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문제 정의
- 약리작용으로는 이뇨, 혈압강하, 항암 및 항균작용 등이 알려져 있으며, 특히 지금까지 산수유 종자의 항당뇨 효과(7), 물 추출물의 항히스타민 효과(8), 항균효과(9) 및 항산화 효과(10) 등이 알려져 있으며 산수유의 주요 화학 성분에 대한 연구가 보고되어져 있다(11). 본 실험에서는 산수유 메탄올 추출물을 이용하여 비극성에서 극성의 용매로 분획물을 제조하여 각 분획물이 LPS로 염증이 유도된 mouse 대식세포 RAW 264.7 cell에서의 염증 매개 물질 생산 억제에 대한 효과를 검증함으로써 산수유를 이용한 항산화 및 항염증 효과를 지닌 기능성 식품으로써의 이용가치를 높이고자 한다.
가설 설정
- 1)Concentration of test sample required to produce 50% inhibition of the DPPH radical.
- 2)Concentration of test sample required to produce 50% inhibition of the ABTS radical.
제안 방법
- 7 mM ABTS와 2.4 mM의 potassium persulfate를 혼합하여 암소에서 12시간 반응 후, 자유 라디칼이 생성된 ABTS 용액을 99% ethanol로 희석하여 700 nm에서 흡광도가 0.70±0.02가 되도록 조정하였다.
- 형성된 formazan의 각 well에 DMSO를 첨가하여 녹이고, 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. Control의 흡광도 값을 기준으로 세포 생존율을 비교하였다.
- 얻어진 메탄올 추출물은 여과하여 농축 후, 동결 건조하였다. 동결된 산수유(Corni fructus) 80% 메탄올 추출물을 증류수로 완전히 용해한 후 계통 분획을 실시하였다. 분획 용매로는 ethyl acetate(EtOAc), butanol, water를 사용하였고, 극성이 낮은 용매에서 극성이 높은 용매로 순차적으로 계통 분획하여 산수유 EtOAc 분획물(CEF; 10.
- 산수유 각 분획물(1~1,000 μg/mL)의 항염증 실험을 위해 mouse macrophage RAW 264.7 cell을 사용하여 MTT assay를 통해 시료의 세포 독성을 확인하였다.
- 상층액을 취하여 ELISA kit(DB OptEIA TM , BD Biosciences, San Diego, CA, USA)를 이용하여 cyokine(IL-1β, IL-6, TNF-α) 및 PGE2의 생성량을 측정하였다.
- 02가 되도록 조정하였다. 소거능을 측정하기 위해 흡광도 값이 조정된 ABTS 자유 라디칼 용액과 시료를 동량으로 혼합하여 6분간 실온에서 반응하고 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 5 mL를 넣고 1분간 혼합하였다. 여기에 탄산나트륨 포화용액 1 mL을 넣은 후 혼합하여 실온에서 1시간 방치시키고 760 nm에서 UV/VIS spectrophotometer(Optizen, Daejeon, Korea)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 총 페놀 함량을 정량하기 위해 표준물질 tannic acid를 DMSO에 녹여 일정한 농도별로 조제하고 시료와 동일한 방법으로 실험하여 검량선을 작성하고 각 추출물의 총 페놀 함량을 측정하였다.
- 여기에 탄산나트륨 포화용액 1 mL을 넣은 후 혼합하여 실온에서 1시간 방치시키고 760 nm에서 UV/VIS spectrophotometer(Optizen, Daejeon, Korea)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 총 페놀 함량을 정량하기 위해 표준물질 tannic acid를 DMSO에 녹여 일정한 농도별로 조제하고 시료와 동일한 방법으로 실험하여 검량선을 작성하고 각 추출물의 총 페놀 함량을 측정하였다.
- 본 실험에 사용한 산수유는 대구 약령시에서 구입하여 사용하였다. 추출이 용이하도록 시료를 분쇄하여 산수유 무게 10배량의 80% 메탄올을 가하여 24시간 3회 반복하여 추출하였다. 얻어진 메탄올 추출물은 여과하여 농축 후, 동결 건조하였다.
대상 데이터
- 대식세포주(mouse macrophage RAW 264.7)는 DMEM에 10% fetal bovine serum(FBS), 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 것을 사용하였으며 배양기에서 37℃와 5% CO2를 유지하며 배양하였고, 20 passages를 넘기지 않은 세포만 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 산수유는 대구 약령시에서 구입하여 사용하였다. 추출이 용이하도록 시료를 분쇄하여 산수유 무게 10배량의 80% 메탄올을 가하여 24시간 3회 반복하여 추출하였다.
- 동결된 산수유(Corni fructus) 80% 메탄올 추출물을 증류수로 완전히 용해한 후 계통 분획을 실시하였다. 분획 용매로는 ethyl acetate(EtOAc), butanol, water를 사용하였고, 극성이 낮은 용매에서 극성이 높은 용매로 순차적으로 계통 분획하여 산수유 EtOAc 분획물(CEF; 10.2%), butanol 분획물(CBF; 15.8%), water 분획물(CWF; 40.5%)을 얻었다.
