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문제 정의
- 그러므로 본 연구에서는 제주 연안에서 자생하는 해조류 중 갈조류 10종의 메탄올 추출물을 이용하여 활성산소 소거능과 아밀로이드 베타 단백질(Aβ)이라는 신경독성 유발물질에 대한 HT-22 신경세포 보호효과를 관찰해 보았다.
- 본 연구에서는 10종의 갈조류 메탄올 추출물을 이용하여 1,1-diphenyl2-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거능과 아밀로이드 베타 단백질(Aβ)의 신경독성에 대한 HT-22 신경세포 보호효과를 조사함으로써 천연물로부터 안전하고 새로운 신경세포 보호소재를 개발해내고자 한다.
- 본 연구에서는 Aβ의 신경독성으로 인해 신경세포에서 활성화된 MAP kinase의 저해양상을 분석하였다.
- 본 연구에서는 갈조류 10종의 메탄올 추출물과 일반적으로 잘 알려진 합성 항산화제인 BHA를 대조군으로 하여 DPPH 라디칼 소거능을 측정해 보았다(Fig. 1). 그 결과 대 조군은 83.
제안 방법
- Aβ1-42와 갈조류 추출물 처리군과 Aβ1-42 처리군의 세포 생존율은 Aβ1-42와 갈조류 추출물을 처리하지 않은 HT-22 세포의 세포 생존율을 100%로 정하고 이에 대해 상대적인 세포 생존율로 구하였다.
- Aβ의 신경독성에 대해 10종의 갈조류 추출물이 갖는 HT-22 신경세포 보호효과를 검증하기 위해 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 분석과 APP, BACE1, iNOS 단백질의 발현양상 및 ERK1/2, p38, JNK1/2 단백질의 활성화 양상을 분석했다.
- 1% Tween 20) 에 넣어 상온에서 1시간 정도 blocking 시킨 후 TTBS로 10분간 3회 세척하였다. APP(1:5,000, Sigma-Aldrich Co.), BACE1(1:2,000, Sigma-Aldrich Co.), iNOS(1: 10,000, Abcam, Inc., Cambridge, MA, USA), ERK1/2(1: 1,000, Sigma-Aldrich Co.), phospho ERK1/2(1:1,000, Sigma-Aldrich Co.), p38(1:1,000, Sigma-Aldrich Co.), phospho p38(1:1,000, Sigma-Aldrich Co.), JNK(1:1,000, Sigma-Aldrich Co.), phospho JNK(1:1,000, SigmaAldrich Co.)로 희석한 1차 항체를 처리하여 상온에서 1시간 반응시킨 후 TTBS로 10분간 3회 세척한 다음 2차 항체로는 HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 anti-rabbit IgG(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)와 anti-mouse IgG (Bio-Rad)를 1:5,000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응시켰다. 그 후 membrane을 TTBS로 10분간 3회 세척한 다음 ECL(enhanced chemiluminescence, Amersham Biosciences) 기질과 5~10분간 반응 후 X-ray 필름 (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA)에 감광하였다.
- HT-22 세포(5×105)에 200 µM 아밀로이드 베타 단백질(Aβ1-42) 10 μL와 25 μg/mL의 갈조류 추출물을 처리하여 37°C, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
- HT-22 세포를 96 well plate에 세포수가 5×104/well이 되게 분주하여 24시간 배양 후 배양액을 제거하고 fetal bovine serum이 포함되지 않은 배양액을 분주한 후 200 µM 아밀로이드 베타 단백질(Aβ1-42) 1 μL와 갈조류 추출물 25, 50 μg/mL를 처리하여 37°C, 5% CO2 조건으로 배양기에서 배양하였다.
- 갈조류 추출물이 아밀로이드 베타에 의한 독성으로부터 신경세포의 생존 및 성장에 미치는 영향을 관찰하고자 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 분석법을 수행하였다. MTT 분석법은 세포의 생장률을 측정하는 방법으로서 살아있는 세포의 미토콘드리아 내의 dehydrogenase가 황색 수용성 물질인 MTT (Gibco-BRL)에 의해 dark blue formazan을 생성하는 원리로 이 환원되는 정도를 흡광도로 측정함으로써 알아보는 방법이다(35).
- 세포생장률 측정 분석을 통해 아밀로이드 베타 단백질(Aβ)의 신경독성에 대한 신경세포 생존률이 유의적으로 높았던 알쏭이모자반, 불레기말, 바위수염, 미역쇠, 짝잎모자반 추출물을 이용하여 신경세포 사멸과 관련된 단백질 발현양상을 살펴보았다.
- 신경세포의 사멸과 관련된 MAP kinase의 활성화된 상태의 발현 양상을 살펴보았다(Fig. 3). PC12세포에서 Aβ의 처리로 ERK와 p38을 통해 iNOS의 발현이 증가한다는 연구 결과가 있었고(16) MAP kinases pathway가 알츠하이머병의 병인인 Aβ와 밀접한 관련이 있다는 많은 보고가 있었다(28,29).
