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문제 정의
- SQS 저해제는 HMG-CoA 환원효소 저해제와는 달리 이러한 다른 이소프레노이드 합성에는 영향을 주지 않으면서 콜레스테롤 합성을 저해할 수 있을 것으로 예상되기 때문에 현재 치료제로 개발되어 있는 HMG-CoA 환원효소 저해제에 비해 부작용이 적을 것으로 기대된다[21,24]. 본 연구에서는 32종의 천연물로부터 동물조직에 존재하는 squalene synthase에 대한 저해 활성을 나타내는 저해물질을 탐색한 결과, 녹차 추출물에서 비교적 저해 활성이 높고 재현성이 있게 저해효과를 나타내는 것을 확인하였으며 녹차로부터 squalene synthase 저해 효과를 나타내는 활성물질을 분리하여 저해물질의 특성에 대하여 알아보고자 하였다.
- 지금까지의 콜레스테롤 생합성 저해물질은 미생물의 대사산물이나 합성에 의하여 개발된 것으로 본 연구에서는 천연물을 대상으로 그 효능을 검색하고자 하였다. SQS 저해 활성을 검색하기 위하여 동물, 식물, 버섯, 미생물, 식품소재와 같은 다양한 천연물을 수집하였다.
- 특히 주목할만한 것은 식품소재에 의한 높은 저해효과가 관찰되었으므로 식품소재를 이용하여 심혈관질환을 예방할 수 있다면 비용이나 안전성 측면에서 효과적이기 때문에 그 의의가 크다고 할 수 있다. 최종적으로 저해활성이 가장 높고 저해 효과의 재현성을 나타내는 녹차를 선발하여 squalene synthase에 대한 저해기전을 조사하고자 하였다.
제안 방법
- 조사하였다. (+)-Catechin, (-)-epicatechin, (-)-epi- catechin gallate, (-)-epigallocatechin, (-)-epigallocatechin gallate 등 catechin 표준용액의 농도에 따른 squalene synthase 저해작용을 조사하였다. 그 결과, Table 2에 나타난 바와 같이 (-)-epigallocatechin gallate, (-)-epicatechin gallate, (-)-epigallocatechin, (-)-epicatechin, (+)-catechin의 순으로 저해 활성이 강한 것으로 나타났다.
- 92 mg protein/ml) 50 ㎕를 혼합하여 37℃에서 10분간 방치시킨 후 125 µM [3H]famesyl pyrophosphate 10 ㎕의 기질을 첨가하여 37℃에서 다시 30분간 반응시켰다. 200 ㎕의 냉각한 ethanol을 첨가하여 반응을 정지시키고 n-hexane으로 3회 추출하여 얻은 hexane 층과 5 ml의 cocktail solution을 혼합하여 LSC를 이용하여 cpm을 측정함으로써 저해 정도를 측정하였다.
- 녹차 열수추출물을 10 ml씩 취하여 동량의 hexane, chloroform, ethyl acetate, 1-butanol을 가하여 1시간 간격으로 3회에 걸쳐 반복 추출한 후 유기용매 층을 분리, 감압 농축하고 저해활성을 측정하여 SQS 저해물질의 용매 이행성을 검토하였다. 녹차 추출물로부터 crude catechin을 분리하기 위하여, 녹차 열수추출물 100 ml에 chloroform 100 ml를 첨가하여 caffein 및 지질, 색소 등을 제거한 뒤 수층을 얻었다.
- 녹차 추출물로부터 crude catechin을 분리하기 위하여, 녹차 열수추출물 100 ml에 chloroform 100 ml를 첨가하여 caffein 및 지질, 색소 등을 제거한 뒤 수층을 얻었다. 여기서 얻은 수층에 동량의 ethyl acetate를 가하여 3회 추출하였고 진탕추출 시 처음에는 매우 천천히 진탕하여 emulsion이 생기지 않도록 한 다음 강하게 진탕하였으며, 적당량의 NaCl을 가하여 층의 분리를 원활하게 하였다.
- Ethyl acetate 보다는 1-butanol에서의 추출율이 더 높았지만 butanol 층의 경우, 추출물의 농축이 어렵고 또한 1-butanol 층으로 여러가지 화합물이 함께 추출되는 단점이 있기 때문에 수율에서는 약간 차이가 있지만 비점이 낮아 농축 및 분리를 하는데 장점이 있는 ethyl acetate를 이용하여 추출하는 것이 유리할 것으로 판단되었다. 녹차 추출물의 유기용매 주출에 따른 squalene synthase 저해물질의 특성이 crude catechin의 추출 및 분리 방법과 유사하여, Fig. 1의 방법에 따라 녹차 추출물로부터 crude catechin 분획을 얻었다. 녹차 추출물로부터 chloroform으로 추출하여 caffeine 성분을 제거한 후, ethyl acetate를 이용하여 crude catechins 분획을 얻어 squalene synthase 저해활성을 검토한 결과, 72.
