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문제 정의
- 모든 스트레스 부하는 흰쥐의 활동이 활발한 밤주기(어두운 상태)에 실시하여 부동화시키므로써 스트레스를 배가하고자 하였다.
- 본 연구에서는 일정기간 스트레스를 받을 때 vitamin E 투여가 스트레스를 얼마나 장·단기적으로 방어할 수 있는지 알아보았다.
가설 설정
- 따라서 본 연구에서는 ICR 마우스를 사람의 나이 20대에 해당되는 5개월까지 사육하여, 8주간의 스트레스를 가한 후 사람의 나이 노년기에 해당되는 18개월 될 때까지 사육하여9) 스트레스로 인한 생체내의 산화적 손상지표 변화를 보아 사람의 나이 20대에 받은 스트레스가 노년기인 60대 이상에 접어들었을 때에 혈청과 간의 대사산물 변화에 있어 vitamin E의 보호 효과를 살펴보고자 하였고, 이를 위하여 마우스의 수명은 20개월로,9) 사람의 수명은 80세로 가정하였다.
제안 방법
- 일반 고형사료로 1주일간 적응시킨 후 난괴법에 의해 5개월간 사육하여 8주간 스트레스를 가할 마우스의 경우 15마리씩 4개의 군으로 분류하였으며, 5개월까지 사육하여 8주간 스트레스를 가한 후 총 18개월간 사육할 마우스의 경우 20마리씩 4개의 군으로 나누었다.
- 스트레스 부하군의 피험동물은 스트레스 case (10 cm×25 cm)에 넣고 거꾸로 세운 상태로 40분간 유지시켰다.10 대조군과 스트레스 부하군은 희생 후 혈액 및 장기를 채취하여 스트레스 효과를 확인하였다.
- 29) 앞의 TAS, SOD 함량 분석에 사용된 간으로 MDA 함량을 측정하였다. 결과는 Table 6과 같다.
- 5개월 된 마우스에 8주간 스트레스를 가한 후 바로, 혹은 총 18개월 사육 후 혈청 중 TG의 함량을 측정하였다.
- 본 연구에서는 일정기간 스트레스를 받을 때 vitamin E 투여가 스트레스를 얼마나 장·단기적으로 방어할 수 있는지 알아보았다. ICR 마우스를 사람의 나이 20대에 해당되는 5개월까지 사육한 후, 8주간의 스트레스를 가하고 사람의 나이 노년기에 해당되는 18개월 될 때까지 사육하여 스트레스로 인한 생체 내의 산화적 손상지표로 혈청과 간의 대사산물의 변화를 조사하였다. 그 결과, 스트레스는 장 · 단기적으로 모두 혈청의 TG, AST 함량을 증가시키고, HDL-cholesterol 함량을 저하시키는 것에 반해, 여기에 vitamin E의 투여는 스트레스를 받은 쥐에서 혈청 TG와 AST의 함량을 감소시키고, HDL-cholesterol의 함량을 증가시키는 효과를 보여주었다.
- Malondialdehyde(MDA) 측정은 BIOXTECH LPO-586 assay kit를 사용하여 측정하였다.
- SOD측정은 SOD kit(Cayman, USA)를 이용하여 ElA reader(Molecular device, USA)로 분석하였다.
- TG 함량과 HDL-cholesterol의 함량분석에 사용된 혈청으로부터 간조직의 손상지표로 사용되는 AST17)의 함량을 측정하였다.
- 간조직 내 total antioxidant status(TAS)는 TAS kit(RANDOX Laboratories Ltd, Ardmore, UK)를 이용하여 Hitachi 7150(Hitachi, Japan)으로 분석하였다.
- 로부터 분양받아 실험실 환경(온도는 22±2℃, 습도 45%)에서 자유식이로 사육하였다.
- 스트레스 없이 7개월간 사육한 대조군(C-7)과 5개월간 사육하여 8주 동안 스트레스를 가한 스트레스 실험군(S-7), 스트레스 없이 vitamin E를 식이한 대조군(E-7)과 8주 동안 스트레스를 가하며 vitamin E를 식이한 스트레스 실험군(S+E-7), 18개월 동안 스트레스 없이 사육한 대조군(C-18), 5개월간 사육하여 8주간의 스트레스 후 총 18개월 동안 스트레스 없이 사육한 실험군(S-18), 18개월 동안 스트레스 없이 vitamin E를 식이한 대조군(E-18), 5개월간 사육하여 8주간의 스트레스 후 총 18개월 동안 스트레스 없이 vitamin E를 식이한 실험군(S+E-18)으로 분류하였다.
