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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 DBcAMP와 RA를 이용하여, desmin 및 SMMHC와 SMaA 단백질의 발현여부를 확인하여 궁극적으로는 마우스 배아 줄기세포가 평활근세포로 분화 되는지를 알아보았다.
- 다양하게 진행되고 있다. 본 연구에서는 DBcAMP 및 RA가 마우스 배아줄기세포를 평활근세포로 분화시킬 수 있는지를 알아보고자 하였다.
- 이와 같은 기초자료를 바탕으로 하여 조직재생 학적인 관점에서 배아줄기세포를 평활근 세포로 분화를 유도한 후 혈관 손상 등의 치료개선 및 장기의 기능을 회복시키는 가능성을 제시하고자 한다.
가설 설정
- Confirmation of undifferentiated mouse ES cells. A. Protein expressions represent 50-60 kDa of Oct 4 and 41 kDa of p-actin. B.
제안 방법
- 줄기세포로부터 추출했다. 3㎕의 RNA에 2㎕의 Oligo-dT primer를 넣고 reverse transcription system kit (AccuPower RT Pre-Mix, KoreaX 이용하여 cDNA를 합성하기 위해 42r 60분, 94℃ 5분, 역전사시켰다. 그 후 RT 산물 3-5㎕를 PCR kit (Accupower PCR PreMix, Korea)로 증폭시켰다.
- 배양접시에 배지(LIF 및 Pmercaptoethanol을 제거하고, 20% 혈청첨가) 를 첨가해서 3일간 배양하여 6일째 되는날에 gelatin 처리를 한 배양접시에 세포를 분주해서 24시간정도 배양접시에 부착시켰다. 7, 8, 9일째 되는 날에 10nM의 RA와 0.5mM의 DB-cAMP를 처리하고 배지는 매일 교체하였다.
- 5% Triton X-100을 처리후 3% BSA으로 차단시켰다. Anti-SMA(clone 1A4; Sigma)를 1:5000으로 희석해서 처리 후 공촛점 현미경(fluoview 300, Olympus)으로 확인하였다.
- 옮겼다. Blotse TEST [10mM Tris-HCl, (pH 7.6), 150mM NaCl, 0.05% Tween-20]으로 세정한 후, 막은 5% 탈지유로 1시간동안 차단한 다음, 권장된 농도에 맞춰서 적절한 L차 항체로 배양했다. 그 다음 막을 세정하고, goat anti-rabbit IgG 또는 horseradish peroxidase를 부착시킨 goat antimouse IgG로 1 차 항체를 검출하였다.
- 배양했다. DMEM 배지에는 3.7g/L sodium bicarbonate, 1% penicillin과 streptomycin, 1.7 mM L-glutamine, 0.1 mM P-mercaptoethanol, 5 ng/mt mouse leukemia inhibitory factor 및 15% fetal bovine serum (FBS)를 첨 가하였다. Embryonic stem cell-embryoid body (ESC-EB)를 만들기 위해서 트립신 처리를 한후, 72 시 간동안 hanging drop(10 ㎕)으로 배 양접시에 분주했다.
- SMaA의 sequence는 forward CGCTGTC-AGGAACCCTGAGA, reverse CGAAGCCGGCC-TTACAGA, SMMHC의 sequence는 forward TGGACACCATGTCAGGGAAA, reverse AT-GGACACAAGTGCTAACtCAGTCT. p-Actine PCR의 RNA의 양에 따라 조절하여 수행하였다.
- 05% Tween-20]으로 세정한 후, 막은 5% 탈지유로 1시간동안 차단한 다음, 권장된 농도에 맞춰서 적절한 L차 항체로 배양했다. 그 다음 막을 세정하고, goat anti-rabbit IgG 또는 horseradish peroxidase를 부착시킨 goat antimouse IgG로 1 차 항체를 검출하였다. 밴드는 enhanced chemiluminescence (Amersham Pharmacia Biotech, England, UK)로 확인하였다.
- 배아체를 4%의 paraformaldehyde에 10분 고정하고 PBS 로 세정한 후, 0.5% Triton X-100을 처리후 3% BSA으로 차단시켰다. Anti-SMA(clone 1A4; Sigma)를 1:5000으로 희석해서 처리 후 공촛점 현미경(fluoview 300, Olympus)으로 확인하였다.
- Embryonic stem cell-embryoid body (ESC-EB)를 만들기 위해서 트립신 처리를 한후, 72 시 간동안 hanging drop(10 ㎕)으로 배 양접시에 분주했다. 배양접시에 배지(LIF 및 Pmercaptoethanol을 제거하고, 20% 혈청첨가) 를 첨가해서 3일간 배양하여 6일째 되는날에 gelatin 처리를 한 배양접시에 세포를 분주해서 24시간정도 배양접시에 부착시켰다. 7, 8, 9일째 되는 날에 10nM의 RA와 0.
