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문제 정의
- 위선암종은 Lauren의 분류(29)에 따라 장형 선암종과 미만형 선암종으로 분류할 수 있으며 이 두유형은 형태학적으로나 임상적으로도 차이가 있다.(29, 30) 이에 면역조직화학적 방법을 이용하여 위선암종 조직에서 nuclear retinoid receptor 및 CREB 의 발현정도를 알아보고 이들 사이의 상관성 및 임상-병 리조직학적 예후인자들과 검토하여 에후인자로서의 가능성 및 발암과정에서의 상호작용에 의한 일부 역할수행여부를 알아보고자 하였다.
제안 방법
- RAR과 CREB에 대한 염색의 판정은 종양세포의 핵에 분명한 적갈색으로 염색된 경우를 양성으로 판정하였고 면역조직화학적 반응도의 평가는 전체세포의 10% 이상에서 염색 상을 보일 때 양성으로 판정하였고 염색상이 10~30%인 경우를 + (국소적), 30% 이상인 경우를 ++ (다발성)으로판정하였다.
- 각 예의 파라핀 포매 조직에서 4~5〃m 두께의 절편을 박절하고 탈파라핀하고, 무수 알코올, 90%, 75% 및 50% 알코올에서 차례대로 함수과정을 거쳐서 증류수에 5분간 수세하였다. 내인성 과산화효소의 활성을 억제하기 위해 0.
- 내인성 과산화효소의 활성을 억제하기 위해 0.5% hydrogen peroxide에 10분간 처리 후 증류수로 수세하였다. 항원성 회복을 위하여 10 mM citrate (pH 6.
- USA)에 20 분간작용 후, streptoavidin과 결합한 과산화 효소 복합체를 가하여 20분간 반응시킨 후 AEC chromogen (3-amino-9-ethylc- arbazole) 용액으로 발색하고 Mayer hematoxylin으로 대조 염 색을 실시하여 광학현미 경 으로 관찰하였다. 면 역 조직 화학염 색반응의 음성 대조군으로는 위선암종조직 에서 일차 항체를 처리하지 않고 음성대조 시약으로 대체하여 이용하였고 양성 대조군으로는 유방암조직 (Cell Signaling technology, USA)을 이용하였다.
- 5)으로 수세 하였다. 면역조직화학염색의 비특이성 반응을 제거하기 위해 30분간 염소 혈청으로 처리하고, 여분의 용액을 제거한 다음 일차항체인 RAR (Zymed Co, USA, mouse monoclonal, 1 : 500)과 CREB (RB01700-PO, Zymed Co, USA, mouse monoclonal, 1 : 500) 을 실온에서 24시간 반응시킨 후 TBS로 5분간 3회 수세한 다음 biotin이 부착된 이차항체 (Zymed Co. USA)에 20 분간작용 후, streptoavidin과 결합한 과산화 효소 복합체를 가하여 20분간 반응시킨 후 AEC chromogen (3-amino-9-ethylc- arbazole) 용액으로 발색하고 Mayer hematoxylin으로 대조 염 색을 실시하여 광학현미 경 으로 관찰하였다. 면 역 조직 화학염 색반응의 음성 대조군으로는 위선암종조직 에서 일차 항체를 처리하지 않고 음성대조 시약으로 대체하여 이용하였고 양성 대조군으로는 유방암조직 (Cell Signaling technology, USA)을 이용하였다.
- 5% hydrogen peroxide에 10분간 처리 후 증류수로 수세하였다. 항원성 회복을 위하여 10 mM citrate (pH 6.0) 완충액에 담가 5분간 2회 극초단파 처리 후 실온에서 냉각시키고 50 mM Tris 완충용액 (TBS, pH 7.5)으로 수세 하였다. 면역조직화학염색의 비특이성 반응을 제거하기 위해 30분간 염소 혈청으로 처리하고, 여분의 용액을 제거한 다음 일차항체인 RAR (Zymed Co, USA, mouse monoclonal, 1 : 500)과 CREB (RB01700-PO, Zymed Co, USA, mouse monoclonal, 1 : 500) 을 실온에서 24시간 반응시킨 후 TBS로 5분간 3회 수세한 다음 biotin이 부착된 이차항체 (Zymed Co.
