본 연구에서는 임신진단등의 간편 현장진단(point of care test, POCT)에 주로 사용되고 있는 멤브레인 측면흐름 분석기법을 사용하여 인유두종 바이러스(Human papillomavirus, HPV)의 특정 서열을 검출할 수 있는 DNA array를 개발하였다. HPV type 6, 11, 16, 18, 31, 45에 특이적인 DNA 탐침들을 측면흐름 분석용 멤브레인 표면에 고정하고, biotin이 label된 MY09/11 primer를 사용하여 얻어진 HPV PCR 반응 결과물과 탐침 사이에 hybridization 반응을 유도하였다. 이후 streptavidin이 label된 colloidal gold가 교잡물의 biotin과 반응함으로써 DNA hybridization 결과를 육안으로 확인할 수 있었다. 본 연구를 통해 개발된 HPV DNA lateral flow membrane array는 기존의 HPV DNA chip 기법과 비교하여 경제적이고 편리하게 주요 HPV type을 확인할 수 있음을 보여주었다.
본 연구에서는 임신진단등의 간편 현장진단(point of care test, POCT)에 주로 사용되고 있는 멤브레인 측면흐름 분석기법을 사용하여 인유두종 바이러스(Human papillomavirus, HPV)의 특정 서열을 검출할 수 있는 DNA array를 개발하였다. HPV type 6, 11, 16, 18, 31, 45에 특이적인 DNA 탐침들을 측면흐름 분석용 멤브레인 표면에 고정하고, biotin이 label된 MY09/11 primer를 사용하여 얻어진 HPV PCR 반응 결과물과 탐침 사이에 hybridization 반응을 유도하였다. 이후 streptavidin이 label된 colloidal gold가 교잡물의 biotin과 반응함으로써 DNA hybridization 결과를 육안으로 확인할 수 있었다. 본 연구를 통해 개발된 HPV DNA lateral flow membrane array는 기존의 HPV DNA chip 기법과 비교하여 경제적이고 편리하게 주요 HPV type을 확인할 수 있음을 보여주었다.
This study develops DNA array which can detect specific sequence of human papilomavirus (HPV) by using lateral flow membrane assay which is usually used for point of care test including pregnant diagnosis. Principle of HPV DNA array is as follow; fixing DNA probe which is peculiar to HPV type 6, 11,...
This study develops DNA array which can detect specific sequence of human papilomavirus (HPV) by using lateral flow membrane assay which is usually used for point of care test including pregnant diagnosis. Principle of HPV DNA array is as follow; fixing DNA probe which is peculiar to HPV type 6, 11, 16, 18, 31, 45 on a surface of lateral flow membrane and inducing hybridization response between probe and HPV PCR products which is obtained by using biotin-labeled MY09/l1 primers. And then, we can see the result of DNA hybridization that streptavidin labelled colloidal gold is responded with hybrid biotin. Lateral flow membrane array developed in this study confirms major HPV type economically and conveniently compared with existing HPV DNA chip method.
This study develops DNA array which can detect specific sequence of human papilomavirus (HPV) by using lateral flow membrane assay which is usually used for point of care test including pregnant diagnosis. Principle of HPV DNA array is as follow; fixing DNA probe which is peculiar to HPV type 6, 11, 16, 18, 31, 45 on a surface of lateral flow membrane and inducing hybridization response between probe and HPV PCR products which is obtained by using biotin-labeled MY09/l1 primers. And then, we can see the result of DNA hybridization that streptavidin labelled colloidal gold is responded with hybrid biotin. Lateral flow membrane array developed in this study confirms major HPV type economically and conveniently compared with existing HPV DNA chip method.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
따라서 본 연구에서는 상기 vaccine의 대상이 되는 6종의 HPV 아형의 감염 여부를 신속하고 정확하게 검출하기 위해 각 HPV 아형의 L1 유전자 부위에 특이적인 DNA 탐침(probe)들을 측면 흐름 분석용 멤브레인(lateral flow membrane) 표면에 고정하고, biotin이 label된 MY09/11 primerf- 사용하여 얻어진 HPV PCR 반응 결과물(target DNA)과 탐침 사이에 hybridization 반응을 유도한 후 streptavidin이 label된 colloidal gold가 교잡물 (hybrid)의 biotki과 반응함으로써 DNA hybridization 결과를 육안으로 쉽게 확인할 수 있는 HPV DNA lateral flow membrane array를 개발하고자 하였다.
