초록

○ 연구결과
단일 생균제제로 SKU-78 액상제제와 고상제제 TS3-7를 개발하였으며, 기존 사용 농약에 대해 내성을 가지면서, 서로 다른 발병 억제 기작을 갖는 균주들과 식물 성장호르몬 생산 균주로 구성된 복합체 A (TS1-5+ SKU-78+A100-1) 및 복합체 B(TS3-7+B361-5+SKU-78+A253-16)를 개발하여 농가 포장에서 효능을 검정하였다.

Abstract ▼

The biological control of plant pathogens is of paramount importance nowadays in respond to the increasing public concern for the environment and health. However, strategies for biological control of bacterial wilt is still in a developmental stage. Bacterial wilt, caused by Ralstonia solanacearum,

The biological control of plant pathogens is of paramount importance nowadays in respond to the increasing public concern for the environment and health. However, strategies for biological control of bacterial wilt is still in a developmental stage. Bacterial wilt, caused by Ralstonia solanacearum, is one of the most severe disease of economically important crops such as tomato, pepper, potato and banana. Unfortunately, due to the capacity to survive in soil and water habitats for considerable periods of time, it is difficult to eradicate Ralstonia solanacearum.
The mechanisms involved in disease suppression by antagonistic strains are diverse; production of secondary metabolites which directly inhibit the pathogen, iron-chelating siderophores, plant growth promotion by rhizobacteria leading to disease escape by shortening the time that a plant is in a susceptible state, and an induced systemic resistance, defined as a state of increased defesive capacity developed by the plant, stimulated through diverse agents.
In order to develop biocontrol agent against Ralstonia solanacearum, the potential biocontrol strains were screened on the basis of mode of action. Strains were selected according to their pathogen-inhibition zones on artificial media, siderophore production and root colonizing abilities. Active and long-term colonization of the root surface of the plant is generally considered prerequisites for successful suppression of soilborne disease by rhizobacteria directly through production of antimicrobial substances or competition for space, nutrients and ecological niches, and indirectly through induction of systemic resistance.
The selected strains on the basis of mode of action can suppress bacterial wilt disease when applied to roots or seeds of crop plants. Soil drench of strain suspension resulted in improved suppression than seed treatment. Seed treatment followed by soil drench application resulted in great reduction of bacterial wilt disease symptoms up to 70 %.
The strains showing strong inhibitory activities against Ralstonia solanacearum, were selected by paper disk method and the purification of active compounds from the producing cultures were carried out.
The active compound 100-1 produced by strain 100-1 was purified by ethyacetate extraction, silica gel chromatography, Sephadex LH-20 chromatography and HPLC. 100-1 compound was soluble in methanol, butanol, acetone chloroform, but insoluble in hexane and water. The compound exhibited activity aganst plant fungal pathogen, Phytophthora parasitica, Phytophthora capsic, and Botrytis cinerea.. The compound was positive to Orcinol Ferric chloride. and negative to 4-dimethylaminobenzaldehyde,
Aniline-diphenylamine, ninhydrin, Dragendorff's reagent and Antimony trichloride. UV spectrum of this compound showed a maximum peak at 234, 272 and 284 nm. The molecular weight was determined to be 1065 by mass spectrum.
The active compound produced by A 27-3 strain was isolated by butanol extraction, silica gel chromatography, Sephadex LH-20 chromatography and HPLC. The purified compound was soluble in methanol, butanol and acetone, but insoluble in hexane and chloroform. The color reaction of this compound with 4-dimethylaminobenzaldehyde-HCl, Orcinol ferric chloride and Ninhydrin appeared to be positive, but reaction with ferric chloride, aniline-diphenylamine, Dragendorff's reagent and antimony trichloride to be negative. This compound showed antimicrobial activity against Escherichia coli, and fungal pathogen, Phytophthora parasitica, Phytophthora capsici, Penicillium sp., Rhizopus stronifer and Botrytis cinerea.
The active compound produced by A 47-2 strain was purified by ethylacetate extraction, silica gel chromatography and thin layer chromatography. The compound was analyzed by TLC with solvent system : chloroform-methanol, 1:1and detected at an rf value of 0.8 by UV absorption. This compound was positive to Orcinol Ferric chloride and negative to 4-dimethylaminobenzaldehyde, Aniline-diphenylamine, ninhydrin and Dragendorff's reagent The compound showed antimicrobial activity against Staphylococcus aureus, Phytophthora parasitica, Phytophthora capsis. UV spectrum of this compound showed a maximum peak at 210, 234, 272 and 284nm. A 42-2 strain was identified to be Arthrobacter sp.