- 환자의 기록을 검토하여 침윤깊이 및 림프절 전이 유무를 조사하였다. 위선암종의 조직학적 분류는 Lauren의 분류법(29)에 따라 종양세포가 주로 선구조로 구성되어 있는 장형과 종양세포가 작고 둥근모양이며 낱개로 흩어져 선 구조를 형성하지 않으며 경계가 불분명한 미만형으로 분류하였다.
대상 데이터
- 중앙대학교 의과대학 용산병원에서 1998년 1월부터 2007 년 12월까지 위절제술을 시행 받고 위선암종으로 진단받은 환자의 위조직표본 중 보존상태가 양호한 파라핀 포매괴 150예를 연구대상으로 하였다.
데이터처리
- 통계학적 유의성은 chi-square test로 분석하여 P<0.05 인 것을 의의있는 것으로 하였다.
이론/모형
- 위선암종의 조직학적 분류는 Lauren의 분류법(29)에 따라 종양세포가 주로 선구조로 구성되어 있는 장형과 종양세포가 작고 둥근모양이며 낱개로 흩어져 선 구조를 형성하지 않으며 경계가 불분명한 미만형으로 분류하였다.
성능/효과
- (25) 최근에는 암세포에서의 이러한 핵 수용체와 공동활성인자의 유전자 발현에 대한 연구가 진행되고 있고(26-29) 유방암, 침샘선암 등에서 이러한 인자들은 서로 밀접하게 전사조절에 관여한다고 알려져 있다.(28, 29) 한국인에서 발생하는 악성종양중 발생빈도가 높은 위선 암종은 형태학적 소견, 침윤양상, 임상경과 등에 있어서 이질성을 보인다. 이러한 위선암종의 예후를 예견하기 위해서 많은 인자들의 검색이 진행되고 있다.
- CREB의 발현양상은 장형 위선암종에서는 108예 중 34 예(31.5%)에서 국소적 발현을 나타냈고 41예(37.9%)에서 다발성 발현을 보였다. 미만형 위선암종 42예 중 9예(21.
- RAR의 발현양상은 장형 위선암종에서는 전반적으로 발현 강도가 높고, 다발성의 발현을 보였으나 미만형에서는 발현을 나타내기는 하나 발현강도도 장형 위선암종에 비해 약하고 국소적 발현을 나타냈다(Fig. 1). 장형 위선암종에서는 108예 중 29예(26.
- 따라서 CREBe 미만형 위선암종보다는 장형 위선암종에서 의미있는 발현양상을 보였고(P0.05).
- 따라서 RARe 미만형 위선암종보다는 장형 위선암종에서 의미 있는 발현양상을 보였고(P0.05).
- 05). 림프절 전이가 없는 경우보다 림프절 전이가 있는 경우에서 높은 발현율을 나타냈다(P<0.01)(Table 2).
- 05). 림프절 전이가 없는 경우보다 림프절 전이가 있는 경우에서 높은 발현율을 나타냈다(P<0.01)(Table 3, Fig. 2). 또한 총 150예의 위선암종에서 RARe 63.
- 3%)에서 국소적 발현을, 4예(445%)에서 다발성 발현을 나타냈다. 림프절전이가 있었던 83예 중 23예(27.7%)에서 국소적 발현을, 39 예(47%)에서 다발성 발현이 관찰되었고 림프절 전이가 없었던 67예에서는 17예(25.4%)에서 국소적 발현을, 16예 (23.8%)에서 다발성 발현을 나타냈다. 따라서 RARe 미만형 위선암종보다는 장형 위선암종에서 의미 있는 발현양상을 보였고(P<0.
