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문제 정의
- 그러나, 인체 및 동물에서 ibuprofen의 대사화 연구는 특이적인 부분에 대하여 제한적으로 진행되었으며, 또한 극미량의 다양한 대사체의 검출에 있어서 한계를 가지고 있었기에 본 연구에서 이들 모핵약물과 대사체를 동시분석할 수 있는 분석법에 대하여 연구하였다. 특히 산성약물과 그의 대사체의 추출에 있어서 효율적인 역추출방법을 도입하였으며, 극미량의 대사체를 검출하기 위하여 화학유도체화 방법을 도입하였다.
제안 방법
- 0시간에서 15시간의 시료를 각각 산 가수분해한 후 액체-액체 추출법을 통하여 추출한 후 농축하였다. 추출된 ibuprofen과 그 대사체들은 TMS 유도체화 반응을 거친 후, GC-MS 스캔모드로 분석한 total ion chromatogram (TIC)은 Fig.
- 최근에는 소변시료에서 ibuprofen의 광학 선택성을 가진 주 대사체를 solid-phase microextraction(SPME) 방법으로 추출하고 키랄컬럼이 장착된 HPLC로 분석하는 연구가 수행되었다.7,8 또한 쥐와 닭 혈청에서 ibuprofen 광학 특이성에 대한 연구를 HPLC로 수행하여, ibuprofen과 hydroxylated 대사체의 광학이 성질체의 분리를 수행되었다.9,10 이들 광학이성질체의 분리연구를 통하여 생체내의 대사효소와의 반응성을 규명하는데 활용되었다.
- 그러나 극단적인 액성 영역인 pH 2이하에서는 오히려 ibuprofen과 대사체의 추출률이 감소하는 경향을 나타냈다. 따라서 본 연구에서는 모약물과 대사체의 추출조건을 pH 3으로 설정하였다.
- 본 연구에서는 GC-MS를 이용하여 소염 진통제인 ibuprofen의 소변 중 ibuprofen과 그 대사체의 추출 조건을 조사하였으며, GC-MS에 의해 검출된 대사체의 질량분석스펙트럼을 해석하여 각 대사체의 구조를 규명하였다. 또한, 분석 결과를 통해 시간대별로 소변 중 ibuprofen과 대사체들의 배설 양상을 확인하고 시간에 따른 약물의 동태를 알아보았다.
- 방냉 후 내부표준물질로 phenanthrene-d10 10µL을 가하고 흔들어 준 후 용액 중 1 µL를 GC/MS에 주입하여 분석하였다.
- 3에 실었다. 본 연구에서 소변 중 모약물과 대사체들의 포합체와 비포합체(유리형)의 함량을 비교하기 위하여, 산 가수분해과정을 거친 시료(Fig. 3-A)와 산 가수분해 과정을 통하지 않은 시료(Fig. 3-B)의 분석결과를 비교 검토하였다. 대표적으로 복용 3시간 후의 소변시료에서, 이들 모두에서 유도체화된 ibuprofen과 주요 대사체 4종류가 검출되었다.
- 본 연구에서는 GC-MS를 이용하여 소염 진통제인 ibuprofen의 소변 중 ibuprofen과 그 대사체의 추출 조건을 조사하였으며, GC-MS에 의해 검출된 대사체의 질량분석스펙트럼을 해석하여 각 대사체의 구조를 규명하였다. 또한, 분석 결과를 통해 시간대별로 소변 중 ibuprofen과 대사체들의 배설 양상을 확인하고 시간에 따른 약물의 동태를 알아보았다.
- 본 연구에서는 ibuprofen을 복용 후 소변 중 약물의 대사체를 GC-MS로 분석하였다. 약물 복용 후 0시간부터 15시간까지 받은 소변으로 모약물의 대사양상을 유추하였다.
- 본 연구에서는 뇨시료의 산 가수분해 후 10MNaOH를 첨가하여 pH 12이상으로 조절한 후 에틸아세테이트로 추출 후 폐기하였다. 이 과정을 통하여 소변 내 염기성을 가진 방해물질들은 대부분 제거되었다.
- 약물을 복용한 피험자는 건강한 성인 남성(25세, 75 kg)으로 ibuprofen 200 mg을 1회 복용한 후 15시간동안 총 6회에 걸쳐 소변을 채취하였다. 소변의 채집은 약 복용부터 약 0시간, 3시간, 6시간, 9시간, 12시간, 15시간 후에 각각 실시하였고 채집한 소변시료는 4 ℃로 냉장 보관하였다. 분석을 위한 시료 전 처리 방법은 Fig.
- 수용액 중 ibuprofen의 추출 최적 조건을 찾기 위하여 시료 3 mL에 pH 3, 5, 8으로 각각 조절한 후 추출률을 비교하였다(Fig. 2). Ibuprofen의 화학적 구조를 살펴보면 1개의 카르복실기를 가지고 있으며 이의 pKa는 대략 4.