데이터처리
- 모든 데이터는 3회 반복 측정하였으며, 평균(mean)±표준편차(SD)로 표시하였다.
- 실험군 간의 통계학적 분석은 SPSS 18.0을 이용하여 one-way analysis of variance(ANOVA) 분석을 시행하였고 유의차가 있는 항목에 대해서는 Student’s t-test를 시행하여 통계학적 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- ABTS 자유 라디칼을 이용한 총 항산화력 측정은 Re 등(14)의 방법에 따라 2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid(ABTS)를 이용하여 측정하였다.
- 산수유 분획물의 세포독성 측정은 MTT assay를 사용하였다. 96-well plate에 1×104 cells/well로 동일하게 분주하고 24시간 동안 배양 후, 기존 배지를 교환 및 각 시료를 농도별로 처리하여 이를 다시 24시간 배양한 후에 MTT 시약(5 mg/mL)을 넣고, 4시간 동안 방치한 후 상층액을 제거하였다.
- 배양 후, 상층 액 100 μL를 취하여 동량의 Griess 시약을 첨가하고 10분간 반응시키고 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 nitrite의 농도는 sodium nitrite 표준곡선을 이용하여 계산하였다.
- 추출물에 대한 총 폴리페놀 함량은 Folin-Dennis법(12)에 따라 분광광도계를 이용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였다.
성능/효과
- 본 실험에서도 EtOAc 분획물(CEF)에서 폴리페놀 함량이 가장 높게 확인되었고, 다음으로 BuOH 용매 추출물(CBF) 에서 높은 함량이 확인되어 CWF에 비해 CEF및 CBF에서 높은 항산화 활성이 나타날 것으로 예측되었다.
- 100 μg/mL농도에서CWF 51.2%, CEF 47.8%, CBF 42%로 TNF-α 생성 저해효과를 나타냈으며 분획용매에 따른 유의적 차이는 없었다(Fig. 4A).
- 2 μg/mL)와 유사한 활성을 확인하였다. ABTS 자유 라디칼 소거활성 측정 결과, DPPH 분석 결과와 유사한 자유 라디칼 소거능이 확인되었다(Fig. 1B), Table 2). CWF<CBF<CEF 순으로 ABTS 자유 라디칼 소거 활성이 높게 측정되었으며, 특히 폴리페놀 함량이 가장 높게 측정되고 대조군인 BHA와 α-tocopherol보다 높은 DPPH 라디칼 제거 활성이 확인된 CEF(RC50; 36.
- CBF경우 100 μg/mL에서 48%의 소거활성을 나타냈으며 500 μg/mL농도 이상에서는 90% 이상의 높은 소거활성을 나타내 대조군으로 사용된 BHA (butylated hydroxyanisole,89%), α-tocopherol(88%)과 유사한 활성을 보였다.
- CWF<CBF<CEF 순으로 ABTS 자유 라디칼 소거 활성이 높게 측정되었으며, 특히 폴리페놀 함량이 가장 높게 측정되고 대조군인 BHA와 α-tocopherol보다 높은 DPPH 라디칼 제거 활성이 확인된 CEF(RC50; 36.1 μg/mL)는 ABTS 분석 결과에서도 대조군인 BHA(RC50; 49.5 μg/mL) 와 α-tocopherol(RC50; 67.1 μg/mL)보다 높은 활성이 확인되었다.
- 1A). CWF에 비해 폴리페놀 함량이 높게 측정되었던 CBF와 CEF는 더 높은 자유 라디칼 소거활성을 보였다. CBF경우 100 μg/mL에서 48%의 소거활성을 나타냈으며 500 μg/mL농도 이상에서는 90% 이상의 높은 소거활성을 나타내 대조군으로 사용된 BHA (butylated hydroxyanisole,89%), α-tocopherol(88%)과 유사한 활성을 보였다.
- DPPH assay 결과에서, CWF는 분획물중 비교적 낮은 활성을 나타냈지만, 500~1,000 μg/mL농도에서 56%와 73%의 높은 소거활성을 보였다(Fig.1A).
- IL-1β의 생성 저해 효과를 측정한 결과, 산수유 분획물은 IL-1β의 생성을 LPS 단독처리군(121.5 pg/mL)에 비해 유의적으로 감소시켰으며(p<0.05), CWF은 농도 의존적으로 생성량이 감소되었고, 100 μg/mL 농도에서 CWF(69.2 pg/mL,inhibition; 42%)와 CBF(74.9 pg/mL, inhibition; 37%)는 유사한 생성저해 효과를 보였으며, CEF(39.5 pg/mL, inhibition;67%)는 가장 높은 IL-1β 생성 저해효과를 보였다(Fig. 4B).