- 3%)에서 다발성 발현을 나타냈다. 림프절전이가 있었던 83예 중 31예(37.4%)에서 국소적 발현을, 28 예(33.7%)에서 다발성 발현이 관찰되었고 림프절 전이가 없었던 67예에서는 12예(17.9%)에서 국소적 발현을, 20예 (29.9%)에서 다발성 발현을 나타냈다. 따라서 CREBe 미만형 위선암종보다는 장형 위선암종에서 의미있는 발현양상을 보였고(P< 0.
- (27, 28) 위선암종은 발암기전에 대한 연구가 절실히 요구되고 있고 또한 위암의 예후를 예견하기 위해서 많은 인자들의 검색이 진행되고 있다. 본 연구에서는 장형 위선 암종에서 72.2%, 미만형 위선암종에서 40.5%의 발현율을 보여 통계학적으로 의미 있는 차이를 나타냈다. 발현 강도도 미만형의 경우, 다발성 발현을 보이더라도 발현강도가 약한 반면, 장형 위선암종의 경우 45.
- 이러한 분화도에 따른 발현의 차이는 RAR과 마찬가지로 점액을 분비하는 상피세포의 분화 및 증식과 관련이 있고 또한 장형 선암종의 발암과정에서의 CREB의 일부 역할 관련 가능성을 시사하는 소견으로 생각되었으나 이 또한 보다 세밀한 분자병리학적 연구의 뒷받침이 필요하다 하겠다. 암의 진행에 따른 CREB의 발현은 통계학적 유의성은 없었으나, 림프절 전이유무에 따른 CREB의 발현은 통계학적으로 의미 있는 발현율의 차이를 나타냈다. 이상의 결과로 위선 암종에서 RAR과 CREBe 조직학적 분화도 및 종양의 진행과 관련이 있으며 예후인자로서 도움을 줄 수 있으며 발암 과정에서의 상호작용에 의한 일부 역할수행이 있을 것으로 생각된다.
- 이는 조직학적 등급에 따른 발현양상의 차이를 의미하며 특히 점액을 분비하는 상피세포의 분화 및 증식과 관련이 있고 아울러 장형 선암종의 발암과정에서의 일부 역할 관련 가능성을 시사하는 소견으로 생각되었으나 이를 뒷받침하기 위해서는 여러 분자병리학적 연구가 병행되어야 할 것으로 사료되 었다. 암의 진행에 따른 RAR의 발현은 통계학적 유의성은 없었으나 암이 진행할수록 다소 높은 발현율을 나타내었으며, 림프절 전이유무에 따른 RAR의 발현은 통계적으로 의미있는 발현율의 차이를 나타냈다.
- 인체 내 여러 조직에서 상피세포의 분화 및 증식에 중요한 역할을 담당한다고 알려진 retinoic acid와 여러 유전자들에서 전사조절인자로 성장관여 유전자들의 활성화에 관여하며 세포증식 및 분화에 매우 중요한 세포 내 조절인자인 CREB의 발현정도를 위선암종으로 수술받은 환자 150 예를 대상으로 조직표본에서 면역조직화학적 염색을 통해 관찰하고 이들 간의 상호 연관성 및 병리학적 인자들과의 관계를 조사하여 결과를 얻었으며, 본 연구의 결과로 RAR과 CREBe 조직학적 분화도 및 종양의 전이와 관련이 있고, 이들의 발현이 장형 위선암종에서의 생물학적 악성도에 관한 예후인자로서의 가능성을 보였으며, 또한 이들 단 백의 발현 부위도 통계학적으로 의미 있는 일치양상을 나타내 어 발암 과정 중 상호작용에 의한 일부 역할을 수행하리라 생각된다.
- (21-24, 26) 본 연구에서 CREBe RAR과 유사한 결과를 나타냈다. 장형 위선암종에서 69.4%, 미만형 위선 암종에서 38.1%의 발현율을 보여 통계학적으로 의미있는 차이를 나타냈고 발현강도도 미만형보다 장형 위선 암종에서 높은 다발성 발현률과 함께 강한 발현강도를 나타내었다. 이러한 분화도에 따른 발현의 차이는 RAR과 마찬가지로 점액을 분비하는 상피세포의 분화 및 증식과 관련이 있고 또한 장형 선암종의 발암과정에서의 CREB의 일부 역할 관련 가능성을 시사하는 소견으로 생각되었으나 이 또한 보다 세밀한 분자병리학적 연구의 뒷받침이 필요하다 하겠다.
