본 연구는 건강한 성인남자로부터 비스테로이드성 항염증제인 diclofenac약물을 복용 후 26시간 동안 배설된 소변을 채취하여 이 약물의 대사과정과 배설에 대하여 연구를 수행하였다. 소변 중에 diclofenac의 포합대사체를 검출하기 위하여 산가수분해 과정을 수행하였고 이 과정에서 diclofenac과 대사체들은 탈수반응에 의해 락탐환이 형성되어 이들의 극성은 산성에서 염기성으로 전환된다. 그러나 변환된 락탐환은 염기조건에서 수산화이온에 의해 쉽게 분해가 일어나므로 오히려 염기성 조건에서의 추출율이 낮아지는 경향이 있어 적정 추출 조건에 대하여 연구하였다. 미량의 대사체 검출을 위하여 trimethylsilylation (TMS) 유도체 반응을 시킨 후 gas chromatograph-mass spectrometer (GC-MS)를 이용하여 분석하였다. 본 연구를 통해 4개의 대사체를 검출할 수 있었으며, 이들은 모두 산화과정에 의해 약물모핵에 hydroxylation된 화합물이었다. 각 대사체는 질량스펙트럼의 해석과 이전 연구결과의 비교를 통하여 구조가 규명되었으며, 이를 바탕으로 시간에 따른 모 약물과 대사체의 배설율을 조사하였다. 본 실험 결과로부터 diclofenac의 체내 대사 경로를 제안하였다.
본 연구는 건강한 성인남자로부터 비스테로이드성 항염증제인 diclofenac약물을 복용 후 26시간 동안 배설된 소변을 채취하여 이 약물의 대사과정과 배설에 대하여 연구를 수행하였다. 소변 중에 diclofenac의 포합대사체를 검출하기 위하여 산가수분해 과정을 수행하였고 이 과정에서 diclofenac과 대사체들은 탈수반응에 의해 락탐환이 형성되어 이들의 극성은 산성에서 염기성으로 전환된다. 그러나 변환된 락탐환은 염기조건에서 수산화이온에 의해 쉽게 분해가 일어나므로 오히려 염기성 조건에서의 추출율이 낮아지는 경향이 있어 적정 추출 조건에 대하여 연구하였다. 미량의 대사체 검출을 위하여 trimethylsilylation (TMS) 유도체 반응을 시킨 후 gas chromatograph-mass spectrometer (GC-MS)를 이용하여 분석하였다. 본 연구를 통해 4개의 대사체를 검출할 수 있었으며, 이들은 모두 산화과정에 의해 약물모핵에 hydroxylation된 화합물이었다. 각 대사체는 질량스펙트럼의 해석과 이전 연구결과의 비교를 통하여 구조가 규명되었으며, 이를 바탕으로 시간에 따른 모 약물과 대사체의 배설율을 조사하였다. 본 실험 결과로부터 diclofenac의 체내 대사 경로를 제안하였다.
This study has been described the metabolism and excretion in a healthy male urine collected for 26hrs after oral administration of diclofenac. To detect conjugated metabolites of diclofenac, urine sample was acid-hydrolyzed under the conditions of 6M-HCl at over $110^{\circ}C$ for 1hr. D...
This study has been described the metabolism and excretion in a healthy male urine collected for 26hrs after oral administration of diclofenac. To detect conjugated metabolites of diclofenac, urine sample was acid-hydrolyzed under the conditions of 6M-HCl at over $110^{\circ}C$ for 1hr. During the acidic hydrolysis process, diclofenac and its metabolites were converted into their corresponding lactam-ring through dehydration reaction. As results of chemical conversion by means of hydrolysis, the structures of diclofenac and its metabolites were also changed acidic to basic forms. However, lactam-ring was degraded by hydroxyl ion at basic condition. Thus, the extraction rate of dehydrated diclofenac and its metabolites was not favored at basic condition. For the determination of trace amounts of diclofenac and its metabolites in urine, trimethylsilylation (TMS) with MSTFA was applied and followed by analysis with gas chromatograph-mass spectrometer. In this study, four metabolites that are formed by the hydroxylation of parent drug were mainly detected. Each metabolite was tentatively identified by both interpretation of mass spectra and comparison with previously reported results. In addition, time profile of urinary excretion rate for parent drugs and metabolites was studied. Finally, the metabolic pathway of diclofenac was suggested on the basis of the elucidation of its metabolites and excretion profiles.