- 아밀로이드 베타 단백질(Aβ)의 신경독성에 대한 신경세포 보호효과를 가진 갈조류 추출물이 신경세포 사멸 경로 중 작용되는 부분을 알아보고자 Western blot을 통해 APP, BACE1, iNOS, MAP kinase의 단백질 발현양상을 살펴보았다.
- 아밀로이드 베타 단백질의 독성에 의한 신경세포 생존율을 측정함으로써 갈조류의 HT-22 세포 보호효과를 살펴보았다(Table 2). 배양한 세포에 아밀로이드 베타 단백질(Aβ1-42)을 처리하고 갈조류 추출물을 25 μg/mL 처리하였을 때 Aβ1-42만을 처리한 군에서는 85.
- 전자공여능의 측정은 Blois의 방법(34)을 변형하여 사용하였다. 0.
- 제주 연안 갈조류 추출물이 아밀로이드 베타 단백질의 신경독성에 대한 신경세포 보호효과를 탐색하기 위해 항산화활성(DPPH 라디칼 소거능), 세포 생존에 미치는 영향(MTT assay), 신경독성에 관여하는 HT-22 세포내 단백질의 발현 정도를 조사하였다.
대상 데이터
- 2 mM 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 을 180 μL, 1 mg/mL 농도의 갈조류 추출물 20 μL를 섞어 총량이 200 μL가 되게 96 well plate에 분주하고 암실에서 30분 반응 후 VersaMax tunable microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 널리 알려져 있는 합성 항산화제인 butyl hydroxyanisole(BHA)을 사용하였으며 전자공여능은 다음과 같은 방법으로 계산하였다.
- 본 실험에서는 제주도 연안에 서식하고 있는 갈조류 10종의 추출물을 제주테크노파크 산하 제주생물자원지원센터 제주유용생물자원 추출물 은행으로부터 채집해 보관해 놓았던 것을 분양받아 사용하였다(Table 1). 분양받은 추출물은 80% 메탄올을 용매로 추출하여 감압농축된 것으로 농도는 1 mg/mL가 되게 dimethylsulfoxide(DMSO, JT Baker, Phillipsburg, NJ, USA)에 녹여서 실험에 사용하였다.
- 본 연구에서는 흰쥐의 HT-22(hippocampal neuron cell line) 세포를 사용하였다. HT-22 세포는 10% fetal bovine serum(FBS), 100 unit/mL penicillin-streptomycin이 함 유된 Dulbecco's modification of Eagle's medium(DMEM, Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)을 사용하여 37°C, 5% CO2 조건으로 배양기(MCO-17AI, SANYO Electric Biomedical Co.
데이터처리
- Significant differences between treatments with the Student's t-test in an one-way analysis of variance.
- 각 측정군의 평균과 표준편차를 산출 하고 분산분석 후 유의차가 있는 경우 Duncan의 다중범위 검정으로 P<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
- 모든 실험은 3회 반복으로 이루어졌으며, 그 결과는 SPSS software(Ver. 12.0K, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 처리하였다. 각 측정군의 평균과 표준편차를 산출 하고 분산분석 후 유의차가 있는 경우 Duncan의 다중범위 검정으로 P<0.
성능/효과
- 본 연구에서는 10종의 갈조류 메탄올 추출물을 이용하여 1,1-diphenyl2-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거능과 아밀로이드 베타 단백질(Aβ)의 신경독성에 대한 HT-22 신경세포 보호효과를 조사함으로써 천연물로부터 안전하고 새로운 신경세포 보호소재를 개발해내고자 한다. DPPH 라디칼 소거능의 경우 미역쇠를 포함한 8종의 갈조류에서는 비교적 낮은 활성산소 소거능을 보인 반면, 감태와 패에서 강력한 활성산소 소거능이 나왔다. Aβ의 신경독성에 대해 10종의 갈조류 추출물이 갖는 HT-22 신경세포 보호효과를 검증하기 위해 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 분석과 APP, BACE1, iNOS 단백질의 발현양상 및 ERK1/2, p38, JNK1/2 단백질의 활성화 양상을 분석했다.
- MTT 분석 결과, Aβ의 신경독성으로부터 미역쇠가 25 μg/mL의 농도에서 가장 효과적으로 세포를 보호하고 있는 것으로 나타났고, 알쏭이모자반, 불레기말, 바위수염, 짝잎모자반도 세포 보호효과가 있는 것으로 나타났다.
- 갈조류 추출물을 50 μg/mL 처리하였을 때 Aβ1-42만을 처리한 군에서는 82.81%의 신경세포 생존율을 보였고 알쏭이모자반은 114.54%, 미역쇠는 113.02%, 불레기말은 105.77 %, 짝잎모자반은 102.53%의 생존율을 보여 Aβ1-42만을 처리한 군에 비해 유의적으로 높은 신경세포 생존율을 보였다.