The active compound produced by A256-10 was purified by Diion HP 20, silica gel chromatography, Sephadex LH-20 chromatography, solid phase extraction (C18 reverse phase) and HPLC. The purified compound was soluble in methanol, butanol, acetone and chloroform but insoluble in hexane.
The color reaction of this compound with antimony trichloride, aniline-diphenylamine, orcinol ferric chloride and Ninhydrin appeared to be positive, but reaction with ferric chloride, Dragendorff's reagent and 4-dimethylaminobenzaldehyde-HCl to be negative. UV spectrum of this compound showed a maximum peak at 223.4 and 275nm. Peak at 223.4 nm was shifted to 212.6nm by NaOH addition. A 256-10 strain was identified to be Bacillus subtilis.
The active compound produced by A256-11 strain was purified by butanol extraction, HP-20 adsorption chromatography, silica gel chromatography, Sepadex LH-20 chromatography, and HPLC. The compound was positive to ferric chloride and ninhydrin and negative to antimony trichloride, aniline-diphenylamine, orcinol ferric chloride.
Six stains of plant growth promoting rhizobacteria were selected through germinating seed assay and root colonization assay. Among them,
SKU-78 strain induced significant suppression of bacterial wilt disease in tomato and pepper plants. Seed treatment followed by soil drench application with this strain resulted in over 60% reduction of bacterial wilt disease compared with the control. It was suggested that SKU-78 strain activated the host defense systems in plants, based on lack of direct antibiosis against pathogen. According to Bergey's Manual of Systemic Bacteriology and 16S rDNA sequence data, SKU-78 stain was identified as Bacillus sp. SKU-78.
Among the root colonizing and plant growth promoting bacteria isolated from the bacterial wilt suppressive soil, five strains were detected to produce siderophores by CAS agar assay. The most effective isolate, TS3-7 strain induced significant suppression of bacterial wilt disease in tomato and pepper plants. Seed treatment followed by soil drench application with this strain resulted in over 80% reduction of bacterial wilt disease compared with the control. Significant disease suppression by TS3-7 strain was related to the production of siderophore. Besides iron competition, induction of resistance of the host plant with siderophore was suggested to be another mode of action that suppress bacterial wilt, based on the lack of direct antibiosis against pathogen in vitro. According to Bergey's Manual of Systemic Bacteriology and 16S rDNA sequence data, TS3-7 stain was identified as Pseudomonas sp. TS3-7.
The efficacy of the selected individual biocontrol strain and strain combinations was assessed. TS3-7 strain suppress bacterial wilt by effectively competing for iron through the production of siderophore. SKU-78 strain induced systematic resistance against bacterial wilt. A 253-16 strain showed strong antibiosis against Ralstonia solanacearum. Strain B361-5 produced plant growth hormone. When TS3-7, SKU-78, A253-16 and B361-5 were mixed through soil together, disease suppression was enhanced significantly compared to individual strain, suggesting that combining biocontrol strains can lead to more effective biocontrol of bacterial wilt.
