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문제 정의
- 본 연구는 미니어쳐 돼지의 생산을 위해 2007년 강원대학교 목장에서 사육되고 있는 2 두의 미니어쳐 돼지와 강원도 지역 5곳의 종돈장에서 사육하고 있는 종돈에서 채취한 정액 내에 오염된 세균의 분포를 조사하였고 항생제처리와 percoll을 이용한 density gradient 방법에 의해 오염된 세균이 제거되는 정도를 관찰하였다. 채취한 정액은 혈액배지와 MacConkey agar에서 접종한 후 7.
- Per colle 배양액을 첨가하여도 삼투압의 변화가 없으며, 높은 밀도구배 배양액을 만들 수 있으며, 용액이라기보다는 colloid로 낮은 점성을 가지기 때문에 원심 분리시 정 자가 percoll 층을 통과하는데 방해가 되지 않는 등의 몇 가지 장점들을 가지고 있다. 본 연구에서는 정자 분리 방법의 하나인 percoll 법을 이용시 세균의 오염 정도를 알아보는 데 목적을 두고 수행되었다. Percoll처리 후 cfu를 측정한 실험에서는 검사에 이용한 배지의 종류 (blood agar, Mac- Conkey agar)에 따라 수치에는 차이가 있었으나, percoll의 농도가 높아질수록 측정되는 cfu의 값이 감소되는 양상은 동일했으며, 특히 30%에서까지 다소 많은 수치로 측정되던 cfu값이 65% 농도에서는 0의 값을 나타내는 것으로 보아 30%~65% 농도사이에서 세균이 이동하지 못하는 적정농도가 있을 것으로 판단된다.
- 정자 분리법에는 washing 방법, sperm migration 방법, density gradient 방법, adherence 방법 등이 보고되었다(2) 본 연구에서는 미니어쳐 돼지를 생산하기 위한 인공수정용 정자를 사용하기 위해 강원대학교 농장에서 육성하고 있는 미니 돼지 2두와 일반 종돈장 5곳에서 수집한 정액 내에 오염되어 있는 세균총을 분석하고 항생제처리 및 percoll을 사용한 density gradient 방법을 이용하여 정액 내에 오염된 세균이 얼마나 제거되는지를 알아보고자 수행하였다.
제안 방법
- 항생제는 정액내 세균을 정균 또는 살균시키기 위한 항생제로 흔히 사용하는 genta- micin 을 사용하였다. Gentamicin sulphate ①uchefa, Netherlands)를 멸균된 증류수로 4 ㎎/㎖로 용해시킨 후 정액 1 ㎖당 2mg의 genta- micin이 되도록 처리한 후 혈액배지와 MacConkey agar에 접종하였다.
- 서로 다른 모양의 집락을 모두 선택하여 새로운 혈액 배지에 접종한 뒤 세균 동정을 실시하였다. Gram 염색법, oxidase test, catalase test를 이용하여 동정할 균의 범위를 스크리닝한 후, API kit (bioMerieux, France) 와 Vitek system (bioM&ieux)을 이용하여 최종 균을 동정하였다.
- Percoll (Sigma-Aldrich, Germany)과 10X 인산완충용액 (PBS)을 9:1로 희석하여 (삼투압 300 Osm) 100% Percoll로 간주하고 PBS 로 Percoll을 30, 50, 65, 80, 95%로 희석하였다. Percoll 단일층 (single step)의 경우 원심 관에 각각 30, 65, 80%의 Percoll 희석액을 분주한 후 채취한 정액을 첨가하였으며, 3 step 의 경우 Percoll 희 석 액을 원심관에 30:65: 90%의 농도구배로 분주한 후 정 액을 첨가하였고, 5 step의 경우 Percoll 희석용액을 30 : 50 : 65 : 80 : 90%로 농도구배로 분주한 후 정액을 첨가하였다.
