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문제 정의
- [본 연구는 정상동물모델에서 산약의 NGF 분비 촉진 효과를 확인하고, 이후 당뇨병성 말초신경병증 동물모델에서 산 약의 치료 효과를 확인하고자 하였다. 정상 mouse에 산약 1, 3, 10, 30, 100, 그리고 300 ㎎/㎏을 투여한 mouse의 좌골신경과 침샘에서 NGF 농도를 측정한 결과, control 그룹과 비교했을 때 좌골신경에서는 각각의 산약 농도별 그룹에서 162%, 245%, 237%, 533%, 408% 그리고 366%로 NGF 분비가 높았으며, 침샘에서는 각각 106%, 136%, 115%, 127%, 95% 그리고 118%로 NGF 분비가 촉진되었다.
- 마찬가지로, 본 저자는 마과의 덩굴성 다년생 식물인 산약(Dioscorea rhizoma)의 당부하 내당능 효능, type2 당뇨병 모델에서 혈당 강하 효능을 보고하였다. 본 연구에서는 정상흰쥐에서의 NGF 함량 그리고 당뇨병성 신경병증 모델에서 통증 억제 효능 및 신경전도도에 미치는 영향을 측정함으로써 당뇨병 합병증으로 진행을 억제하는 효능을 보고하고자 한다.
- 정상 mouse에 산약 1, 3, 10, 30, 100 및 300 ㎎/㎏을 투여한 후, mouse의 좌골신경과 침샘에서의 NGF 농도를 측정함으로써 산약 추출물이 NGF 분비에 미치는 영향을 평가하고자 하였다. 산약 추출물을 투여하지 않은 정상군(control) 그룹의 좌골신경에서의 NGF 농도가 14.
제안 방법
- Type 2 db/db mouse를 대조군, 산약 추출물 10과 100 ㎎/㎏용량을 투여한 그룹으로 나누어 각각 5마리씩 총 15마리를 사용하였다. 30일 동안 산약 추출물을 1일 1회 구강 투여한 후 58℃의 hot plate에 각각의 mouse를 올려놓고 투명한 아크릴 박스를 씌운 후 mouse가 최초 jumping하는 시간을 측정한다.
- Type 2 db/db mouse를 대조군, 산약 추출물 10과 100 ㎎/㎏용량을 투여한 그룹으로 나누어 각각 5마리씩 총 15마리를 사용하였다. 30일 동안 산약 추출물을 1일 1회 구강 투여한 후 hot plate 검사 후 신경전도도를 평가하였다. 각각의 mouse를 경추탈골시켜 치사시킨 후 신속하게 마우스의 대퇴부 부위의 피부와 근육을 제거한 후 각각 좌우의 좌골신경을 20 ㎜ 이상의 길이로 분리하여, 공기를 환류시키면서 생리식염수에 보관하였다.
- . 대조군, 산약 추출물을 1, 3, 10, 30, 100 및 300 ㎎/㎏ 용량으로 웅성 ICR 마우스 7주령을 각각 3마리씩 하여 총 21마리의 mouse 좌우 좌골신경과 침샘을 샘플로 하여 42개의 샘플에서 NGF량을 측정하였다. 산약 추출물은 1회 경구투여하고 16시간 후, 좌골신경과 침샘을 채취하여 NGF량을 측정하였다.
- 각각의 mouse를 경추탈골시켜 치사시킨 후 신속하게 마우스의 대퇴부 부위의 피부와 근육을 제거한 후 각각 좌우의 좌골신경을 20 ㎜ 이상의 길이로 분리하여, 공기를 환류시키면서 생리식염수에 보관하였다. 분리된 좌골신경을 15 ㎜ 둥근 측정판 위에 올리고 각각의 신경말단에 센서와 자극기 프로브를 연결한 후 3～5 V 자극과 5 msec duration 하에서 디지털 스토리지 오실로스코프(Digital storage oscilloscope)를 사용하여 전기 전도도를 측정하여 신경 전달 속도를 평가하였다.