본 연구에서 HPV DNA array에 상대적으로 민감도가 높은 nested PCR 혹은 HPV type specific primer를 사용하지 못한 것은 각 기법상의 특성에 기인한다. MY PCR의 경우 single round PCR 과정으로 PCR 반응 이전에 urasil nucleotide glycosidase (UNG)를 사용하여 오염발생을 억제 할 수 있지만 nested PCR의 경우에는 두 단계의 PCR로 이루어진 assay 과정에서 PCR 오염을 방지하는 것이 불가능하기 때문이었다.
본 연구에서도 HPV의 LI 유전자를 손쉽게 검출할 수 있는 DNA airay 개발을 목표로 하고 있으며, 특히 자궁경부암 유발 주요 아형(고위험군)인 Type 16, Type 18, Type 31, Type 45 그리고 생식기 사마귀 등을 유발시키지만 암으로의 진행 가능성은 낮은 저위험군 아형으로 Type 6과 Type 11을 분석 목표로 삼고 있는 바, 이 HPV 아형들은 최근에 개발되어 시판되고 있는 Gardasil (MSD, Germany)과 Cervarix (GSK, UK) 등의 HPV 백신(vaccine) 제제에서 목표로 하는 아형들과 동일하다.
제안 방법
190개의 HPV 양성 시료를 대상으로 본 연구에서 개발된 HPV DNA membrane array를 이용하여 HPV typing을 확인하였다(Table 2). HPV type specific primer PCR의 경우 6종의 타깃 HPV type을 102개의 시료에서 확인한 반면, HPV DNA membrane array의 방법으로는 98개의 시료에서 확인되었다.
Colloidal gold conjugate 제조는 Lucocq와 Bawhong의 방법(7) 을 일부 변형하여 수행하였다. Colloidal gold particle 용액 100 ml에 streptavidin (Sigma, USA) 4 mg을 넣어 conjugation 반응을 유도하였고, streptavidiri과 conjugation 된 colloidal gold는 10% BSA (Sigma, USA) 용액으로 blocking 처리하였다.
Hybridization results of the probe layout on strip for the HPV genotypes. Concentrated gold signals of type specific probe hybridize with standard positive DNA PCR amplicons (A) (sample 1, HPV 6; sample2, HPV11; sample3, HPV16; sample4, HPV18; sample5, HPV31; sample6, HPV45) and unknown test sample PCR amplicons from cervical swab sample DNA (B) (sample?, HPV type 16 and 31; sample8, HPV type 6, 11 weak and 18; sample9, HPV type 11 and 31; sample 10, HPV type 6 and 16; samplell, HPV type 11 and 16; sample 12, HPV type 16 and 18; sample 13, HPV type 6 and 11; sample 14, HPV type 11 and 18; samplel5, HPV type 18 and 31; sample 16, HPV type 11 and 45). Left side of figure indicate HPV type specific probe location, p and m in the right side of figure indicate absorbent pad and lateral flow membrane, accordingly.
HPV type specific primei와 HPV DNA array 제작에 사용된 probe들은 National Center for Biotechnology Information (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/)과 Los Alamos National Laboratory HPV Database (http://hpv-web.lanl.gov)의 HPV sequence data base를 기반으로 하였으며, HPV type별 sequence들을 Genetyx software (version 7.03: Genetyx corporation, Japan)로 배열하여 type별 상이 정도를 확인한 후 Primer3 software (http://fokker.wi.mit.edu/ primer3/)를 사용하여 디자인하였다. 모든 primer와 probe는 Bioneer Ltd.
Target sequence 와 특이하게 결합하는 capture probe 를 nitrocellulose membrane에 고착시키기 위한 방법으로 Grabarek와 Gergely의 방법(4)을 일부 변형하여 사용하였다. Canier proteine 일반적으로 사용되는 BSA (Sigma, USA)를, coupling agent로는 l-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) (EDC) (Sigma, USA)를 사용하였다.