대상 데이터
- 마우스 배 아줄기 세 포는 DMEM (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) 배지에서 배양했다. DMEM 배지에는 3.
- 마우스 배 아줄기 세포는 ATCC (ESE14-TG2a) 로부터, fetal bovine serume Bio-whittaker (Walkersile, MD, USA)로부터, All-trans retinoic acid (atRA)는 Sigma (St. Louis, MO, USA)로부터 , Dibutyryl adenosine 3, 5- cyclic monophosphate (DBcAMP)는 Roche (Indianapolis, IN) 에 서, RT-PCR용 SMaA (for~ward, reverse), SMMHC (forward, reverse) sequence는 Biomed chemical company (Seoul, Korea)에서 , Westernblot 용 desmine Santa Cruz Biotechnology (Delaware, CA, USA)에서 각각 구입하였다.
- 총 RNA는 Tel-Test InC (Friendwood, Tex, USA)로부터 구입한 STAT-60, 페놀과 guanidine isothiocyanate 용액을 사용하여 마우스 배아 줄기세포로부터 추출했다. 3㎕의 RNA에 2㎕의 Oligo-dT primer를 넣고 reverse transcription system kit (AccuPower RT Pre-Mix, KoreaX 이용하여 cDNA를 합성하기 위해 42r 60분, 94℃ 5분, 역전사시켰다.
데이터처리
- 모든 실험은 ANOVA를 이용해서 분석한 후, Bonnferroni Dunn test를 이용하여 대조군과 평균을 비교해서 분석하였다. P <0.
성능/효과
- 그리고 미분화된 세포에서는 desmin 발현이 매우 낮지만, 실험군에서는 시간 의존적으로 발현 양상이 뚜렷하게 증가하였다. Desmin 단백질 발현이증가되는 것으로 보아 이들 세포가 정상적으로 평활근세포로 분화되었음을 알 수 있었다. 결론적으로 마우스 배아줄기세포에 DB-cAMP 및 RA를 처리하면 평활근세포의 표지인자인 SM- MHC 및 SMti A mRNA 발현 이 증가되었다.
- 결론적으로 마우스 배아 줄기세포는 DBcAMP 및 RA 영향으로 SMMHC 및 SMa A mRNA 발현이 증가되고, desmin 단백질 발현도 증가되는 것으로 보아 이들 세포가 정상적으로 평활근세포로 분화되었음을 알 수 있었다.
- Desmin 단백질 발현이증가되는 것으로 보아 이들 세포가 정상적으로 평활근세포로 분화되었음을 알 수 있었다. 결론적으로 마우스 배아줄기세포에 DB-cAMP 및 RA를 처리하면 평활근세포의 표지인자인 SM- MHC 및 SMti A mRNA 발현 이 증가되었다.
- 그러나 DB-cAMP 및 RA를 처리하여 분화를 유도한 실험군에서는 배아체의 형태가 관찰되었으며(Fig 20, 분화된 마우스 배아줄기세포에서는 SMaA의 발현양상이 뚜렷하게 나타났다(Fig 2D).
- 면역형광항체염색 결과 대조군에서는 마우스 배아줄기세포의 분화가 관찰되지 않았으며, SMaA도 거의 발현되지 않았다. 그러나 DBcAMP 및 RA를 처리하여 분화를 유도한 실험군에서는 배아체의 형태가 관찰되었고, SMaA의 발현양상도 뚜렷하게 나타났다. SMMHC는 대조군에 비해서 mRNA 의 발현양상이 뚜렷하였으며, SMaA의 경우는 mRNA가 발현되었지만, 15일이 경과하면 감소되는 양상이었다.
- 이 결과는 면역 형광 항체염색에서도 동일하게 관찰되었으며, LIF를 처리한 대조군에서는 SMaA는 거의 발현되지 않았다. 그러나 DBcAMP 및 RA를 처리하여 분화를 유도한 실험군에서는 배아체의 형태가 관찰되었으며, 분화된 세포에서는 SMaA 발현양상이 뚜렷하게 나타났다.
- SMMHC는 대조군에 비해서 mRNA 의 발현양상이 뚜렷하였으며, SMaA의 경우는 mRNA가 발현되었지만, 15일이 경과하면 감소되는 양상이었다. 그리고 미분화된 세포에서는 desmin 발현이 매우 낮지만, 실험군에서는 시간 의존적으로 발현 양상이 뚜렷하게 증가하였다. Desmin 단백질 발현이증가되는 것으로 보아 이들 세포가 정상적으로 평활근세포로 분화되었음을 알 수 있었다.