- 식이 섭취를 위한 vitamin E로서 α-tocopherol acetate를 Sigma사(St. Louis, Missouri, USA)로부터 공급받았으며, 식이 섭취량은 실험군 사료에 α-tocopherol acetate를 5 g/50 g의 비율로 섞어 하루 0.4±0.6 g씩 섭취할 수 있도록 하였다.
- 앞에서 5개월 된 마우스에게 8주간 스트레스를 가한 후 바로, 혹은 총 18개월 사육 후 혈청 중 TG, HDL-cholesterol 그리고 AST의 함량을 보았다.
- 앞의 TG 함량 분석에서 사용된 혈청으로 HDL-cholesterol의 함량을 측정하였다.
- 혈청 중 triacylglycerol, HDL-cholesterol, aspartate aminotransferase(AST) 농도는 측정용 kit(Bayer, NY, USA)를 이용하여 자동분석기 ADVIA 1650(Bayer, USA)을 이용하여 분석하였다.
대상 데이터
- 실험동물은 생후 4주령의 ICR 계열의 숫컷 마우스로 Japan SLC, Inc.로부터 분양받아 실험실 환경(온도는 22±2℃, 습도 45%)에서 자유식이로 사육하였다.
데이터처리
- 1)Mean with different superscripts in the same column are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple range test.
- 실험한 결과의 통계처리는 SPSS program를 이용하여 각 실험군의 평균과 표준 편차로 나타냈으며, 7개월과 18개월의 변화는 t 검증(paired t-test)을 실시하였고, 각 군의 비교는 유의수준은 p<0.05에서 One-way ANOVA test로 나타내었으며, 유의성 검증은 Duncan's multiple range test를 이용하였다.
이론/모형
- 실험동물의 스트레스 모델로는 immobilization stress(부동화 스트레스)를 실시하였다.
성능/효과
- 7개월 스트레스군인 S-7군이 8.98 nmol/l로 대조군인 C-7군보다 84% 증가하였고, 스트레스를 가하면서 vitamin E를 투여한 S+E-7군이 7.98 nmol/l로 스트레스군보다 11% 감소하는 효과를 볼 수 있었다.
- 따라서 젊었을 때 한때 받은 스트레스는 노년기의 TG, HDL-cholesterol, AST, TAS, SOD 그리고 MDA의 수치 모두에 있어서 부정적인 영향을 미치는 것으로 나타났다.
- 1,2) Catecholamines이 과부하 상태에 이르게 되면 superoxide radical(O2-), hydrogen peroxide(H2O2)와 hydroxyl radical(OH·) 등의 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)이 전자전달계의 부산물로 생성된다.
- 28) 7개월과 18개월 그룹의 스트레스군인 S-7군과 S-18군의 유의적 차이를 통해 20대에 받은 스트레스가 TG, TAS, HDL-cholesterol과 같이 노년기의 SOD 감소에도 부정적 영향을 미치는 것으로 나타났다.
- 3) 그러나 다행스럽게도 인체는 ROS에 대한 효과적인 항산화 효소로 superoxide dismutase(SOD), catalase(CAT), gultathione peroxidase(GSH-Px) 등을 가지고 있다.
- 7) 특히 vitamin E는 여러 요인으로 발생되는 산화적 스트레스를 유의적으로 감소시키는 중요한 기능을 가지고 있을 뿐 아니라 vitamin E radical은 vitamin C 및 glutathione과 상호작용하여 vitamin E로 전환될 수 있다.
- 결과는 Table 2와 같다. 7개월 그룹의 스트레스군인 S-7군은 43.26 mg/dl로 대조군보다 17% 유의적으로 감소하였으며, 스트레스를 가하면서 vitamin E를 투여한 S+E-7군은 70.11 mg/dl로 스트레스군보다 62% 유의적으로 증가하였다. 7개월과 18개월 그룹의 스트레스군인 S-7군은 43.