- 녹차의 주요한 생리활성 성분인 catechins 분획에서 SQS 저해활성을 나타냈으므로 catechin 표준품을 이용하여 SQS 저해활성을 조사하였다. (+)-Catechin, (-)-epicatechin, (-)-epi- catechin gallate, (-)-epigallocatechin, (-)-epigallocatechin gallate 등 catechin 표준용액의 농도에 따른 squalene synthase 저해작용을 조사하였다.
- 돼지 간 100 g을 잘게 썰어서 충분히 다지고 200 ml의 균질화 완충액(0.1 M potassium phosphate, pH 7.4 / 0.3 M sucrose / 5 mM DTT / 10 mM MgCl2 / 50 mM KCl)을 첨가한 다음 균질화하였다. 4,000x g에서 15분간 원심분리를 한 다음 상등액을 취하고 다시 15,000x g에서 30분간 원심분리를 하였다.
- 용매추출에서는 10배 용량의 80% 수용성 methanol을 이용하여 상온에서 3시간 동안 3회 추출하고 원심분리한 뒤 상등액을 회수하여 감압농축하였다. 또한 열수추출법은 증류수를 이용하여 80℃에서 위와 같은 방법으로 추출하였다. 추출액은 동결건조기에서 건조하고 methanol에 녹인 후 여기에 물을 첨가하여 추출물의 최종농도는 100 µg/10 ㎕가 되게 하였다.
- 다시 상등액을 취해 105,000x g에서 1시간 초원심분리하여 microsome 분획을 얻었다. 세척을 위해 50 ml의 균질화 완충액을 첨가하여 침전물을 균질화시키고 105,000x g에서 30분간 초원심분리하여 침전된 microsome 분획을 균질화 완충액에 현탁시켜 squalene synthase 활성 측정을 위한 효소원으로 사용하였다.
- SQS 저해 활성을 검색하기 위하여 동물, 식물, 버섯, 미생물, 식품소재와 같은 다양한 천연물을 수집하였다. 수집된 32종의 천연물을 80% 수용성 methanol 또는 물로 주출하여 콜레스테롤 생합성 억제 작용에 미치는 영향을 알아보기 위하여 SQS 저해 활성을 측정하였다. 일반적으로 탐색 과정에서는 실험 시료의 어떤 특정 성분을 목적으로 할 것인지 정해져 있지 않기 때문에 여러가지 화합물에 대한 추출능이 크고 추출조작이 용이한 물 혹은 메탄올을 자주 이용하고 있다.
- 시료의 준비는 용매추출법과 열수추출법을 병행하였다. 용매추출에서는 10배 용량의 80% 수용성 methanol을 이용하여 상온에서 3시간 동안 3회 추출하고 원심분리한 뒤 상등액을 회수하여 감압농축하였다.
- 녹차 추출물로부터 crude catechin을 분리하기 위하여, 녹차 열수추출물 100 ml에 chloroform 100 ml를 첨가하여 caffein 및 지질, 색소 등을 제거한 뒤 수층을 얻었다. 여기서 얻은 수층에 동량의 ethyl acetate를 가하여 3회 추출하였고 진탕추출 시 처음에는 매우 천천히 진탕하여 emulsion이 생기지 않도록 한 다음 강하게 진탕하였으며, 적당량의 NaCl을 가하여 층의 분리를 원활하게 하였다. Ethyl acetate 층은 sodium sulfate로 탈수시키고 여과한 다음 감압 농축하여 crude catechins 분획을 얻었다(Fig.
- 일반적으로 탐색 과정에서는 실험 시료의 어떤 특정 성분을 목적으로 할 것인지 정해져 있지 않기 때문에 여러가지 화합물에 대한 추출능이 크고 추출조작이 용이한 물 혹은 메탄올을 자주 이용하고 있다. 예비실험을 통하여 물 또는 80% 수용성 methanol 등의 2가지 추출용매를 사용하여 비교해 본 결과(data not shown), 추출용매에 따른 수율의 차이는 크게 나타나지 않아 본 실험에서는 열수추출 방법을 이용하여 추출하였다. Table 1에서와 같이 천연물을 열수로 추출하여 얻은 추출물을 이용하여 SQS에 대한 저해활성을 조사한 결과, 크게 저해율 25% 이하, 저해율 25~50%, 저해율 50~75%, 저해율 75% 이상으로 분류할 수 있었다.