- 마우스 배아줄기 세포를 DBcAMP 및 RA를 첨가해서 배양하고 SMaA과 SMMHC의 발현 정도를 RT-PCR을 통해 관찰한 결과, SMMHC 는 대조군에 비해 5일, 7일, 15일에서 시간 의존적으로 mRNA의 발현 양상이 뚜렷하게 나타났다(Fig 3A).
- 그리고 미분화된 세포와 DBcAMP 및 RA를 처리하여 분화된 배아체의 형태가 관찰되었다. 면역형광항체염색 결과 대조군에서는 마우스 배아줄기세포의 분화가 관찰되지 않았으며, SMaA도 거의 발현되지 않았다. 그러나 DBcAMP 및 RA를 처리하여 분화를 유도한 실험군에서는 배아체의 형태가 관찰되었고, SMaA의 발현양상도 뚜렷하게 나타났다.
- 평활근 세포로 분화할 때 desmin의 발현수준이 낮으면 2 차적으로 근세관의 형성이 감소되지만, 배아체가 형성되면 desmin mRNA와 단백질이 축적 된다고 하였다23). 본 연구에서 desmin의 발현 정도를 조사한 결과 대조군에서는 매우 낮지만, 실험군 에서는 5일에서 15일로 시간 경과에 따라 시간 의존적으로 desmin 발현 양상이 뚜렷이 증가하였다. 이와 같은 결과는 근육 특이적인 중간필라멘트 단백질인 desmine 근모 세포에서는 낮은 수준으로 나타나지만, 분화가 시작되면 몇 배 증가하여 발현되며27), MyoD, Myogenin, MRF4와 Myf5 등에 의해 활성이조절된다28).
- 그리고 혈 관 특유표지 인 (platelet endothelial cell adhension molecule, PEC AM) 는 미분화된 쥐의 배아줄기세포에서는 발현되지 않는다고 보고하였다 21). 본 연구에서는 DBcAMP 및 RA 첨가해서 마우스 배아줄기세포를 배양하고 SMaA과 SMMHC의 발현 정도를 관찰한 결과 SMMHC는 대조군에 비해 5일, 7일, 15 일에서 mRNA의 발현 양상은 뚜렷하였다. 시험관 내에서도 배양조건에 따라 신경세포가 평활근 세포로 분화하면서 세포형태학적, 시간의 존적 으로 평 활근세포 표지 인자 (SM22alpha, SMMHC, APEG-1, Smooth muscle alphaaction)로 분화되었다는 결과와도 일치하였다22.
- 이 결과는 내세포덩어리에서 외배엽으로 분화하는 동안 mRNA수준은 감소하였으며, Oct 3/4나 RexT, UTF-1 등 세포의 미분화 표지 인자 17)를 확인할 수 있었다는 결과와 일치하였다. 형태학적으로는 LIF를 처리하여 미분화를 유지하는 세포와 DBcAMP 및 RA를 처리하여 분화된 배아체의 형태를 관찰하여 세포가 정상적으로 분화되고 있는 것을 확인 할 수 있었다.
- 형태학적으로는 LIF를 처리하여 미분화를 유지하는 세포와 DBcAMP 및 RA를 처리하여 분화된 배아체의 형태를 관찰하여 세포가 정상적으로 분화되고 있는 것을 확인 할 수 있었다. 이 결과는 면역 형광 항체염색에서도 동일하게 관찰되었으며, LIF를 처리한 대조군에서는 SMaA는 거의 발현되지 않았다. 그러나 DBcAMP 및 RA를 처리하여 분화를 유도한 실험군에서는 배아체의 형태가 관찰되었으며, 분화된 세포에서는 SMaA 발현양상이 뚜렷하게 나타났다.
- 형태학적으로는 LIF를 처리하여 미분화를 유지하는 세포와 DBcAMP 및 RA를 처리하여 분화된 배아체의 형태를 관찰하여 세포가 정상적으로 분화되고 있는 것을 확인 할 수 있었다. 이 결과는 면역 형광 항체염색에서도 동일하게 관찰되었으며, LIF를 처리한 대조군에서는 SMaA는 거의 발현되지 않았다.
후속연구
- 그리고 desmin이 존재하지 않으면 평활근의 형성이 차단되었다는 선행 보고들과도 일치하였다29). 그러나 본 실험에서는 농도 의존적인 발현양상은 측정하지 못했기 때문에, 배아 줄기세포의 평활근세포 분화 정도가 농도 의존적으로 차이가 있는지에 대해서는 향후 좀 더 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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