- 7개월 그룹의 스트레스군인 S-7군이 49.67 µ/l로 대조군인 C-7군에 비해 70% 유의적으로 증가하였으며, 스트레스를 가하면서 vitamin E를 투여한 S+E-7군은 43.77 µ/l로 스트레스군인 S-7군에 비해 11% 유의적으로 감소하였다.
- 결과는 Table 1과 같다. 7개월 사육된 스트레스군인 S-7군이 474.92 mg/dl로, 대조군인 C-7군에 비해 127% 유의적으로 증가하였으며, 스트레스를 가할 때 vitamin E를 투여한 S+E-7군은 381 mg/dl로 스트레스군에 비해 19% 유의적으로 감소하였다. 또한 7개월과 18개월 그룹의 스트레스군인 S-7군이 474.
- 7개월 스트레스군인 S-7군이 62.35 µ/ml로 대조군인 C-7군에 비해 35% 유의적으로 감소하였고, 스트레스를 가하면서 vitamin E를 투여한 S+E-7군은 80.12 µ/ml로 스트레스군인 S-7군에 비해 28% 유의적으로 증가하였다.
- 7개월 스트레스군인 S-7군이 9.32 mmol/l로 대조군인 15.63 mmol/l에 비해 67% 유의적으로 감소하였으며, 스트레스를 가하면서 vitamin E를 투여한 S+E-7군이 14.81 mmol/l로 스트레스군에 비해 58% 유의적으로 증가하였다.
- 7개월과 18개월 그룹의 vitamin E 투여군이 스트레스군보다 유의적으로 낮은 값을 보여, vitamin E가 AST 함량 증가에 대한 억제효과를 보이는 것으로 나타났으며, 이는 vitamin E가 스트레스로 인한 심근경색이나 용혈성 질환을 어느 정도 보호21,22)할 수 있을 것으로 사료되었다.
- 7개월과 18개월 그룹의 스트레스군인 S-7군은 62.35 µ/ml, S-18군은 41.20 µ/ml (t=4.016)로 유의적 차이를 보였으며, S-18군은 대조군인 C-18군의 SOD 값이 감소되는 것에 비해 54% 더 감소되었다.
- 7개월과 18개월 그룹의 스트레스군인 S-7군은 43.26 mg/dl, S-18군은 39.84 mg/dl(t=15.846)로 S-18군이 7.9% 감소하여 유의적 차이를 보였고, 대조군인 C-7군, C-18군에서는 거의 차이가 없었으며, S+E-7군과 S+E-18군 사이에서도 유의적 차이가 없었다.
- TAS의 경우 7개월 그룹과 18개월 그룹의 스트레스군에서 TAS의 함량이 유의적으로 낮게 나타났다.
- Vitamin E만을 투여한 E-18군이 대조군인 C-18군보다 HDL-cholesterol 농도가 16% 높은 것으로 나타나 스트레스가 없을 때도 vitamin E는 섭취한 만큼 그 후에도 HDL-cholesterol에 좋은 영향을 미치는 것으로 나타났다.
- 그 결과, 스트레스는 장 · 단기적으로 모두 혈청의 TG, AST 함량을 증가시키고, HDL-cholesterol 함량을 저하시키는 것에 반해, 여기에 vitamin E의 투여는 스트레스를 받은 쥐에서 혈청 TG와 AST의 함량을 감소시키고, HDL-cholesterol의 함량을 증가시키는 효과를 보여주었다.
- 또한 18개월 사육하며 스트레스를 가할 때 vitamin E를 투여한 S+E-18군이 스트레스군인 S-18군에 비해 HDL-cholesterol농도가 73% 유의적으로 증가한 것을 통해, vitamin E가 HDL-cholesterol 증가에 긍정적인 효과를 가지는 것으로 보인다.
- 또한 Table로 만들지는 않았으나 7개월과 18개월 그룹에서 LDL-cholesterol의 혈중 농도를 측정한 결과 C-7군은 25.14 mg/dl, E-7군은 23.25 mg/dl, S+E-7군은 40.12 mg/dl, S-7군은 43.18 mg/dl, 로 E-7군이 스트레스군인 S-7군보다 46% 감소하였으며, 18개월 그룹에서도 vitamin E 투여군들이 상대적으로 감소하는 동일한 결과를 보였다.