후속연구
- 3%에서 다발성 발현과 함께 종양세포 핵내에 강한 발현강도를 나타내었다. 이는 조직학적 등급에 따른 발현양상의 차이를 의미하며 특히 점액을 분비하는 상피세포의 분화 및 증식과 관련이 있고 아울러 장형 선암종의 발암과정에서의 일부 역할 관련 가능성을 시사하는 소견으로 생각되었으나 이를 뒷받침하기 위해서는 여러 분자병리학적 연구가 병행되어야 할 것으로 사료되 었다. 암의 진행에 따른 RAR의 발현은 통계학적 유의성은 없었으나 암이 진행할수록 다소 높은 발현율을 나타내었으며, 림프절 전이유무에 따른 RAR의 발현은 통계적으로 의미있는 발현율의 차이를 나타냈다.
- 1%의 발현율을 보여 통계학적으로 의미있는 차이를 나타냈고 발현강도도 미만형보다 장형 위선 암종에서 높은 다발성 발현률과 함께 강한 발현강도를 나타내었다. 이러한 분화도에 따른 발현의 차이는 RAR과 마찬가지로 점액을 분비하는 상피세포의 분화 및 증식과 관련이 있고 또한 장형 선암종의 발암과정에서의 CREB의 일부 역할 관련 가능성을 시사하는 소견으로 생각되었으나 이 또한 보다 세밀한 분자병리학적 연구의 뒷받침이 필요하다 하겠다. 암의 진행에 따른 CREB의 발현은 통계학적 유의성은 없었으나, 림프절 전이유무에 따른 CREB의 발현은 통계학적으로 의미 있는 발현율의 차이를 나타냈다.
- 현재까지 RAR이나 CREB의 경우 정상세포나 조직에서 연구보고는 있었으나 두경부 암종 등 일부 암종에서의 보고만 있을 뿐 암종에서의 연구가 미비한 상태이고 몇몇 분자유전학적 실험자료는 있으나 인체조직을 이용한 연구는 거의 없다. 이러한 점에서 본 연구가 위선암종에서만 국한되었으며 병리조직학적 측면의 연구라는 점에서 의의가 있고 본 연구결과를 토대로 이러한 소견들을 뒷받침하기 위한 보다 세밀한 분자생물학적 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 암의 진행에 따른 CREB의 발현은 통계학적 유의성은 없었으나, 림프절 전이유무에 따른 CREB의 발현은 통계학적으로 의미 있는 발현율의 차이를 나타냈다. 이상의 결과로 위선 암종에서 RAR과 CREBe 조직학적 분화도 및 종양의 진행과 관련이 있으며 예후인자로서 도움을 줄 수 있으며 발암 과정에서의 상호작용에 의한 일부 역할수행이 있을 것으로 생각된다. 하지만 예후인자로서의 가치를 증명하기 위해서는 대상환자들을 추적관찰하여 얻어진 자료에서의 비교연구가 이루어져야 하겠다.
- 이상의 결과로 위선 암종에서 RAR과 CREBe 조직학적 분화도 및 종양의 진행과 관련이 있으며 예후인자로서 도움을 줄 수 있으며 발암 과정에서의 상호작용에 의한 일부 역할수행이 있을 것으로 생각된다. 하지만 예후인자로서의 가치를 증명하기 위해서는 대상환자들을 추적관찰하여 얻어진 자료에서의 비교연구가 이루어져야 하겠다. 현재까지 RAR이나 CREB의 경우 정상세포나 조직에서 연구보고는 있었으나 두경부 암종 등 일부 암종에서의 보고만 있을 뿐 암종에서의 연구가 미비한 상태이고 몇몇 분자유전학적 실험자료는 있으나 인체조직을 이용한 연구는 거의 없다.
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