- 산약 500 g 에 50% 에탄올 5 ℓ를 가하여 상온에서 48시간 교반하여 얻은 추출액을 종이여과지로 감압 여과한 후 감압농축하여 산약 50 g 에탄올 추출물을 얻었다(Yield : 10%).
- 대조군, 산약 추출물을 1, 3, 10, 30, 100 및 300 ㎎/㎏ 용량으로 웅성 ICR 마우스 7주령을 각각 3마리씩 하여 총 21마리의 mouse 좌우 좌골신경과 침샘을 샘플로 하여 42개의 샘플에서 NGF량을 측정하였다. 산약 추출물은 1회 경구투여하고 16시간 후, 좌골신경과 침샘을 채취하여 NGF량을 측정하였다.
- 즉, 각 채취한 시료를 Table 1으로 구성된 NGF lysis buffer에 잘 섞은 후 10,000 × g 로 4℃에서 원심분리기로 분리하여 분주한 후 ELISA Kit를 이용하여 NGF의 양을 측정하였다. 샘플의 NGF 양은 계산된 standard curve를 이용하여 수치화하였다.
- 즉, 각 채취한 시료를 Table 1으로 구성된 NGF lysis buffer에 잘 섞은 후 10,000 × g 로 4℃에서 원심분리기로 분리하여 분주한 후 ELISA Kit를 이용하여 NGF의 양을 측정하였다.
대상 데이터
- Nerve Growth Factor ELISA Kit(DY 556)은 R&D system (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였고, 기타 시약들은 ACS 급 시약을 사용하였다.
- Type 2 db/db mouse를 대조군, 산약 추출물 10과 100 ㎎/㎏용량을 투여한 그룹으로 나누어 각각 5마리씩 총 15마리를 사용하였다. 30일 동안 산약 추출물을 1일 1회 구강 투여한 후 58℃의 hot plate에 각각의 mouse를 올려놓고 투명한 아크릴 박스를 씌운 후 mouse가 최초 jumping하는 시간을 측정한다.
- 산약(Dioscorea rhizoma, Dioscoreaceae)는 경동시장(Seoul, Korea)에서 구입하였고, 표품은 경희대학교 동서의학대학원에 보관하였다.
- 모든 동물실험 과정은 NIH(National Institutes of Health)의 실험동물관리 규정(Principle of Laboratory Animal Care, NIH publication, #85-23, revised 1985)와 경희대학교의 실험동물 관리와 사용 지침(Animal Care and Use Guidelines of Kyunghee University, Korea)의 규정에 따라 수행하였다. 실험 동물은 ICR 마우스, db/db 마우스 웅성 7주령을 중앙 실험동물(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용했다. 모든 동물들은 22±2℃으로 조절된 온도에서 12시간 간격으로 조명을 켠 환경에서 사육하였다.
데이터처리
- 통계처리는 Prism 4.0(GraphPad Software, Inc. USA ver. 4.0)프로그램을 사용하였고, 모든 결과는 mean±standard error mean(SEM)으로 나타냈고 유의성 검정은 One-way ANOVA로 수행하였으며, 사후검증은 Turkey test로 하여 p값이 0.05 이하인 경우만 통계학적 유의성이 있는 것으로 하였다.
이론/모형
- Nerve Growth Factor ELISA Kit(DY 556)은 R&D system (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였고, 기타 시약들은 ACS 급 시약을 사용하였다. 모든 동물실험 과정은 NIH(National Institutes of Health)의 실험동물관리 규정(Principle of Laboratory Animal Care, NIH publication, #85-23, revised 1985)와 경희대학교의 실험동물 관리와 사용 지침(Animal Care and Use Guidelines of Kyunghee University, Korea)의 규정에 따라 수행하였다. 실험 동물은 ICR 마우스, db/db 마우스 웅성 7주령을 중앙 실험동물(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용했다.