본 연구에 사용된 HPV 아형은 6종으로 Type 6, 11, 16, 18, 31, 45 이며, 이는 (재)한국부인암재단과 (주)씨에스엘로부터 제공된 시료로부터 MY11/09 primer (9)를 이용한 HPV screening PCR과 6 종의 HPV type에 대한 type specific primer PCR을 통해 각 아형별 genomic DNA를 확보하였다. PCR의 조건은 HPV screening PCR의 경우 3기에서 5분간 urasil nucleotide glycosidase (UNG) (Promega, USA) 반응을 유도하고 pre-denaturation (95℃, 3분) 후 denaturation (95℃, 30초), annealing (55℃, 30초), extension (72℃, 30초)의 조건으로 40회 반복하였다.
PCR 산물 10 R1에 1 N NaOH 1 μl를 섞어준 뒤 10분간 방치하여 변성시키고, 변성된 PCR 산물에 hybridization buffer 50 μl를 혼합한 후 준비된 HPV membrane array에 주입하였다. 용액이 membrane 표면을 따라 흡수 이동하는데 소요된 시간은 상온에서 10분 정도였으며, 이후 30 μ1의 streptavidin coupled colloidal gold를 membrane에 재주입하였으며, membrane array 표면에서 gold concentration0, ] 의하여 발색 된 violet line의 유무와 위치를 통해 HPV type을 확인하였다.
총 272개의 시료들 중에서 HPV LI gnen의 약 450 bp 서열을 증폭하는 MY09/11 PCR을 통해 1기개의 양성 시료를 확인하였으며, MY09/11 PCR의 결과물을 templates. 하여 150 bp 크기의 내부 서열을 증폭하는 GP5+/GP6+ nested PCR을 통해서는 190개의 양성 시료를 확인함으로써 본 연구에서 사용될 HPV genomic DNA pool을 확보하였다(자료 미제시).
MY09/11 PCR의 결과물을 templates. 하여 150 bp 크기의 내부 서열을 증폭하는 GP5+/GP6+ nested PCR을 통해서는 190개의 양성 시료를 확인함으로써 본 연구에서 사용될 HPV genomic DNA pool을 확보하였다(자료 미제시).
5-20 μg/cm2 로 알려져 있다(14). 하지만 본 연구에서는 DNA를 기반으로 하므로 각기 다른 농도에서의 반응의 강도를 측정, 최적의 coating 조건을 확립하였다. BSA- coupled capture probe를 nitrocellulose membrane 상에 고정시키기 위해 BSA-coupled capture probe를 coating buffer (0.
한편, 본 연구의 대상인 HPV 6종 아형 이외의 HPV PCR 결과물들과의 교차반응 정도를 확인하기 위하여 다양한 type의 HPV DNA를 증폭하여 적용하였다. 이를 위하여 6종 이외의 HPV 양성 시료는 88개 그리고 HPV PCR 음성 시료는 82개 (Table 2)가 사용되었다.
대상 데이터
방법(4)을 일부 변형하여 사용하였다. Canier proteine 일반적으로 사용되는 BSA (Sigma, USA)를, coupling agent로는 l-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) (EDC) (Sigma, USA)를 사용하였다.
본 실험에서 사용한 membranee 측면 이동을 유도하기 위해 polyester 재질로 backing 된 nitrocellulose membrane SA3F171101 (Millipore, USA)을 사용하였고, absorbent pad는 Specimen collection paper No. 470 (S&S Bioscience, Germany)을 적당한 크기로 잘라 사용하였다. 일반적으로 nitrocellulose membrane의 흡착력은 IgG의 경우 0.
본 연구의 HPV DNA array 분석용 primere HPV L1 유전자를 타깃으로 하는 MY11/09 그리고 GP5+/GP6+ (12)를 사용하였으며, MY09의 5, 말단부위에 biotin을 부착하였다.
DNA를 증폭하여 적용하였다. 이를 위하여 6종 이외의 HPV 양성 시료는 88개 그리고 HPV PCR 음성 시료는 82개 (Table 2)가 사용되었다. 본 연구에서 사용된 HPV other type 양성 시료들과 음성 시료들의 경우 HPV DNA array와 HPV specific primer PCR에서 모두 음성 결과를 산출하였다(자료 미제시).