This study has been described the metabolism and excretion in a healthy male urine collected for 26hrs after oral administration of diclofenac. To detect conjugated metabolites of diclofenac, urine sample was acid-hydrolyzed under the conditions of 6M-HCl at over $110^{\circ}C$ for 1hr. During the acidic hydrolysis process, diclofenac and its metabolites were converted into their corresponding lactam-ring through dehydration reaction. As results of chemical conversion by means of hydrolysis, the structures of diclofenac and its metabolites were also changed acidic to basic forms. However, lactam-ring was degraded by hydroxyl ion at basic condition. Thus, the extraction rate of dehydrated diclofenac and its metabolites was not favored at basic condition. For the determination of trace amounts of diclofenac and its metabolites in urine, trimethylsilylation (TMS) with MSTFA was applied and followed by analysis with gas chromatograph-mass spectrometer. In this study, four metabolites that are formed by the hydroxylation of parent drug were mainly detected. Each metabolite was tentatively identified by both interpretation of mass spectra and comparison with previously reported results. In addition, time profile of urinary excretion rate for parent drugs and metabolites was studied. Finally, the metabolic pathway of diclofenac was suggested on the basis of the elucidation of its metabolites and excretion profiles.
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문제 정의
본 연구에서는 GC-MS를 이용하여 소염 진통제인 diclofenac의 화학적 구조 전환을 통한 소변 중 diclofenace 대사체의 추출 방법 및 조건을 찾아 대사체의 구조를 규명하였고 또한, 분석 결과를 통해 시간대별로 소변 중 diclofenace 대사체들의 배설 양상을 확인하고 시간에 따른 약물의 동태를 살펴보았다.
제안 방법
그러나 최적화된 온도와 pH조건에서 수행되지 않는다면 diclofenace] 락탐 형으로 100% 전환되지 않으므로 diclof&iac의 정확한 정 량 분석하는데 어려움이 있다. 따라서 diclofbnac을락탐형으로 100% 전환시킬 수 있는 온도, pH 조건을 조사하였다.
복용 후 3시간이 지난 다음 채취한 소변 시료를 산 가수분해 수행한 후, 락탐형의 diclofenace]- 그 대사체는 액체-액체 추출법을 통하여 추출한 후 농축하였다. 추출된 diclofenac과 그 대사체들은 TMS 유도체화 반응을 거친 후, GC-MS 스캔모드에서 분석한 TIC는 Fig.
본 연구에서는 Diclofenac을 복용 후 GC-MS를 이용하여 소변 중 약물의 대사체를 분석하였다. 약물 복용 후 26시간까지 받은 소변을 전처 리하여 분석 하기용이 한 형태로 화학적 구조를 전환시키고 이를 분석하여 약물의 대사 양상을 고찰하였다.
본 연구에서도 소변 중 diclofbnac의 동태를 분석할 때 glucuronide 포합대사체를 떼어내기 위해 가수분해할 때, 열과 산을 가해야 하므로 락탐형으로 전환시켜서 분석하는 방법을 택하였다. 그러나 최적화된 온도와 pH조건에서 수행되지 않는다면 diclofenace] 락탐 형으로 100% 전환되지 않으므로 diclof&iac의 정확한 정 량 분석하는데 어려움이 있다.
소변의 채집은 약 복용부터 약 3시간, 5시간 30분, 7시간, 10시간, 14시간, 21시간, 26시간 후에 각각 실시하였다. 채집한 소변시료는 4℃로 냉장 보관하였다.
0 mL/min으로 하였다. 시료 주입은 직접 주입하였으며 GC 주입구 온도는 270℃로 정하였고, 분할(10:1) 주입방법을 사용하였으며, 이온 검출 방법은 스캔 모드를 사용하여 m/z값 50~550 범위를 조사하였다. 컬럼 온도는 10CTC에서 3분간 유지시킨 후 15℃/ min 으로 280℃까지 올리고 5분간 유지 하였다.
앞서 GC/MS 분석을 통하여 소변으로 배설되는 diclofenac의 대사체들의 구조를 규명하였으며, 이를 기반으로 시간에 따라 배출되는 대사체의 양을 조사하여 대사과정을 조사하였다. Dichlorofbnac의 배설 양과 대사체의 함량을 조사하여 체내에서 대사과정을 유추할 수 있다.