- 가장 균이 많이 검출된 미니어쳐 돼지에서 채취한 원정액(M7)을 percoll 30%, 65%, 80% 의 single step으로 추출한 정액, 그리고 3 step (30 : 65 : 90), 5 step (30 : 50 : 65 : 80 : 90) 의 percoll의 처리를 한 후 검출되는 세균의 cfu 값을 비교해 보았다 (Table 3). 본 시험 결과의 재현성을 보고자 총 5회 반복 실시하였다.
- 결과이다. 두 마리의 미니어쳐 돼지에서 채취한 정액을 가지고 항생제 처리 전후의 균총의 변화를 관찰하였다. M7정액과 M1120정액내 세균의 종류는 각각 8종과 7종으로 나타났다.
- 이는 추후 농도간격을 더욱 작게 설정하여 실험을 할 필요성이 있다고 보여진다. 미니어쳐 돼지에 있어서 항생제를 첨가한 정액(M 7D, M1120D)과 첨가하지 않은 원정액 (M7, M1120)을 비교하였다 (Table 2). M7D와 M7 정액에서 증식된 세균의 종류를 비교하였을 때, 검출되는 균의 종류는 동일하였으나, 공통적으로 검줄되는 균은 Acineobacter baumanni, Shewanella putrefaciens group의 2종뿐이었다.
- 5% CO2배양기에서 24-48 시간 배양하였다. 배양 후 총 세균수를 colony forming unit (cfu/ml)로 즉정 하였으며, 증식된 균을 전술한 방법에 의해 균 동정을 실시하였다.
- 5% CO2, 37℃에서 48 시간 배양하였다. 배양한 집락은 Gram 염색, oxidase 및 catalase 검사를 거쳐 최종적으로 API kit와 Vitek system을 이용하여 동정하였다. 다양한 종류의 균이 관찰되었으며 그 중 Leclecia adecarboxylata, Acineobacter ban- manni, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus cohni spp urealyticus, Proteus mirabilis가 다소 높은 빈도로 관찰되었다.
- 값을 비교해 보았다 (Table 3). 본 시험 결과의 재현성을 보고자 총 5회 반복 실시하였다. Swarming되는 세균을 억제시키기 위해 Blood agar외에 MacConkey agar에 접종한 후 cfu를 비교하였을 때 MacConkey agar에서는 일반적으로 100개 정도 낮은 cfu가 관찰되었다.
- 5% CO 배양기에서 28~48 시간 동안 배양하였다. 서로 다른 모양의 집락을 모두 선택하여 새로운 혈액 배지에 접종한 뒤 세균 동정을 실시하였다. Gram 염색법, oxidase test, catalase test를 이용하여 동정할 균의 범위를 스크리닝한 후, API kit (bioMerieux, France) 와 Vitek system (bioM&ieux)을 이용하여 최종 균을 동정하였다.
- 수집한 정액은 5% 양혈액이 첨가된 혈액 배지(코메드, 한국)와 MacConkey agar (Difco, USA)에 각각 도말하였고 37℃, 7.5% CO 배양기에서 28~48 시간 동안 배양하였다. 서로 다른 모양의 집락을 모두 선택하여 새로운 혈액 배지에 접종한 뒤 세균 동정을 실시하였다.
- 원정액과 percoll 처리한 30%, 60%, 85% single step 처리정액과 5 step에서의 추출한 정액에서 증식한 균동정 결과를 비 교하였다. Percoll처리 전의 세균의 종류가 8종에 비해 처리 후 동정 된 세균의 종류가 감소한 것으로 나타났고 5 step의 경우 6종인데 비해 30, 65, 80% single step의 경우 균종은 각각 4, 2, 2종으로 감소되는 것으로 나타났다.