- 또한 vitamin E를 투여한 E-7군과 E-18군 모두 대조군인 C-7군보다 유의적으로 높은 값을 보였다.
- 또한 사람 나이 20대에 해당하는 7개월 그룹의 스트레스군인 S-7군과 스트레스를 가할 때 vitamin E를 투여한 S+E-7군보다 사람 나이 60대 이상인 노년기에 해당하는 18개월 그룹의 스트레스군인 S-18군과 스트레스를 가할 때 vitamin E를 투여한 S+E-18군보다 TG의 함량이 유의적으로 높은 것으로 보아 젊었을 때 받은 스트레스가 노년기에도 TG 농도를 높이는데 영향을 준 것으로 사료되었다. 이를 통해 스트레스는 TG의 함량을 증가시키고, vitamin E는 높아지는 TG를 회복하는데 도움을 주는 것을 알 수 있었다.
- 또한 스트레스에 의한 DNA 변이를 vitamin E가 어느 정도 방어하여35)MDA 생성을 억제하는 효소들의 생산이 스트레스군보다 높아 MDA 생성이 감소하는 영향도 받았을 것으로 보이며, 스트레스에 의한 세포들의 DNA 변이와 간조직의 섬유화는 측정한 TG, HDL-cholesterol, AST, TAS, SOD 값에도 장·단기적으로 부정적 영향을 미쳤을 것으로 판단되었다.
- 또한 vitamin E 투여군인 E-7군과 E-18군 모두 대조군인 C-7군과 C-18군보다 유의적으로 높은 값을 보였다.
- 반면 18개월 그룹의 스트레스 군에서도 MDA 수치가 C-18군, E-18군, S+E-18군보다 높게 나타나, 젊었을 때 받은 스트레스가 노년기의 MDA 함량 증가에 영향을 준다는 것을 알 수 있었다.
- 스트레스군에서 사람의 나이 노년기에 해당하는 18개월 마우스가 사람 나이 20대에 해당하는 스트레스 마우스보다 HDL-cholesterol 농도가 유의적으로 감소한 것을 통해, 젊었을 때의 스트레스가 TG 함량을 높였던 것과 같이 노년기 HDL-cholesterol 농도 감소에도 영향을 미친 것으로 보인다.
- 스트레스는 간조직의 TAS, SOD 함량 감소와 MDA 함량 증가를 야기시켰으며, 스트레스 받은 쥐에 vitamin E의 투여는 TAS, SOD의 함량을 증진시키고, MDA의 함량을 저하시키는데 긍정적 영향을 주었다.
- 스트레스를 전혀 가하지 않고 vitamin E 만을 투여한 E-8군은 5.86 nmol/l로 대조군에 비해 유의적으로 높게 나타났고, 이러한 현상은 vitamin E의 투여가 간독성을 유발시켜 나타난 결과로 판단된다.
- 이를 통해 스트레스는 TG의 함량을 증가시키고, vitamin E는 높아지는 TG를 회복하는데 도움을 주는 것을 알 수 있었다.
- 이와 같이 5개월령 마우스를 8주간 하루 40분씩 스트레스를 가한 경우 혈청 TG, HDL, AST와 간의 TAS, SOD, MDA의 측정한 모든 값에 나쁜 영향을 미치며, 이들 마우스를 총 18개월 될 때까지 사육 후 혈청과 간을 분석한 결과 거의 개선되지 않고 그대로 혹은 대조군에 비해 HDL-cholesterol 농도가 7%, SOD 농도가 33% 더 악화되는 것으로 나타났고 MDA에서만 대조군에 비해 1.3% 덜 떨어지는 것으로 보였다.
- 즉 vitamin E가 스트레스보다는 적은 정도로 간에 영행을 미쳐, S+E-7군이 스트레스군인 S-7군에 비해 유의적으로 MDA값이 낮았으며 대조군 C-7에 비해서는 vitamin E의 간독성으로 MDA값이 유의적으로 올라간 것으로 추정된다.
후속연구
- 스트레스 없이 vitamin E 투여 후 장시간 뒤에도 vitamin E가 HDL-cholesterol에 좋은 영향을 미치는 것은 좀 더 연구 검토되어야 할 것이다.
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