- 정상 마우스의 좌골신경과 침샘의 신경성장인자는 ELISA Kit 방법에 의해 측정하였다12). 대조군, 산약 추출물을 1, 3, 10, 30, 100 및 300 ㎎/㎏ 용량으로 웅성 ICR 마우스 7주령을 각각 3마리씩 하여 총 21마리의 mouse 좌우 좌골신경과 침샘을 샘플로 하여 42개의 샘플에서 NGF량을 측정하였다.
성능/효과
- 정상 mouse에 산약 1, 3, 10, 30, 100, 그리고 300 ㎎/㎏을 투여한 mouse의 좌골신경과 침샘에서 NGF 농도를 측정한 결과, control 그룹과 비교했을 때 좌골신경에서는 각각의 산약 농도별 그룹에서 162%, 245%, 237%, 533%, 408% 그리고 366%로 NGF 분비가 높았으며, 침샘에서는 각각 106%, 136%, 115%, 127%, 95% 그리고 118%로 NGF 분비가 촉진되었다. Thermal hyperalgesia에 시간을 평가한 결과, control 그룹과 비교했을 때 산약 10 ㎎/㎏을 투여한 그룹과는 차이가 나지 않았고, 산약 100 ㎎/㎏을 투여한 그룹은 157% 증가하여 당뇨병성 말초신경병증으로 인한 통증 완화에도 효과가 있었다. Type 2 db/db mouse에 산약 10 ㎎/㎏과 100 ㎎/㎏을 투여한 후, 마우스의 좌골신경에서 운동신경전달속도와 감각신경전달속도를 평가한 결과, control 그룹과 비교했을 때 운동신경전달속도는 각각 120%와 152% 증가했고, 감각신경전달속도는 각각 112%와 142%증가하였다.
- Type 2 db/db mouse에 산약 10 ㎎/㎏과 100 ㎎/㎏을 투여한 마우스의 좌골신경에서 운동신경전달속도와 감각신경전달 속도를 평가한 결과, 산약을 투약하지 않은 control 그룹의 운동신경전달속도와 감각신경전달속도는 각각 25 m/s와 26 m/s였고, 산약 10 ㎎/㎏을 투여한 그룹의 신경전달속도는 각각 30 m/s와 29 m/s였고, 산약 100 ㎎/㎏을 투여한 그룹의 신경전달속도는 각각 38 m/s와 37 m/s였다. 운동신경전달속도에서 산약 100 ㎎/㎏을 투여한 그룹은 control 그룹보다 유의한 개선 효과를 나타냈고(p<0.
- Thermal hyperalgesia에 시간을 평가한 결과, control 그룹과 비교했을 때 산약 10 ㎎/㎏을 투여한 그룹과는 차이가 나지 않았고, 산약 100 ㎎/㎏을 투여한 그룹은 157% 증가하여 당뇨병성 말초신경병증으로 인한 통증 완화에도 효과가 있었다. Type 2 db/db mouse에 산약 10 ㎎/㎏과 100 ㎎/㎏을 투여한 후, 마우스의 좌골신경에서 운동신경전달속도와 감각신경전달속도를 평가한 결과, control 그룹과 비교했을 때 운동신경전달속도는 각각 120%와 152% 증가했고, 감각신경전달속도는 각각 112%와 142%증가하였다. 당뇨병성 말초신경병증에 있어서 좌골신경의 신경전달속도가 산약의 농도와 좌골신경의 NGF 분비량과 비례적으로 개선되었다.
- Type 2 db/db mouse에 산약 추출물 10 ㎎/㎏과 100 ㎎/㎏을 투여한 후 thermal hyperalgesia의 미치는 영향을 평가한 결과, 산약을 투약하지 않은 control 그룹의 온도에 대한 통감각 시간은 35초이고, 산약 10 ㎎/㎏을 투여한 그룹의 통감각 시간은 34초였고 산약 100 ㎎/㎏을 투여한 그룹의 통감각 시간은 55초였다. Type 2 db/db mouse에 산약을 투여한 후 온도에 대한 통감각 개선 효과를 평가한 결과, 산약 10 ㎎/㎏ 투여 그룹의 경우 통감각 개선 효과가 나타나지 않았으나, 산약 100 ㎎/㎏ 투여 그룹에서는 온도에 대한 통감각 개선 효과가 나타났다(Fig.