- 정액에 첨가한 항생제는 kanamycin으로 검출되는 세균 종과 숫자에 있어서 영향을 끼쳤으리라 여겨졌다. 이어서 항생제를 처리한 M7정액에 있어서 percoll 농도와 단계층이 존재하는 3 step, 5 step에 따라 균종에 어떠한 차이가 있는지 비 교해 보았다. Percoll을 넣지 않은 원정액 인 M7과 비교하였을 때, percoll 처리농도가 높아짐에 따라 동정되는 세균의 종수가 감소함을 볼 수 있었다.
- 채취하였다. 채취한 정액을 이등분으로 나눈 뒤, 항생제 처리전과 항생제 처리후로 구분하여 실험하였다. 항생제 처리전의 정액은 바로 혈액배지와 MacConkey agar에 직접 도말하였다.
대상 데이터
- 2007년도 강원대학교 목장에서 육성하고 있는 미니어쳐 돼지 2마리의 정액은 gloved- hand method를 통해 37℃ 로 예열된 보온병에 수집하였다8). 또한 강원도 지역에 위치한 5곳의 AI센타에서 수집한 정액을 본 연구의실험재료로 사용하였다.
- 수집하였다8). 또한 강원도 지역에 위치한 5곳의 AI센타에서 수집한 정액을 본 연구의실험재료로 사용하였다. 수집한 정액은 냉장 상태로 실험실로 옮긴 후 당일 세균 배양을 실시하였다.
- 항생제 처리 전후 정액내의 세균총의 변화를 관찰하기 위해 두 마리의 미니어쳐 돼지의 정액을 채취하였다. 채취한 정액을 이등분으로 나눈 뒤, 항생제 처리전과 항생제 처리후로 구분하여 실험하였다.
- 항생제 처리전의 정액은 바로 혈액배지와 MacConkey agar에 직접 도말하였다. 항생제는 정액내 세균을 정균 또는 살균시키기 위한 항생제로 흔히 사용하는 genta- micin 을 사용하였다. Gentamicin sulphate ①uchefa, Netherlands)를 멸균된 증류수로 4 ㎎/㎖로 용해시킨 후 정액 1 ㎖당 2mg의 genta- micin이 되도록 처리한 후 혈액배지와 MacConkey agar에 접종하였다.
성능/효과
- M7D와 M7 정액에서 증식된 세균의 종류를 비교하였을 때, 검출되는 균의 종류는 동일하였으나, 공통적으로 검줄되는 균은 Acineobacter baumanni, Shewanella putrefaciens group의 2종뿐이었다. M1120D와 M1120 정액에서 검출된 세균의 비교에서는 검출되는 세균의 종류는 각각 6종 및 2종으로 뚜렷한 차이가 있었다.
- 미니어쳐 돼지에 있어서 항생제를 첨가한 정액(M 7D, M1120D)과 첨가하지 않은 원정액 (M7, M1120)을 비교하였다 (Table 2). M7D와 M7 정액에서 증식된 세균의 종류를 비교하였을 때, 검출되는 균의 종류는 동일하였으나, 공통적으로 검줄되는 균은 Acineobacter baumanni, Shewanella putrefaciens group의 2종뿐이었다. M1120D와 M1120 정액에서 검출된 세균의 비교에서는 검출되는 세균의 종류는 각각 6종 및 2종으로 뚜렷한 차이가 있었다.
- 두 마리의 미니어쳐 돼지에서 채취한 정액을 가지고 항생제 처리 전후의 균총의 변화를 관찰하였다. M7정액과 M1120정액내 세균의 종류는 각각 8종과 7종으로 나타났다. 그리고 두 원정액에서 공통적으로 관찰되는 세균은 Acinetobacter를 포함해서 모두 4종류의 세균이 관찰되었다.
- 이어서 항생제를 처리한 M7정액에 있어서 percoll 농도와 단계층이 존재하는 3 step, 5 step에 따라 균종에 어떠한 차이가 있는지 비 교해 보았다. Percoll을 넣지 않은 원정액 인 M7과 비교하였을 때, percoll 처리농도가 높아짐에 따라 동정되는 세균의 종수가 감소함을 볼 수 있었다. 검출되는 균종은 M7에서 검출되었던 균종과 거의 일치하는 경향을 보였으며, percoll의 농도가 균이 정액을 통과하는 데에 장애를 줄 수 있음을 추론할 수 있었다.