성능/효과
190개의 HPV 양성 시료를 대상으로 type specific primer (Table 1) PCR을 통해 HPV typing을 시행한 결과, 102개의 시료에서 본 연구에서 목표로 하는 6종의 HPV type을 확인할 수 있었다(Table 2). 전체 272개의 시료에서 차지하는 6종의 HPV 아형의 비율은 37.
HPV type specific primer PCR의 경우 6종의 타깃 HPV type을 102개의 시료에서 확인한 반면, HPV DNA membrane array의 방법으로는 98개의 시료에서 확인되었다. Type 별로는 HPV type 16, 6, 31, 45에서 각각 1개씩의 시료에서 type 확인이 되지 않았는 바, HPV DNA membrane array와 HPV type specific primer PCR의 결과 일치도는 96.07%를 보임으로써, 본 연구에서 개발한 HPV DNA membrane array가 약 3% 낮은 민감도를 나타내었다.
이를 위하여 6종 이외의 HPV 양성 시료는 88개 그리고 HPV PCR 음성 시료는 82개 (Table 2)가 사용되었다. 본 연구에서 사용된 HPV other type 양성 시료들과 음성 시료들의 경우 HPV DNA array와 HPV specific primer PCR에서 모두 음성 결과를 산출하였다(자료 미제시). 이는 본 연구에서 사용되었던 HPV DNA memebrane array의 probe 및 HPV type specific primer들과 교차반응 정도가 매우 낮았기 때문으로 보인다.
Figure 2의 (B)는 HPV 중복 감염 시료들을 적용한 결과를 나타낸 그림으로 각 membrane array 상에 2종 혹은 3종의 HPV type 발색 line을 확인할 수 있었다. 아울러 각 membrane array 표면에서 다른 type의 probe 고정 위치에서 비 특이반웅에 의한 발색은 나타나지 않아 probe와 PCR 결과물 간의 반응 특이도가 매우 높음을 확인 할 수 있었다.
이는 본 연구에서 사용되었던 HPV DNA memebrane array의 probe 및 HPV type specific primer들과 교차반응 정도가 매우 낮았기 때문으로 보인다. 아울러 음성 시료들의 경우에 도비 특이 반응이나 위양성 반응을 나타내지 않음으로써 본 연구에서 개발된 HPV DNA array의 반응 특이도가 매우 높음을 확인할 수 있었다.
본 연구에서 목표로 하는 6종의 HPV type을 확인할 수 있었다(Table 2). 전체 272개의 시료에서 차지하는 6종의 HPV 아형의 비율은 37.6%, HPV 양성 190개(6종의 HPV type과 HPV other types)의 시료 중에서는 53.6%의 높은 비율를 나타내었고, 특히 HPV type 16과 18 그리고 31과 같이 발암 가능성이 높은 아형의 경우 HPV 양성 시료 중에서 26.8%로 매우 높은 분포를 나타내었다. 이는 본 연구의 HPV DNA array와 머크 (MSD, Germany), 그락소(GSK, UK)와 같은 제약회사의 HPV 백신에서 왜 상기 6종의 아형을 타깃 type으로 하고 있는 지를 잘 설명하고 있다.
후속연구
이는 PCR product와 colloidal gold를 함께 membrane에 주입할 경우 colloidal gold 표면의 극성이 PCR product와 probe 사이의 hybridization을 방해하여 일어나는 현상으로 추정되고 있다. 현재 이러한 현상을 개선할 추가적인 연구를 수행하고 있으며, 향후 이러한 문제점만 보완한다면 기존의 protein을 타깃으로 하는 lateral flow test 제품처럼 분석 과정이 간편하고 별도의 분석 장비를 필요로 하지 않는다는 특성을 가진 DNA 진단용 현장 검사 키트의 생산도 가능할 것으로 기대된다.