- Type 2 db/db mouse에 산약 추출물 10 ㎎/㎏과 100 ㎎/㎏을 투여한 후 thermal hyperalgesia의 미치는 영향을 평가한 결과, 산약을 투약하지 않은 control 그룹의 온도에 대한 통감각 시간은 35초이고, 산약 10 ㎎/㎏을 투여한 그룹의 통감각 시간은 34초였고 산약 100 ㎎/㎏을 투여한 그룹의 통감각 시간은 55초였다. Type 2 db/db mouse에 산약을 투여한 후 온도에 대한 통감각 개선 효과를 평가한 결과, 산약 10 ㎎/㎏ 투여 그룹의 경우 통감각 개선 효과가 나타나지 않았으나, 산약 100 ㎎/㎏ 투여 그룹에서는 온도에 대한 통감각 개선 효과가 나타났다(Fig. 3). 본 실험 결과 산약의 투여는 당뇨병의 합병증 중 하나인 통감각 과민성을 개선시키는 것으로 판단된다.
- 01). Type 2 db/db mouse에 산약을 투여한 후 운동신경전달속도와 감각신경전달속도의 개선 효과를 평가한 결과, 산약 투여 용량과 비례적으로 신경전달속도가 증가함을 확인할 수 있었다 (Fig. 4). 본 실험 결과, 산약의 투여는 당뇨병으로 인한 말초신경병증을 개선시키는 것으로 판단된다.
- Type 2 db/db mouse에 산약 10 ㎎/㎏과 100 ㎎/㎏을 투여한 후, 마우스의 좌골신경에서 운동신경전달속도와 감각신경전달속도를 평가한 결과, control 그룹과 비교했을 때 운동신경전달속도는 각각 120%와 152% 증가했고, 감각신경전달속도는 각각 112%와 142%증가하였다. 당뇨병성 말초신경병증에 있어서 좌골신경의 신경전달속도가 산약의 농도와 좌골신경의 NGF 분비량과 비례적으로 개선되었다. 본 연구 결과 산약은 NGF 분비를 촉진 시키고 당뇨병성 말초신경병증으로 인한 말초신경 손상도 개선시키는 것으로 나타났다.
- 3). 본 실험 결과 산약의 투여는 당뇨병의 합병증 중 하나인 통감각 과민성을 개선시키는 것으로 판단된다.
- 4). 본 실험 결과, 산약의 투여는 당뇨병으로 인한 말초신경병증을 개선시키는 것으로 판단된다.
- Thermal hyperalgesia 검사는 통감각에 대한 역치를 시간으로 평가한 것으로 시간이 짧을수록 말초신경 손상으로 통 감각에 대한 역치가 낮아졌음을 의미한다. 본 실험에서 산약 100 ㎎/㎏을 투여한 당뇨 mouse의 경우, latency가 길어져 통 감각에 대한 역치가 높아졌음을 나타냈고, 이는 산약 투여로 증가한 NGF량이 증가됨으로써 말초신경 손상을 개선한 결과로 사료된다.
- 당뇨병성 말초 신경병증은 운동신경과 감각신경으로 구분하며, 운동신경섬유가 손상되는 경우 근육위축이 나타날 수 있으며, 감각신경섬유가 손상되는 경우는 감각의 손상이 일어날 수 있다26). 본 실험에서 산약 투여 후 증가한 신경전달속도는 고혈당으로 손상되는 말초신경의 미엘린에 보호작용이 있음을 나타낸다. 이는 산약 투여로 NGF 분비가 증가되어 remyelination됨으로써 손상된 말초신경을 개선시키는데 영향을 미친 것으로 사료된다.
- 2). 본 실험을 통하여 산약 추출물은 당뇨병 합병증으로 유발되는 말초신경병증을 개선시킬 수 있는 것으로 알려진 NGF 분비를 촉진시킴을 확인할 수 있었다.
