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문제 정의
- 본 연구에서는 산수유 씨의 EtOAc 가용성 분획물로부터 4종의 phenolic 화합물, 2종의 lignan 화합물, 2종의 triterpene 화합물, 1종의 furan 화합물, 1종의 organic acid를 분리하여 화학적 구조를 동정하였고, 분리된 화합물의 최종당화산물 생성 저해효능을 검색하였기에 그 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- EtOAc 분획물 283 g중 277 g을 취하여 CHCl3/MeOH/water(4:1:0.1→5:4:1→0:1:0) 조건으로 극성을 높여가며 silica gel CC(11×50 cm)를 실시하여 10개의 분획물로 나누었다(F01-F10).
- 02% sodium azide를 넣어 배양 기간 동안 박테리아 생성을 예방하였다. Standard AGEs inhibitor로 알려진 aminoguanidine을 양성대조군으로 사용하여 효능 정도를 비교하였다. 배양 후에는 spectorfluorometric detector(Bio-TEK, Synergy HT, USA)를 이용하여 형광도를 측정하였다(Ex: 350, Em: 450 nm).
- In vitro 최종당화산물 생성저해 실험. Vinson과 Howard의 방법을 변형하여 실시하였다.25) 즉 50 mM phosphate buffer(pH 7.
- Standard AGEs inhibitor로 알려진 aminoguanidine을 양성대조군으로 사용하여 효능 정도를 비교하였다. 배양 후에는 spectorfluorometric detector(Bio-TEK, Synergy HT, USA)를 이용하여 형광도를 측정하였다(Ex: 350, Em: 450 nm).
- 분획물 F02(5.4 g)를 CHCl3/MeOH(2:3) 조건으로 Sephardex LH-20 CC(4.6×72 cm) 실시하여 3개의 소분획물로 나누었다(F02A-F02C).
- 화합물 3, 8-10은 본 식물에서 이미 분리 보고된 화합물이며 식물에서 흔히 알려진 성분들이다. 이들 성분의 구조는 1 HNMR, 13C-NMR 스펙트럼 자료를 문헌과 비교하여 화합물 3은 gallicin,11) 화합물 8은 ursolic acid,24) 화합물 9는 5-hydroxymethyl furfural,13) 화합물 10은 malic acid12)로 각각 동정하였다.
대상 데이터
- 7,8) 한약을 이용하여 보다 안전하고 효능이 우수한 당뇨합병증 예방 또는 치료제 개발을 위한 연구의 일환으로, 최종당화산물의 생성저해 효능 검색에서 우수한 활성을 나타낸 산수유 씨의 EtOAc-가용성 분획물 (IC50 값: 1.52µg/ml)을 심층 연구의 대상으로 선정하였다.
- TLC plate는 Kiesel gel 60 F254 pre-coated plate (Merck, 105715)와 RP-18 plate(Merck, 115389)를 사용하였으며 발색시약으로는 20% H2SO4를 사용하였다. NMR은 Bruker(Karlsruhe, Germany)의 DRX-300 또는 AVANCE 500 FT-NMR을 사용하여 측정하였다.
- CC용 충진제는 Kiesel gel(Merck, Darmstadt, Germany; 70~230 및 230~400 mesh), Sephadex LH-20(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), reversed-phase silica gel(YMC Co, Kyoto, Japan; ODS-A 12 nm S-150 µm)을 사용하였다. TLC plate는 Kiesel gel 60 F254 pre-coated plate (Merck, 105715)와 RP-18 plate(Merck, 115389)를 사용하였으며 발색시약으로는 20% H2SO4를 사용하였다. NMR은 Bruker(Karlsruhe, Germany)의 DRX-300 또는 AVANCE 500 FT-NMR을 사용하여 측정하였다.
- 본 실험재료는 2006년 11월 전남 구례군 상위마을에서 채집하였고, 대전대학교 생명과학부 김주환교수의 감정을 거친 후 실험재료로 사용하였으며 증거표본은(# KIOM-COOF1) 한국한의학연구원 한약제제연구부의 표본실에 보관 중이다.
성능/효과
- 본 연구에서 분리한 10종의 화합물에 대한 최종당화산물 생성저해 효능을 검색한 결과, (–)-balanophonin(IC 50 값 27.81 µM)과 gallicin(IC50 값 18.04 µM)이 비교양성대조군인 aminoguanidine (IC 50 값 974.59 µM) 보다 훨씬 우수한 활성을 보였다.
- 이상의 자료로부터 neolignan계열인 balanophonin으로 예상되고, 문헌치{# =–120(c=0.2, CHCl3)}27) 와 비교하였을 때 이 화합물은 (–)-balanophonin임을 확인 할 수 있었다.
- 4에서 3개의 signal들이 추가로 관찰되었는데, 이로부터 furfuran ring의 존재를 추정 할 수 있었다. 이상의 자료로부터 화합물 1은 3-methoxy-4-hydroxyphenyl group을 가진 대칭구조의 furfuran type lignan인 pinoresinol로 예상하였으며, 문헌치{# = +51.5(c=0.336, CHCl3)}26) 와 비교하였을 때 이 화합물은 (+)-pinoresinol임을 확인 할 수 있었다.
- 2에서 carboxyl기의 특징적인 signal들을 확인 할 수 있었다. 이상의 자료를 종합하여 문헌과 비교한 결과 betulinic acid임을 확인하였다.30)
- 화합물 4는 1H-NMR spectrum에서 δ 3.97에서 3개의 수소에 해당하는 methoxyl기의 단일 피크가 강하게 나타났으며, δ 9.83에서 aldehyde의 단일 피크를 확인하였으며, δ 7.05(d, J=8.7 Hz, H-5), 7.43(1H, d, J=1.8 Hz, H-2), 7.42(1H, dd, J=1.8, 8.4 Hz, H-6) 피크로부터 ABX system으로 3-치환된 벤젠고리의 존재를 알 수 있었다.
후속연구
- 그러나 이 두 가지 화합물이 산수유씨 EtOAc-가용성 분획물의 활성(IC50 =1.52 µg/ml)을 대표한다고 보기는 어렵기에 향후 활성성분에 대한 구체적인 연구가 요구된다.
- 52 µg/ml)을 대표한다고 보기는 어렵기에 향후 활성성분에 대한 구체적인 연구가 요구된다. 본 연구결과는 보다 안전하고 우수한 최종당화산물의 생성저해 효능을 가지는 새로운 선도 화합물의 발굴을 위한 기초자료로 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 산수유 씨의 식물화학 성분에 대한 기초자료로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
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