- 원정액과 percoll 처리한 30%, 60%, 85% single step 처리정액과 5 step에서의 추출한 정액에서 증식한 균동정 결과를 비 교하였다. Percoll처리 전의 세균의 종류가 8종에 비해 처리 후 동정 된 세균의 종류가 감소한 것으로 나타났고 5 step의 경우 6종인데 비해 30, 65, 80% single step의 경우 균종은 각각 4, 2, 2종으로 감소되는 것으로 나타났다.
- 본 연구에서는 정자 분리 방법의 하나인 percoll 법을 이용시 세균의 오염 정도를 알아보는 데 목적을 두고 수행되었다. Percoll처리 후 cfu를 측정한 실험에서는 검사에 이용한 배지의 종류 (blood agar, Mac- Conkey agar)에 따라 수치에는 차이가 있었으나, percoll의 농도가 높아질수록 측정되는 cfu의 값이 감소되는 양상은 동일했으며, 특히 30%에서까지 다소 많은 수치로 측정되던 cfu값이 65% 농도에서는 0의 값을 나타내는 것으로 보아 30%~65% 농도사이에서 세균이 이동하지 못하는 적정농도가 있을 것으로 판단된다. 이는 추후 농도간격을 더욱 작게 설정하여 실험을 할 필요성이 있다고 보여진다.
- 검사한 원정액에서 발견되는 균종에 있어서는 뚜렷한 공통점은 발견하지 못하였고, 다양한 균종이 각각 관찰되었으나 Staphylococcus spp와 Proteus spp 순으로 빈번하게 검출 되었다. 종돈장의 정액들의 세균종은 개체에 따라 차이를 보이긴 했으나, 미니어쳐 돼지의 정액에 비하여 비교적 적은 종의 세균이 동정 되 었으며, 빈도를 보았을 때, Leclecia ade~ carboxylata, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus cohni spp urealyticus 균이 2 번 이상 공통적으로 동정되었다.
- Percoll을 넣지 않은 원정액 인 M7과 비교하였을 때, percoll 처리농도가 높아짐에 따라 동정되는 세균의 종수가 감소함을 볼 수 있었다. 검출되는 균종은 M7에서 검출되었던 균종과 거의 일치하는 경향을 보였으며, percoll의 농도가 균이 정액을 통과하는 데에 장애를 줄 수 있음을 추론할 수 있었다. 돼지정액의 분리과정에 있어서는 본 연구에서도 그렇듯이 정액자체의 세균이 동정 된다기보다는 조작과정상의 오염, 환경에 상재하는 세균, 조작자로부터 기인되는 세균등 오염경로가 다양한 세균들이 동정이 되었다.
- 5x106 cfu/ml로 원정액의 세균수에 비해 별로 감소되지 않은 것으로 나타났다. 그러나 65% percoll을 처리한 경우 5회중 1회가 40 cfu로 검출 되었고 80% percoll 처리시 5회중 1회에 한해 10 cfu의 균이 검출되었고 5 step 처리 시 에 는 5회 중 2회 에 한해 10 cfu 의 균이 검출되었다. 3 step의 경우에는 5회 모두 균이 검출되지 않았다.
- M7정액과 M1120정액내 세균의 종류는 각각 8종과 7종으로 나타났다. 그리고 두 원정액에서 공통적으로 관찰되는 세균은 Acinetobacter를 포함해서 모두 4종류의 세균이 관찰되었다.