- 당뇨병성 말초신경병증에 있어서 좌골신경의 신경전달속도가 산약의 농도와 좌골신경의 NGF 분비량과 비례적으로 개선되었다. 본 연구 결과 산약은 NGF 분비를 촉진 시키고 당뇨병성 말초신경병증으로 인한 말초신경 손상도 개선시키는 것으로 나타났다.
- 5 pg/㎖이었다. 산약 추출물 1, 3, 10, 30, 100 및 300㎎/㎏을 투여한 그룹의 침샘 내 NGF 농도는 각각 382.5, 490.5, 415.5, 457.5, 346.5 및 427.5 pg/㎖로 산약 투여 용량 100 ㎎/㎏을 제외한 나머지 그룹에서는 투약하지 않은 정상 그룹보다 NGF의 농도가 높았으나, 산약의 투여 용량과 비례관계는 나타나지 않았다(Fig. 2). 본 실험을 통하여 산약 추출물은 당뇨병 합병증으로 유발되는 말초신경병증을 개선시킬 수 있는 것으로 알려진 NGF 분비를 촉진시킴을 확인할 수 있었다.
- 5 pg/㎖이었다. 산약 추출물 1, 3, 10, 30, 100, 및 300 ㎎/㎏을 투여한 그룹의 NGF 농도는 각각 23.4, 35,5, 34.4, 77.3, 59.1 및 53.1 pg/㎖로 산약 투여 용량 30 ㎎/㎏까지는 NGF 분비량도 비례적으로 증가하였으나, 그 이상의 용량에서는 다소 감소하는 경향을 보였다(Fig. 1). 또한, 산약 추출물을 투약하지 않은 정상 그룹의 침샘의 NGF 농도가 361.
- 운동신경전달속도에서 산약 100 ㎎/㎏을 투여한 그룹은 control 그룹보다 유의한 개선 효과를 나타냈고(p<0.01), 감각신경전달속도에서 산약 100㎎/㎏을 투여한 그룹은 control 그룹과 산약 10 ㎎/㎏을 투여한 그룹보다 유의한 개선 효과를 나타냈다(p<0.001, p<0.01).
- [본 연구는 정상동물모델에서 산약의 NGF 분비 촉진 효과를 확인하고, 이후 당뇨병성 말초신경병증 동물모델에서 산 약의 치료 효과를 확인하고자 하였다. 정상 mouse에 산약 1, 3, 10, 30, 100, 그리고 300 ㎎/㎏을 투여한 mouse의 좌골신경과 침샘에서 NGF 농도를 측정한 결과, control 그룹과 비교했을 때 좌골신경에서는 각각의 산약 농도별 그룹에서 162%, 245%, 237%, 533%, 408% 그리고 366%로 NGF 분비가 높았으며, 침샘에서는 각각 106%, 136%, 115%, 127%, 95% 그리고 118%로 NGF 분비가 촉진되었다. Thermal hyperalgesia에 시간을 평가한 결과, control 그룹과 비교했을 때 산약 10 ㎎/㎏을 투여한 그룹과는 차이가 나지 않았고, 산약 100 ㎎/㎏을 투여한 그룹은 157% 증가하여 당뇨병성 말초신경병증으로 인한 통증 완화에도 효과가 있었다.
- 특히 당뇨병성 말초신경병증의 병인은 NGF 의 감소와 관련성이 매우 높은 것으로 보고되고 있다5). 즉, 당뇨병성 말초신경병증을 유발한 설치류 동물 모델에서 NGF의 투여는 신경병증의 진행을 억제하여 NGF가 당뇨병성 말초신경병증의 치료 가능성이 있음을 제시하였다.
후속연구
- 당뇨병 유발 마우스의 좌골신경에서 운동신경의 전도속도의 감소와 아울러 substance P나 CGRP와 같은 신경전달물질뿐만 아니라 신경 성장인자의 농도가 감소한다고 하였다13,18～22). 본 실험 결과로부터 산약은 NGF 분비를 촉진함으로써 당뇨병성 신경병증을 개선할 수 있는 천연물로 사료된다.
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