소변 중 약물의 대사체를 분석하였다. 약물 복용 후 26시간까지 받은 소변을 전처 리하여 분석 하기용이 한 형태로 화학적 구조를 전환시키고 이를 분석하여 약물의 대사 양상을 고찰하였다. 또한 TMS 유도 체화 반응을 통하여 GC-MS로 극미량의 대사 물질을 분석해 낼 수 있었으며, 일부 조각이온들은 대사체 확인에 매우 유용한 진단이온으로 사용될 수 있었다.
Dichlorofbnac의 배설 양과 대사체의 함량을 조사하여 체내에서 대사과정을 유추할 수 있다. 이들 약물의 대사체 표준품의 확보가 어려워 대사약물의 정확한 양을 측정할 수 없어 시간에 따른 각 대사체의 상대적인 양을 측정하여 누적 배설 양상에 대하여 조사하였다. Dichlorfenac 및 그 대사체들의 시간에 따른 누적배설 양상 그래프를 Fig.
본 실험을 통하여 6 M-HCl 을 2 mL 가한 후 1시간 동안의 110℃ 이상의 열로 처리하는 것이 아미노산형의 diclofenac을 락탐 형으로 전환하는데 일반적인 포합대사체를 떼어내기 위한 산 가수분해 반응조건보다 더 효과적인 것을 확인하였다. 이와 동시에 락탐형의 diclofenac 질량 분석스펙트럼과 머무름 시간(RT)을 조사하였다.
층이 나눠지면 EA층을 추출하여 둥근 플라스크에 옮겨 담고 다시 분별 깔때기에 에틸 아세테이트 7 mL를 가하여 이와 같은 과정을 두 번 반복하였다. 추출된 EA층의 잔류물을 분석하였다.
대상 데이터
Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다. 내부표준물질인 phenanthrene-dioe Cambridge Isotope Laboratories, Inc. (Andover, MA, USA)로부터 구입 하였다.
시료의 분석을 위하여 사용한 GC-MS는 6890N gas chromatograph/5973 mass selective detector로 Agilent Technologies사(Palo Alto, CA, USA) 제품이었으며, 컬럼은 J&W Scientific사(Folsom, CA, USA)의 DB5-MS (cross-linked 5% phenylmethylsilicon, 30 m length x0.2 mm I.D., 0.25 film thickness)를 사용하였다. 운반기체로 순도 99.
제공되었다. 시료의 전처리 과정 중포합 대사체를 가수분해하기 위해 사용한 염산 용액은 Merck사(Darmstadt, Germany)의 제품이었다. 액체액체 추출과정 및 유도체 반응에서 사용한 에틸 아세테이트 용매는 J.
시료의 전처리 과정 중포합 대사체를 가수분해하기 위해 사용한 염산 용액은 Merck사(Darmstadt, Germany)의 제품이었다. 액체액체 추출과정 및 유도체 반응에서 사용한 에틸 아세테이트 용매는 J.T. Baker사ePhillipsburg, NJ, USA)로부터 구입 하였고, pH의 조절을 위해 phosphoric acid (pH 6, 12)는 Mako사(Osaka, Japan)로부터, boric acid (pH 9)는 Junsei사(Tokyo, Japan)로부터 구입하여 완충용액 제조에 사용하였다. 추출액의 수분 제거를 위해 사용한 무수 Na2SO4^ Junsei사(Tokyo, Japan)의 제품을 사용하였다.
약물을 복용한 피험자는 건강한 성인 남성(나이 : 23 세, 체중: 65 kg)으로 diclofenace 1회 복용시킨 후 26시간 동안 총 7회에 걸쳐 소변을 채취하였다. 소변의 채집은 약 복용부터 약 3시간, 5시간 30분, 7시간, 10시간, 14시간, 21시간, 26시간 후에 각각 실시하였다.
25 film thickness)를 사용하였다. 운반기체로 순도 99.999%의 헬륨가스를 사용하였고, 유속은 1.0 mL/min으로 하였다. 시료 주입은 직접 주입하였으며 GC 주입구 온도는 270℃로 정하였고, 분할(10:1) 주입방법을 사용하였으며, 이온 검출 방법은 스캔 모드를 사용하여 m/z값 50~550 범위를 조사하였다.
추출액의 수분 제거를 위해 사용한 무수 Na2SO4^ Junsei사(Tokyo, Japan)의 제품을 사용하였다. 유도체 반응을 위한 Mmethyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide (MSTFA)는 Sigma-Aldrich 사(St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다. 내부표준물질인 phenanthrene-dioe Cambridge Isotope Laboratories, Inc.