- 배양한 집락은 Gram 염색, oxidase 및 catalase 검사를 거쳐 최종적으로 API kit와 Vitek system을 이용하여 동정하였다. 다양한 종류의 균이 관찰되었으며 그 중 Leclecia adecarboxylata, Acineobacter ban- manni, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus cohni spp urealyticus, Proteus mirabilis가 다소 높은 빈도로 관찰되었다. 또한 돼지에서 유래한 균보다는 환경에서 유래한 균이 더 많이 관찰되었다.
- 다양한 종류의 균이 관찰되었으며 그 중 Leclecia adecarboxylata, Acineobacter ban- manni, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus cohni spp urealyticus, Proteus mirabilis가 다소 높은 빈도로 관찰되었다. 또한 돼지에서 유래한 균보다는 환경에서 유래한 균이 더 많이 관찰되었다. 오염된 균을 제거하기 위해가장 흔하게 사용하는 gentamicin을 처리하였으나 오염균을 완전히 제거하지 못하였다.
- Althouse 등8,9)에 의하면 분변, 피 부, 피 모, 호흡기 분비물, 조작자의 피부, 호흡기등 인체로부터 기인된다고 여겨지는 다양한 경로를 서술하고 있다. 또한 정자분리에 이용하는 항생제의 종류를 비롯, 환경온도, 배양배지의 pH 등 여러 요인이 세균의 배양, 동정에 영향을 미친다는 사실도 확인할 수 있다. 그래서 조작 시 여러 겹의 글로브를 착용하거나, 환경 내의 소독을 정기적으로 시행하는 등 연구 과정 중의 오염을 최소화할 수 있는 실험 방법이 권장되고 있다.
- 이끌었다. 인공수정의 장점은 우선 유전적으로 우수한 종모돈을 이용함으로써 종돈 장 내외, 혹은 돈군의 대소에 관계없이 활용케함으로써 종축개량 향상에 도움을 주었으며, 번식피크기에 종모돈의 종부빈도를 감축시킬 수 있어 종모돈 필요 두수도 감축할 수 있게 되어 경제적 이익을 증대시켰다. 또한 폐쇄 돈 군으로 육성시킬 수 있어 병원체의 유입을 방지하며, 대형돈과 소형돈 간의 교배가 가능하고, 발정동기화를 시킨다면 번식을 위한 능력을 경감할 수 있는 이점을 가지고 있어 양돈사업의 발전에 기여하였다.
- M7 미니어쳐 돼지 정액의 경우 8종류가, M1120 미니어쳐 정액의 경우 6종류가 검출되었다. 종돈 장의 경우, Duroc 종돈 D51과 D75의 경우 각각 1종류의 균이 검출되었고, Landrace 종돈 L14와 L118은 3종류의 세균이 분리되는 반면에 L111은 한 종류의 세균만 관찰되었다. Yorkshire 종돈인 Y30과 Y93의 경우 모두 3 종류의 세균이, 그리고 Y2종돈의 경우 한 종류의 세균이 검출되었다.
- 종돈장의 정액들의 세균종은 개체에 따라 차이를 보이긴 했으나, 미니어쳐 돼지의 정액에 비하여 비교적 적은 종의 세균이 동정 되 었으며, 빈도를 보았을 때, Leclecia ade~ carboxylata, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus cohni spp urealyticus 균이 2 번 이상 공통적으로 동정되었다.
- 항생제 처리 후 M7정액 (M7D)에서는 2종의 세균이 관찰되었고 항생제처리후 M1120 정액(M1120D)에서는 항생제처리시 5종이 감소된 2종류의 세균이 검출되었다. 따라서 항생제를 처리해도 정액내 오염된 세균을 모두 제거하지 못함을 알 수 있었다.
후속연구
- 그러나 percoll을 이용한 density gradient방법 중 3 step 방법에서는 정액내의 오염균을 완전히 제거되는 것으로 나타났다. 추후 원정액과 percoll 처리한 정액에 있어 정자의 수정능과 관련한 연구가 이루어진다면, 정자분리과정에 percoll을 적용하는 방법의 효용성 판단에 많은 도움을 주리라 판단된다.
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