- LPS 비처리군(460.5 μM)과 비교했을때, CWF 1 μg/mL(754.6 pg/mL)는 비교적 높은 생성량을 보였으나 LPS 단독처리군(958.9 pg/mL)에 비해서 유의적으로 감소됨을 확인하였고(p<0.05), 이를 제외한 모든 실험군(CWF 10~100 μg/mL, CEF 및 CBF 1~100 μg/mL)에서 LPS 단독처리군보다 유의적으로 감소되거나, LPS 비처리군과 유사하였으며, 모든 실험군(CWF 10~100 μg/mL, CEF 및 CBF 1~100 μg/mL)에서 LPS 단독처리군보다 유의적으로 감소됨을 확인하였다(p<0.05).
- 염증이 유도되면 대식세포와 같은 염증세포들은 NO, PGE2와 더불어 염증성 cytokine들을 생성하며 대표적인 염증성 사이토카인으로는 TNF-α, IL-1β, IL-6 등이 있다. LPS 처리로 염증이 활성화된 RAW 264.7 cell은 LPS 비처리군에 비하여 유의성 있게 염증성 사이토카인의 분비를 증가시켰으며, 산수유 분획물의 처리로 염증성 사이토카인의 생성이 저해됨을 확인할 수 있었다(Fig. 4)
- LPS로 염증이 유도되어 NO 생성이 증가된 RAW 264.7cell에서 산수유 분획물 처리에 따라 NO 생성이 저해됨을 확인할 수 있었고, 모든 분획물에서 LPS 단독 처리군(14.8μM)과 비교했을 때, 유의적으로 NO의 생성이 감소되었다(p<0.001).
- NO와 PGE2 분비 조절은 급성 또는 만성 염증질환의 치료방법으로 매우 중요한 것으로 알려져 있으며, 본 실험을 통해 산수유의 모든 분획물은 효과적으로 이들 염증성 NO 와 PGE2의 생성을 저해함을 확인함으로써 산수유 CWF, CEF 및 CBF 모두 염증을 억제하는 뛰어난 효과가 확인되었다.
- 생성된 PGs들 중 PGE2는 염증반응, 면역반응, 그리고 angiogenesis를 촉진하는 등 암 발생에도 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다(21). PGE2의 생성저해 효과를 측정한 결과, 산수유 분획물의 NO 분석 결과와 유사하게 염증성 PGE2의 생성을 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3B). LPS 비처리군(460.
- 그 결과, 1~100 μg/mL 농도에서 산수유 분획물(CWF, CEF, CBF)은 99% 이상의 생존율을 나타내 독성이 없는 것을 확인하여(Fig. 2), 1~100 μg/mL 농도 범위에서 항염증 실험을 진행하였다.
- 그러나 본 실험에서는 산수유 분획물은 EtOAc 뿐만 아니라 water와 butanol 용매의 분획물에서도 우수한 항산화 활성 및 항염증 효과를 확인할 수 있었다.
- 1과 같으며, 소거활성을 50% 감소시키는 값은 Table 2에 정리한 바와 같다. 모든 분획물은 농도가 증가함에 따라 자유 라디칼 소거능이 증가하였다(Fig. 1).
- 본 연구에서 산수유 분획물의 높은 자유 라디칼 소거활성 효과를 확인할수 있었고, 아울러 EtOAc 분획물(CEF)은 BHA보다 우수한 소거활성을 보여, 식품산업에서 항산화제로써의 이용가치뿐 아니라 기능성 식품 소재로써의 이용가치도 높을 것으로사료된다.
- 산수유 분획물의 전 농도구간에서 LPS 단독처리군(8.5 pg/mL)에 비하여 유의적으로 TNF-α, IL-1β, IL-6의 생성이 감소되었으며 CWF은 최저4.1 pg/mL로, CEF은 5.7 pg/mL에서 4.3 pg/mL로 생성량을감소시켰다.
- 산수유 분획물의 총 폴리페놀 함량은 26.7 mg TAE/g에서 179.3 mg TAE/g 범위로 측정되었으며, EtOAc 분획물(CEF) 에서 179.3 mg TAE/g로 가장 높게 측정되었다. Water 분획물(CWF)에서는 26.
- 폴리페놀함량이 가장 높게 측정되었던 CEF(RH50; 25.1 μg/mL)의 경우 50 μg/mL의 농도에서도 73%의 우수한 자유 라디칼 소거활성을 나타내 대조군 BHA(RH50; 53.8 μg/mL)와 α-tocopherol(RH50; 71.3 μg/mL) 보다 높은 DPPH 자유 라디칼 소거활성을 보였고, AsA (Ascorbic acid, RH50; 4.2 μg/mL)와 유사한 활성을 확인하였다.
후속연구
- 그러나 본 실험에서는 산수유 분획물은 EtOAc 뿐만 아니라 water와 butanol 용매의 분획물에서도 우수한 항산화 활성 및 항염증 효과를 확인할 수 있었다. 따라서 각 분획에 있는 산수유의 유효성분에 대한 연구가 필요할 것으로 사료되며, 이를 이용한 기능성 식품으로써의 이용가치가 높을 것으로 판단된다.
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