- GC와 MS의 연결 인터페이스 온도는 270 ℃로 정하였으며, 이온원의 온도는 200 ℃로 설정하였다. 시료 이온화는 전자충돌(electron impact)법으로 사용한 에너지는 70 eV으로 정하였고, 질량분석관으로는 사중극자로 구성되었으며 질량분석은 50~550 amu의 범위를 스캔모드로 조사하였다.
- 0 mL/min으로 조절하였다. 시료 주입은 직접 주입하였으며 GC 주입구 온도는 270 ℃로 정하였고, 분할(10:1) 주입방법을 사용하였다. 컬럼 온도는 100 ℃에서 3분간 유지시킨 후 15 ℃/min 으로 205 ℃까지 올리고 5 ℃/min으로 235 ℃까지 올린 후 280 ℃까지 다시 15 ℃/min으로 올리고 5분간 유지하였다.
- 앞서 GC/MS 분석을 통하여 소변으로 배설되는 ibuprofen의 대사체들의 구조를 규명하였으며, 이를 기반으로 시간에 따라 배출되는 대사체의 양을 조사하여 대사과정을 조사하였다. Ibuprofen의 배설양과 대사체의 함량을 조사하여 체내에서 대사과정을 유추할 수 있다.
- 본 연구에서는 ibuprofen을 복용 후 소변 중 약물의 대사체를 GC-MS로 분석하였다. 약물 복용 후 0시간부터 15시간까지 받은 소변으로 모약물의 대사양상을 유추하였다. 소변 중 산성인 약물과 대사체를 역추출 방법을 사용하여 효과적으로 방해물질의 제거와 대상 약물 및 대사체를 성공적으로 추출할 수 있었다.
- 대사체와 모핵약물을 추출하기 위하여 acetate buffer로 pH 3으로 맞춘 후 에틸아세테이트 5 mL를 넣고 15분 흔들어 주었다. 원심분리과정을 통하여 층분리하고 유기층을 취하는 과정을 2회 반복하였다. 추출된 유기층은 Na2SO4를 이용하여 수분을 제거하고 회전식감압건조기를 사용해 감압농축 하였다.
- Ibuprofen의 배설양과 대사체의 함량을 조사하여 체내에서 대사과정을 유추할 수 있다. 이들 약물의 대사체 표준품의 확보가 어려워 대사약물의 정확한 양을 측정할 수 없어 시간에 따른 각 대사체의 상대적인 양을 측정하여 누적배설 양상에 대하여 조사하였다. 또한 대사체 표준품의 미확보에 따른 또 다른 문제점은 GC/MS 분석에서 각 화합물의 절대 감응도 (response factor)를 조사 할 수 없는 점에 있다.
- 7또한 미량대사체인 1-hydroxyibuprofen과 3-hydroxyibuprofen은 이 과정을 거의 거치지 않는다는 다고 보고하였다. 이에 대한 연구를 검토하기 위하여 약물복용 후 포합대사체와 비포합대사체의 양을 조사하였으며[Fig. 3-A and B 참조] 이들의 결과는 3회 반복측정 하여 Table 2에 정리하였다. 그러나 Table 2에서 보듯이, 모약물의 경우 포합대사체의 양은 약 27% 정도로 나타났으며, hydroxylation 대사체인 1-, 2-, 및 3- hydroxyibuprofen의 포합체의 양은 각각 84, 91 및 46%로 나타났다.
- 원심분리과정을 통하여 층분리하고 유기층을 취하는 과정을 2회 반복하였다. 추출된 유기층은 Na2SO4를 이용하여 수분을 제거하고 회전식감압건조기를 사용해 감압농축 하였다. 농축된 추출액은 유도체화 반응 바이알로 취하여 질소농축 하였다.
- 그러나, 인체 및 동물에서 ibuprofen의 대사화 연구는 특이적인 부분에 대하여 제한적으로 진행되었으며, 또한 극미량의 다양한 대사체의 검출에 있어서 한계를 가지고 있었기에 본 연구에서 이들 모핵약물과 대사체를 동시분석할 수 있는 분석법에 대하여 연구하였다. 특히 산성약물과 그의 대사체의 추출에 있어서 효율적인 역추출방법을 도입하였으며, 극미량의 대사체를 검출하기 위하여 화학유도체화 방법을 도입하였다. 화학유도체방법11은 GC 크로마토그래피 분석에 있어서 비휘발성 물질에 대한 휘발성과 열적안정성을 높일 수 있으며, 피이크 분리능에서도 탁월성을 보여준다.