- 1). 그 결과 대 조군은 83.68%의 DPPH 라디칼 소거능을 보였고 갈조류 중 가장 높은 활성을 보인 것은 감태(Ecklonia cava)로 78.24%로 대조군과 비슷한 결과를 나타내었다. 그리고 갈조류 중 패(Ishige okamurai)는 59.
- 24%로 대조군과 비슷한 결과를 나타내었다. 그리고 갈조류 중 패(Ishige okamurai)는 59.69%의 소거능을 나타내서 감태와 더불어 천연 항산화제로서 가능성을 나타내었으며 나머지 갈조류는 50% 미만의 라디칼 소거능을 나타내서 라디칼 소거능 이외의 생리활성 능력을 탐색해 보는 것이 바람직할 것으로 보였다.
- 따라서 미역쇠 추출물이 아밀로이드 베타전구체 물질의 감소효과와 더불어 신경독성 물질인 Aβ 생성 기전 중 단백질 분해 효소인 BACE1의 활성을 저해함으로써 Aβ 생성을 감소시키는 효과를 보였다(Fig. 2A).
- 배양한 세포에 아밀로이드 베타 단백질(Aβ1-42)을 처리하고 갈조류 추출물을 25 μg/mL 처리하였을 때 Aβ1-42만을 처리한 군에서는 85.88%의 신경세포 생존율을 보였으며 미역쇠(Petalonia binghamiae)에서는 120.34%, 바위수염(Myelophycus simplex)은 116.49%, 불레기말 (Colpomenia sinuosa)은 108.47%, 짝잎모자반(Sargas-sum hemiphyllum) 102.17%로 Aβ1-42만을 처리한 군에 비해 유의적으로 높은 신경세포 생존율을 보였다.
- 본 연구 결과들을 종합해 볼 때, 미역쇠 추출물은 DPPH 소거를 통한 항산화 활성은 낮지만 Aβ의 축적을 야기하는 BACE1 단백질의 발현을 저해함과 동시에 Aβ의 신경독성 으로 인한 MAP kinase 활성화 중 iNOS 활성화와 연관된 ERK와 p38의 활성화를 저해함으로써 HT-22 신경세포에 염증반응이 감소되고 결국 신경세포사멸이 줄어들게 된다.
- MTT 분석 결과, Aβ의 신경독성으로부터 미역쇠가 25 μg/mL의 농도에서 가장 효과적으로 세포를 보호하고 있는 것으로 나타났고, 알쏭이모자반, 불레기말, 바위수염, 짝잎모자반도 세포 보호효과가 있는 것으로 나타났다. 세포 보호효과가 있는 것으로 밝혀진 5종의 갈조류를 가지고 수행한 단백질 발현분석 결과, 미역쇠는 Aβ의 신경 독성에 의해 HT-22 신경세포에서 발현되는 단백질인 BACE1과 iNOS의 발현을 저해하였다. 이는 미역쇠의 세포 보호효과가 Aβ의 신경독성으로부터 일어난 ERK와 p38의 활성화에 연관된 세포신호전달 경로를 억제하는 것으로 보인다.
- 세포생장률 측정분석 결과 알쏭이모자반, 불레기말, 바위수염, 미역쇠, 짝잎모자반이 Aβ의 신경독성에 대해서 세포를 효과적으로 보호하는 것으로 보였고 대조군에 비해 높은 신경세포 생존율을 나타내고 있어 신경세포 생존율의 증가 뿐만 아니라 신경세포의 증식에도 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다.
- 알쏭이모자반(Sargassum confusum)과 감태는 각각 98.12%, 93.39% 로 Aβ1-42만을 처리한 군에 비하여 높은 신경세포 생존율을 보였으나 유의적이지는 않았다.
- 알츠하이머병의 병인으로 알려진 Aβ의 전구 단백질이 APP와 APP로부터 아밀로이드 베타를 생성시키는 단백질 분해효소인 BACE1(β-site APP cleaving enzyme 1)의 단 백질 발현양상을 살펴 본 결과, APP는 대조군에 비해 알쏭 이모자반과, 불레기말, 바위수염을 처리하였을 때 높거나 비슷한 발현양상을 나타냈고, 미역쇠와 짝잎모자반을 처리하 였을때는 대조군보다 낮은 발현양상을 나타내었다.
- 2B). 이 결과로 보아 갈조류 추출물이 세포손상과 염증을 유도시키는 NO의 생성을 유발하는 iNOS 단백질의 발현을 저해하는 효과가 밝혀졌다. 청각(Codium fragile) 추출물의 항염증 효과를 살펴 본 연구에서도 RAW264.
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