참고문헌 (19)
Baay, M.F., W.A. Tjalma, J. Weyler, G. Goovaerts, P. Buytaert, E.A. van Marck, F. Lardon, and J.B. Vermorken. 2001. Human papillomavirus infection in the female population of Antwerp, Belgium: prevalence in healthy women, women with premalignant lesions and cervical cancer. Eur. J. Gynaecol. Oncol. 22, 204- 208
Van Den Brule, A.J.C., J.M.M. Walboomers, M. Du Maine, P. Kenemans, and C.J.L.M. Meijer. 1991. Difference in prevalence of human papillomavirus genotypes in cytomorphologically normal cervical smears is associated with a history of cervical intraepithelial neoplasia. Int. J. Cancer 48, 404-408
Corstjens, P., M. Zuiderwijk, A. Brink, S. Li, H. Feindt, R.S. Niedbala, and H. Tanke. 2001. Use of up-converting phosphor reporters in lateral-flow assays to detect specific nucleic acid sequences: A rapid, sensitive DNA test to identify human papillomavirus type 16 infection. Clin. Chem. 47, 1885-1893
Iwasawa, A., P. Nieminen, M. Lehtinen, and J. Paavonen. 1996. Human papillomavirus DNA in uterine cervix squamous cell carcinoma and adenocarcinoma detected by polymerase chain reaction. Cancer 77, 2275-2279
Jacobs, M.V., J.M. Walboomers, P.J. Snijders, F.J. Voorhorst, R.H. Verheijen, N. Fransen-Daalmeijer, and C.J. Meijer. 2000. Distribution of 37 mucosotropic HPV types in women with cytologically normal cervical smears: the age-related patterns for high-risk and low-risk types. Int. J. Cancer 87, 221-227
Lucocq, J.M. and W. Baschong. 1986. Preparation of protein colloidal gold complexes in the presence of commonly used buffers. Eur. J. Cell Biol. 42, 332-337
Manos, M.M., Y. Ting, D.K. Wright, A.J. Lewis, T.R. Broker, and S.M. Wolinsky. 1989. The use of polymerase chain reaction amplification for the detection of genital human papillomaviruses. Cancer Cell. 7, 209-214
Pease, A.C., D. Solas, E.J. Sullivan, M.T. Cronin, C.P. Holmes, and S.P. Fodor. 1994. Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5022-5026
Prendiville, W. and P. Davies. 2004. The human papillomavirus. In W. Prendiville and P. Davis (eds.), The Health Professionals HPV Handbook: Human papillomavirus and cervical cancer, 1 of 3rd ed., p. 11-26. Taylor and Francis, Oxford
De Roda Husman, A.M., J.M.M. Walboomers, A.J.C. Van De Brule, C.J.L.M. Meijer, and P.J.F. Snijders. 1995. The use of general primers GP5 and GP6 elongated at their 3' ends with adjacent highly conserved sequences improves human papillomavirus detection by PCR. J. Gen. Virol. 76, 1057-1062
Shyu, J.S., C.J. Chen, C.C. Chiu, S.C. Huang, and H.J. Harn. 2001. Correlation of human papillomavirus 16 and 18 with cervical neoplasia in histological typing and clinical stage in Taiwan: an in-situ polymerase chain reaction approach. J. Surg. Oncol. 78, 101-109
Smits, H.L., L.M. Tieben, S.P. Tjong-A-Hung, M.F. Jebbink, R.P. Minnaar, C.L. Jansen, and J. Ter Schegget. 1992. Detection and typing of human papillomaviruses in fixed and stained archival cervical smears by a consensus polymerase chain reaction and direct sequence analysis allowing the identification of a broad spectrum of human papillomavirus types. J. Gen. Virol. 73, 3263-3268
Sotlar, K., D. Diemer, A. Dethleffs, Y. Hack, A. Stubner, N. Vollmer, S. Menton, M. Menton, K. Dietz, D. Wallwiener, R. Kandolf, and B. Bltmann. 2003. Detection and typing of human papillomavirus by E6 nested multiplex PCR. J. Clin. Microbiol. 3176-3184
Stuyver, L., R. Rossau, A. Wyseur, M. Duhamel, B. Vanderborght, H. Van Henverswyn, and G. Maertens. 1993. Typing of hepatitis C virus isolates and characterization of new subtypes using a line probe assay. J. Gen. Virol. 74, 1093-1102
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.