Also, pesticide tolerant isolates were selected to develop the integrated system of biological and chemical control. Combined treatment with the biocontrol agent and an pesticide reduced disease more than treatment with either biocontrol agent or pesticide alone
Environmental conditions involving both chemical factors (substrate concentration, media design) and physical factors (temperature, incubation time, pH and aeration) were optimized economically.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 21
• CONTENTS ... 26
• 목차 ... 31
• 제1장 연구 개발 과제의 개요 ... 35
• 제2장 국내외 기술 개발 현황 ... 38
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 48
• 1절 풋마름병균에 대한 길항 미생물의 분리, 동정 및 작용기작 연구 ... 48
• 1. 서론 ... 48
• 2. 재료 및 방법 ... 49
• 가. 공시 토양으로부터 미생물의 분리 ... 49
• 1) 토양 미생물의 분리 및 배양 ... 49
• 2) 근면, 근권 미생물 분리 ... 50
• 3) ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylate) deaminase activity 활성 균주 선발 ... 52
• 나. 작용기작에 입각한 풋마름병균 길항 미생물의 선발 ... 54
• 1). antibiosis 기작에 의한 풋마름병균 저해균주의 선발 ... 54
• 2). siderophore 생산 균주의 선발 ... 55
• 3). root colonization and elongation assay ... 55
• 4). Plant growth hormone 생산 균주의 선발 ... 56
• 다. in vivo pot assay 에 의한 풋마름병 발병 억제효과 검정 ... 56
• 라. 선발균주의 antimicrobial spectrum 조사 ... 57
• 마. 선발균주의 동정 ... 57
• 3. 실험 결과 및 고찰 ... 58
• 가. 공시토양 채취 및 토양미생물의 분리 ... 58
• 나. 작용기작에 의한 풋마름병균 길항 미생물의 선발 ... 58
• 1) Antibiosis 기작 group ... 59
• 2) Siderophore 생산 group ... 59
• 3) Root colonization competition 과 root elongation group ... 60
• 4) Plant growth hormone 생산 group ... 61
• 다. 작용기작 별 선발 활성 균주의 in vivo pot assay에 의한 풋마름병 억제 활성 검정 ... 64
• 라. 선발균주의 antimicrobial spectrum ... 69
• 마. 선발 균주의 동정 ... 71
• 2절 토양 미생물이 생산하는 풋마름병균 저해 활성 물질의 분리 및 정제 ... 91
• 1. 서론 ... 91
• 2 재료 및 방법 ... 92
• 가. 선발균주의 배양 ... 92
• 나. 생리활성 물질 분리를 위한 선행 실험 ... 92
• 다. 활성물질의 항균 spectrum조사 ... 93
• 라. 활성물질의 이화학적 특성조사 ... 94
• 마. 활성물질의 기기 분석 ... 95
• 1) UV spectrometry ... 95
• 2) HPLC ... 95
• 3) Mass spectrophotometry ... 95
• 4) 1H NMR spectrophotometry ... 95
• 3. 결과 및 고찰 ... 96
• 가. A100-1이 생산하는 활성물질의 분리, 정제 및 특성 연구 ... 96
• 1) 예비실험 결과 ... 96
• 2) 활성물질 100-1의 분리 정제 ... 96
• 3) A100-1 활성물질의 이화학적 특성 ... 99
• 4) A100-1의 균주 동정 ... 103
• 나. A27-3이 생산하는 활성물질의 분리, 정제 및 특성 연구 ... 104
• 1) 예비실험 결과 ... 104
• 2) A27-3 활성물질의 분리 정제 ... 104
• 3) A27-3 활성물질의 이화학적 특성 ... 107
• 4) A27-3의 균주 동정 ... 110
• 다. A47-2가 생산하는 활성물질의 분리, 정제 및 특성 연구 ... 111
• 1) 예비실험 결과 ... 111
• 2) A47-2 활성물질의 분리 정제 ... 111
• 3) A47-2 활성물질의 이화학적 특성 ... 114
• 4) A47-2의 균주 동정 ... 116
• 라. A256-10이 생산하는 활성물질의 분리 및 정제 ... 117
• 1) 예비실험 결과 ... 117
• 2) A256-10 물질의 분리 정제 ... 117
• 3) A256-10 활성물질의 이화학적 특성 ... 121
• 4) A256-10의 균주 동정 ... 126
• 마. A256-11이 생산하는 활성물질의 분리 및 정제 ... 127
• 1) 예비실험 결과 ... 127
• 2) A256-11 물질의 분리.정제 ... 127
• 3) A256-11의 이화학적 특성 ... 130
• 4) A256-11의 균주 동정 ... 132
• 바. A253-16이 생산하는 활성물질의 분리 및 정제 ... 133
