 필요하다. 본 연구에서 공동 배양한 포도품종의 수와 절편체의 수에 있어서 정확한 빈도 측정을 위해서는 더 많은 배양재료를 사용해야 할 것으로 판단된다. Agrobacterium 균주의 감염성은 그 균주의 종류에 따라 그리고 식물의 계통, 품종, 배양재료 및 종에 따라서도 다르게 나타나게 되는데, 예로서 벼의 형질전환 연구에서 품종 간 LBA4404 균주의 감염성이 달라진다는 보고가 있다 (Lee et al.
- 지금까지 국내에서 Agrobacterium 공동배양법을 이용한 포도의 형질전환에 대한 결과는 아직 보고된 바가 없다. 본 연구에서는 포도 도입품종인 리자마트에서 형질전환 조건을 규명하였고 이러한 결과들은 포도의 조직배양 효율 향상에 직접 이용될 수 있을 뿐만 아니라 조직배양 기법을 이용한 포도의 형질전환 효율 향상에도 매우 유익하게 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 본 연구에서도 acetosyringone이 첨가되지 않은 배지에서 GUS 유전자가 발현된 포도의 잎 절편체를 얻을 수 없었으므로 200μm 농도의 acetosyringone 첨가는 포도 유전자 전환 연구에 중요한 역할을 할 것으로 사료된다.
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