대상 데이터
- 유도체 반응을 위한 N,O-bis (trimethylsilyl)trifluoroacetamide (BSTFA) 는 SUPELCO사(Bellefonte, PA, USA)의 제품을 사용하였다. 내부표준물질인 phenanthrene-d10은 Cambridge Isotope Laboratories, Inc. (Andover, MA, USA)로부터 구입하였다. Ibuprofen과 내부표준물질은 메탄올과 noctane에 각각 녹여 100 ppm으로 만든 후 냉장 보관하여 필요시 사용하였다.
- 시료의 분석을 위하여 사용한 GC-MS는 6890N gas chromatograph/5973 mass selective detector로 Agilent Technologies사(Palo Alto, CA, USA) 제품이었으며, 컬럼은 J&W Scientific사(Folsom, CA, USA)의 DB5MS (cross-linked 5% phenylmethylsilicon, 30 m length × 0.32 mm I.D., 0.25 µm film thickness)를 사용하였다.
- 7% 이상의 순도를 지닌 백색 가루형태이며, 국내 제약회사로부터 공급받았다. 시료의 전처리 과정 중 포합 대사체를 가수분해하기 위해 사용한 염산 용액은 Merck사(Darmstadt, Germany)의 제품이었다. 액체-액체추출법(liquid-liquid extraction) 및 유도체 반응에서 사용한 에틸 아세테이트 용매는 J.
- 시료의 전처리 과정 중 포합 대사체를 가수분해하기 위해 사용한 염산 용액은 Merck사(Darmstadt, Germany)의 제품이었다. 액체-액체추출법(liquid-liquid extraction) 및 유도체 반응에서 사용한 에틸 아세테이트 용매는 J.T. Baker사(Phillipsburg, NJ, USA)로부터 구입하였고 pH의 조절을 위해 sodium phosphate monobasic monohydate와 sodium phosphate dibasic heptahydrate는 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)의 제품을, NaOH와 초산은 Ducksan Chemical(Gyeonggi, Korea)의 제품을 사용하였다. 추출액의 수분 제거를 위해 사용한 무수 Na2SO4는 Junsei사(Tokyo, Japan)의 제품을 사용하였다.
- 약물을 복용한 피험자는 건강한 성인 남성(25세, 75 kg)으로 ibuprofen 200 mg을 1회 복용한 후 15시간동안 총 6회에 걸쳐 소변을 채취하였다. 소변의 채집은 약 복용부터 약 0시간, 3시간, 6시간, 9시간, 12시간, 15시간 후에 각각 실시하였고 채집한 소변시료는 4 ℃로 냉장 보관하였다.
- 25 µm film thickness)를 사용하였다. 운반기체로 순도 99.999%의 헬륨가스를 사용하였고, 유속은 1.0 mL/min으로 조절하였다. 시료 주입은 직접 주입하였으며 GC 주입구 온도는 270 ℃로 정하였고, 분할(10:1) 주입방법을 사용하였다.
- 추출액의 수분 제거를 위해 사용한 무수 Na2SO4는 Junsei사(Tokyo, Japan)의 제품을 사용하였다. 유도체 반응을 위한 N,O-bis (trimethylsilyl)trifluoroacetamide (BSTFA) 는 SUPELCO사(Bellefonte, PA, USA)의 제품을 사용하였다. 내부표준물질인 phenanthrene-d10은 Cambridge Isotope Laboratories, Inc.
- Louis, MO, USA)의 제품을, NaOH와 초산은 Ducksan Chemical(Gyeonggi, Korea)의 제품을 사용하였다. 추출액의 수분 제거를 위해 사용한 무수 Na2SO4는 Junsei사(Tokyo, Japan)의 제품을 사용하였다. 유도체 반응을 위한 N,O-bis (trimethylsilyl)trifluoroacetamide (BSTFA) 는 SUPELCO사(Bellefonte, PA, USA)의 제품을 사용하였다.
- 피험자가 복용한 ibuprofen 표준품은 99.7% 이상의 순도를 지닌 백색 가루형태이며, 국내 제약회사로부터 공급받았다. 시료의 전처리 과정 중 포합 대사체를 가수분해하기 위해 사용한 염산 용액은 Merck사(Darmstadt, Germany)의 제품이었다.
이론/모형
- 극 미량의 대사체의 검출을 위하여 TMS 유도체화 방법을 적용하였다. 유도체화반응은 건조된 추출물에 무수 에틸아세테이트 80 µL을 넣은 후 TMS 유도체 시약인 BSTFA 10 µL을 넣고 80 ℃에서 20분간 가열하였다.