• 1) 예비실험 결과 ... 133
• 2) A253-16 물질의 분리·정제 ... 133
• 3) A253-16 활성물질의 이화학적 특성 ... 136
• 4) A253-16의 균주 동정 ... 138
• 사. A254-10이 생산하는 활성물질의 분리 및 정제 ... 139
• 1) 예비실험 결과 ... 139
• 2) A254-10 활성물질의 분리 정제 ... 139
• 3) A254-10의 이화학적 특성 ... 142
• 4) A254-10의 균주 동정 ... 144
• 3절 풋마름병균의 길항 세균 SKU-78의 동정 및 특성 연구 ... 145
• 1. 서론 ... 145
• 2. 재료 및 방법 ... 146
• 가. 병원균 확보 및 배양 ... 146
• 나. 근권 미생물의 분리 및 배양 ... 146
• 다. Germinating seed assay ... 146
• 라. 종자 처리 ... 147
• 마. 포트실험 ... 147
• 바. 포장실험 ... 148
• 사. SKU-78균주의 antimicrobial activity ... 148
• 아. 선발 균주의 동정 ... 149
• 3. 결과 ... 149
• 가. 활성균주의 선발 ... 149
• 나. 선발균주의 배양 ... 150
• 다. 선발균주에 의한 발병 억제 효과 ... 151
• 1) 포트 실험 ... 151
• 2) 포장 실험 ... 152
• 라. SKU-78 균주의 항균활성 ... 155
• 마. SKU-78 선발균주의 동정 ... 156
• 1) 형태학적 특성 ... 156
• 2) 생화학적 특성 ... 156
• 3) 온도 내열성 검토 ... 157
• 4) 16s rDNA sequence 분석 ... 158
• 4절 Fluorescent siderophore 생산균주, TS3-7에 의한 풋마름병 발병 억제 ... 160
• 1. 서론 ... 160
• 2. 재료 및 방법 ... 161
• 가. 병원균 확보 및 배양 ... 161
• 나. 근권 미생물의 분리 ... 161
• 다. colonization assay ... 162
• 라. Siderophore 생산균주 선발 ... 162
• 마. 선발 균주의 풋마름병균에 대한 in vitro 길항 활성 검정 ... 163
• 바. 선발 균주에 의한 종자 코팅 처리 ... 163
• 사. in vivo pot assay ... 163
• 아. 선발 균주의 생균밀도 유지 측정 ... 164
• 자. 선발 균주의 동정 ... 164
• 차. 선발 균주가 생산하는 Siderophore의 characterization ... 165
• 3. 결과 및 고찰 ... 165
• 가. 활성균주의 분리 ... 165
• 나. Fluorescent siderophore 생산 ... 165
• 다. 풋마름병 발병억제 효과 ... 168
• 라. TS 3-7 균주의 풋마름병균에 대한 길항작용 ... 170
• 마. TS 3-7 균주의 항균활성 ... 170
• 바. 생균 밀도유지 ... 171
• 사. 선발균주의 동정 ... 174
• 1) 배양. 생화학적 특성 ... 174
• 2) 16S rDNA sequence ... 175
• 아. 선발 균주가 생산하는 Siderophore의 characterization ... 176
• 5절 풋마름병 방제용 복합 미생물 제제의 제조와 포장 효과 검정 ... 177
• 1. 서론 ... 177
• 2. 재료 및 방법 ... 178
• 가. 활성균주의 농약 내성 검정 ... 178
• 나. 선발된 균주간의 길항작용 여부 확인 ... 179
• 다. Pot 실험에 의한 선발균주 mixture의 풋마름병 방제 효과 검정 ... 179
• 라. 포장에서의 복합제제의 풋마름병 억제 효과 검정 ... 179
• 마. 생균 안정성 제고를 위한 carrier 및 amendment 선발 ... 180
• 1) Carrier 선발 ... 180
• 2) Amendment 선발 ... 180
• 4. 결과 및 고찰 ... 180
• 가. 선발균주의 농약 내성 조사 ... 180
• 나. 선발된 균주간의 길항성 여부 확인 ... 183
• 다. 선발균주를 이용한 복합 미생물 제조 및 in vivo pot 실험을 통한 풋마름병 방제효과 검정 ... 185
• 라. 포장에서의 복합제제의 풋마름병 억제 효과 검정 ... 190
• 마. 생균 안정성 제고를 위한 carrier 및 amendment 선발 ... 192
• 1) carrier 선발 ... 192
• 2) Amendment 선발 ... 194
• 6절 선발균주의 실용화를 위한 대량 배양 기술 확립 ... 196
• 1. 서론 ... 196
• 2. 재료 및 방법 ... 196
• 가. 대량배양을 위한 산업용 배지 선택과 발효 조건 분석 ... 196
• 1) 산업용 배지 선택과 배양조건 ... 196
• 2) 발효기에서의 배양특성 분석 ... 197
• 나. 생균 안정성 제고를 위한 carrier 및 amendment 선발 ... 199
• 1) Carrier 선발 ... 199
• 2) Amendment 선발 ... 199
• 3) 액상 수화제의 제조 및 효과검정 ... 199
• 3. 결과 및 고찰 ... 200
• 가. 선발 균주의 대량배양조건 확립 ... 200
• 나. 발효기에서의 배양적 특성 조사 ... 206
• 다. SKU-78 균주의 안정성 제고를 위한 carrier 및 amendment 선발 ... 212
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 213
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 215
• 제6장 참고문헌 ... 216
• 끝페이지 ... 226