Baker사ePhillipsburg, NJ, USA)로부터 구입 하였고, pH의 조절을 위해 phosphoric acid (pH 6, 12)는 Mako사(Osaka, Japan)로부터, boric acid (pH 9)는 Junsei사(Tokyo, Japan)로부터 구입하여 완충용액 제조에 사용하였다. 추출액의 수분 제거를 위해 사용한 무수 Na2SO4^ Junsei사(Tokyo, Japan)의 제품을 사용하였다. 유도체 반응을 위한 Mmethyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide (MSTFA)는 Sigma-Aldrich 사(St.
성능/효과
하지만 변환된 락탐형의 diclofenac 은 염기성조건에서는 OH」이온에 의해 락탐환이 깨어져 원래의 아미노산 형태로 되는 경향이 있다.14 따라서 oxindole 구조로 인하여 높은 pKa값을 갖는 락탐 형의 diclofbnac의 추출율은 오히려 pH 10 이상에서는 급격히 감소하였으며, pH 3, 6 및 9 조건에서는 pH가 증가할수록 서서히 추출율이 감소하는 것으로 나타났다(Fig 4). 추출율을 조사한 결과 소변 시료에 있어서 pH 3 조건에서 추출율이 가장 높은 것으로 나타났으나, 실제 GC/MS 분석 시 방해물질의 영향이 매우 크기 때문에 추출조건을 pH 6으로 맞추었다.
약물 복용 후 26시간까지 받은 소변을 전처 리하여 분석 하기용이 한 형태로 화학적 구조를 전환시키고 이를 분석하여 약물의 대사 양상을 고찰하였다. 또한 TMS 유도 체화 반응을 통하여 GC-MS로 극미량의 대사 물질을 분석해 낼 수 있었으며, 일부 조각이온들은 대사체 확인에 매우 유용한 진단이온으로 사용될 수 있었다.
이외에도 TMS유도체의 특성 피이크인 [M-15]+ 이온 및 탈염소화가 일어난 [M-C1]+ 이온이 각각 m/z 334 및 314에서 나타났다. 또한, heterocyclic의 질소원자와 a-위치의 탄소 원자 사이의 결합은 aromatic ring의 공명 효과로 인하여 양이온이 안정화된 조각 이온은 m/z 190 에서 비교적 강한 세기로 나타났다. Fig.
3(B)는락탐형만이 분석됨을 볼 수 있다. 본 실험을 통하여 6 M-HCl 을 2 mL 가한 후 1시간 동안의 110℃ 이상의 열로 처리하는 것이 아미노산형의 diclofenac을 락탐 형으로 전환하는데 일반적인 포합대사체를 떼어내기 위한 산 가수분해 반응조건보다 더 효과적인 것을 확인하였다. 이와 동시에 락탐형의 diclofenac 질량 분석스펙트럼과 머무름 시간(RT)을 조사하였다.
14 따라서 oxindole 구조로 인하여 높은 pKa값을 갖는 락탐 형의 diclofbnac의 추출율은 오히려 pH 10 이상에서는 급격히 감소하였으며, pH 3, 6 및 9 조건에서는 pH가 증가할수록 서서히 추출율이 감소하는 것으로 나타났다(Fig 4). 추출율을 조사한 결과 소변 시료에 있어서 pH 3 조건에서 추출율이 가장 높은 것으로 나타났으나, 실제 GC/MS 분석 시 방해물질의 영향이 매우 크기 때문에 추출조건을 pH 6으로 맞추었다.
후속연구
대한 정 량분석에 어려움을 주었지만 diclofenac의 분석 시 전환되는 구조적인 문제로 인한 정량적인 문제점은 본 실험에서 제시한 전환 조건 및 pH 조건 등을 통하여 해결하는 데에 도움을 줄 것으로 기대된다.
본 실험을 통하여 GC-MS를 이용한 체내 약물 대사체의 분석은 각 대사체의 약효를 탐색하거나 안전성을 증명하는데 이용될 수 있으며, 약물의 체내 동태를 밝힘으로써 복용 약물을 확인하고 복용시간과 용량을 결정하여 약물동력학의 활용에 도움이 될 수 있을 것으로 판단된다.
참고문헌 (18)
L. L. Brunton, J. S. Lazo and K. L. Parker, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, 2006
의약화학, 의약화학 편집위원회, p. 85-106, 신일상사, 2004
T. Hirai, S. Matsumoto and I. Kishi, J. Chromatogr. B, 692, 375(1997)
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