- 일반적으로 소변에서 약물과 대사체의 분석을 위해서는 요소(urea)와 같은 불순물들을 제거하는 과정과제 2상 대사 과정에서 생성되는 포합체를 떼어내는 가수분해 과정이 필요하다. 일반적으로 포합대사체를 검출하기 위해서는 효소 가수분해법(enzymatic hydrolysis)이나 산가수분해법(acid hydrolysis)이 널리 사용되고 있으나, 본 연구에서는 극산성 조건에서도 모핵 및 대사체의 분해가 일어나지 않는 산 가수분해방법을 적용하였다. 산 가수분해과정을 거치지 않았을 경우, 모핵약물과 산화된 대사체의 양은 전체적으로 크게 감소하는 것으로 나타났다.
성능/효과
- 본 연구에서 사용되었던 산-가수분해 과정은 기존 연구에서 보고되었던 염기-가수분해 결과보다 더 많은 포합대사체의 함량을 얻을 수 있었다. 그러나 본 연구에서 대사체들의 표준품의 확보가 어려워 정확한 정량분석이 어려운 점이 있으나, 대사체 배설 경향성을 보다 정확하게 예상할 수 있었다.
- 소변 중 산성인 약물과 대사체를 역추출 방법을 사용하여 효과적으로 방해물질의 제거와 대상 약물 및 대사체를 성공적으로 추출할 수 있었다. 또한 TMS 유도체화 반응을 통하여 GC-MS로 극미량의 대사 물질을 분석해 낼 수 있었으며, 일부 조각이온들은 대사체 확인에 매우 유용한 진단이온으로 사용될 수 있었다. 본 연구에서 사용되었던 산-가수분해 과정은 기존 연구에서 보고되었던 염기-가수분해 결과보다 더 많은 포합대사체의 함량을 얻을 수 있었다.
- 또한 TMS 유도체화 반응을 통하여 GC-MS로 극미량의 대사 물질을 분석해 낼 수 있었으며, 일부 조각이온들은 대사체 확인에 매우 유용한 진단이온으로 사용될 수 있었다. 본 연구에서 사용되었던 산-가수분해 과정은 기존 연구에서 보고되었던 염기-가수분해 결과보다 더 많은 포합대사체의 함량을 얻을 수 있었다. 그러나 본 연구에서 대사체들의 표준품의 확보가 어려워 정확한 정량분석이 어려운 점이 있으나, 대사체 배설 경향성을 보다 정확하게 예상할 수 있었다.
- 일반적으로 포합대사체를 검출하기 위해서는 효소 가수분해법(enzymatic hydrolysis)이나 산가수분해법(acid hydrolysis)이 널리 사용되고 있으나, 본 연구에서는 극산성 조건에서도 모핵 및 대사체의 분해가 일어나지 않는 산 가수분해방법을 적용하였다. 산 가수분해과정을 거치지 않았을 경우, 모핵약물과 산화된 대사체의 양은 전체적으로 크게 감소하는 것으로 나타났다. 이는 ibuprofen 모핵약물과 대사체는 제 2상 대사과정이 상당히 일어나는 것으로 보이며, 기존에 발표된 연구에서는 모핵 약물의 58%가 포합대사체로 보고되었다.
- 약물 복용 후 0시간부터 15시간까지 받은 소변으로 모약물의 대사양상을 유추하였다. 소변 중 산성인 약물과 대사체를 역추출 방법을 사용하여 효과적으로 방해물질의 제거와 대상 약물 및 대사체를 성공적으로 추출할 수 있었다. 또한 TMS 유도체화 반응을 통하여 GC-MS로 극미량의 대사 물질을 분석해 낼 수 있었으며, 일부 조각이온들은 대사체 확인에 매우 유용한 진단이온으로 사용될 수 있었다.
후속연구
- 본 실험을 통하여 GC-MS를 이용한 체내 약물 대사체의 분석은 각 대사체의 약효를 탐색하거나 안전성을 증명하는데 이용될 수 있으며, 약물의 체내 동태를 밝힘으로써 복용 약물을 확인하고 복용시간과 용량을 결정하여 약물동력학의 활용에 도움이 될 수 있을 것으로 판단된다. 특히 본 논문에서 제시한 pH 3에서 약물과 대사체의 추출율을 높일 수 있을 것이며 시간대별 추출율과 누적율을 임상에 적용함으로서 환자의 체내의 농도 변화, 분포, 배설 등을 예측하는데 도움을 줄 것으로 기대된다.
- 본 실험을 통하여 GC-MS를 이용한 체내 약물 대사체의 분석은 각 대사체의 약효를 탐색하거나 안전성을 증명하는데 이용될 수 있으며, 약물의 체내 동태를 밝힘으로써 복용 약물을 확인하고 복용시간과 용량을 결정하여 약물동력학의 활용에 도움이 될 수 있을 것으로 판단된다. 특히 본 논문에서 제시한 pH 3에서 약물과 대사체의 추출율을 높일 수 있을 것이며 시간대별 추출율과 누적율을 임상에 적용함으로서 환자의 체내의 농도 변화, 분포, 배설 등을 예측하는데 도움을 줄 것으로 기대된다.
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