- 이때 methanol 농도가 높으면 enzyme assay에 영향을 주고 낮으면 잘 녹지 않아 20% methanol 용액이 되도록 조제하였다. 천연물을 처리하여 얻은 시료를 squalene synthase 효소활성 측정을 위한 반응액에 첨가한 것과 시료를 넣지 않은 반응액의 cpm값 차이를 측정하여 효소활성의 저해 정도를 판단하였다.
대상 데이터
- 대상으로 그 효능을 검색하고자 하였다. SQS 저해 활성을 검색하기 위하여 동물, 식물, 버섯, 미생물, 식품소재와 같은 다양한 천연물을 수집하였다. 수집된 32종의 천연물을 80% 수용성 methanol 또는 물로 주출하여 콜레스테롤 생합성 억제 작용에 미치는 영향을 알아보기 위하여 SQS 저해 활성을 측정하였다.
- 녹차 분말은 태평양기술연구원으로부터 공급받은 제품을 사용하였으며, 두부는 (주)풀무원 제품을 사용하였다, 한약재와 식품소재는 경동시장과 기타 재래시장 등에서 구입하여 사용하였으며 (+)-catechin((+)-C), (-)-epicatechin((-)-EC), (-)-epicatechin gallate((-)-ECg), (-)-epigallocatechin((-)- EGC), (-)-epigallocatechin gallate((-)-EGCg) 등은 Sigma- Aldrich(ST Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 동위원소 측정을 위한 liquid scintillation counter(LSC)는 Beckman사의 LS 6500을 사용하였다.
- 동위원소 측정을 위한 liquid scintillation counter(LSC)는 Beckman사의 LS 6500을 사용하였다.
성능/효과
- 7%의 저해율을 나타냈으나 그 이하의 농도에서는 큰 저해효과를 보이지 않았다. (-)-Epigallocatechin을 각 농도별로 처리하여 squalene synthase 저해작용을 살펴본 결과, 500, 1,000 µM에서 각각 53.7, 65.3%의 저해율을 보였으며, (-)-epicatechin gallate과 (-)-epigallocatechin gallate의 경우, 100 µM에서 각각 42.3, 54.7%의 저해활성을 나타내어 비교적 낮은 농도에서도 squalene synthase에 대한 저해작용을 확인할 수 있었다. 또한 가장 강한 squalene synthase 저해활성을 나타내는 (-)- epigallocatechin gallate의 저해 양상을 살펴보기 위하여 (-)- epigallocatechin gallate의 농도를 달리하여 저해활성을 측정한 결과, squalene synthase에 대한 (-)-epigallocatechin gallate 의 IC50 값은 90 µM로 나타났다.
- Table 1에서와 같이 천연물을 열수로 추출하여 얻은 추출물을 이용하여 SQS에 대한 저해활성을 조사한 결과, 크게 저해율 25% 이하, 저해율 25~50%, 저해율 50~75%, 저해율 75% 이상으로 분류할 수 있었다. 32종의 시료 중, 9종이 50% 이상의 저해효과를 나타냈으며 그 중, 녹차, 된장, 울금 추출물이 75% 이상의 높은 저해효과를 나타냈다. 특히 주목할만한 것은 식품소재에 의한 높은 저해효과가 관찰되었으므로 식품소재를 이용하여 심혈관질환을 예방할 수 있다면 비용이나 안전성 측면에서 효과적이기 때문에 그 의의가 크다고 할 수 있다.
- 녹차에 함유되어 있는 squalene synthase에 대한 저해물질의 용매추출성을 검토한 결과 ethyl acetate와 n-butanol 층에 저해물질이 많이 함유되어 있는 것으로 확인되었으며 저해물질은 녹차의 polyphenol 화합물인 catechin에 의한 것으로 추정되었다. Catechin 표준용액의 각 농도에 따른 squalene synthase 저해작용을 살펴본 결과, (-)-epigallocatechin gallate, (-)-epicatechin gallate, (-)-epigallocatechin, (-)-epicatechin, (+)-atechin의 순으로 저해활성이 강한 것으로 나타났으며 가장 강한 저해활성을 나타내는 (-)-epigallocatechin gallate의 IC50값은 90 µM이었다.
- 2). Ethyl acetate 보다는 1-butanol에서의 추출율이 더 높았지만 butanol 층의 경우, 추출물의 농축이 어렵고 또한 1-butanol 층으로 여러가지 화합물이 함께 추출되는 단점이 있기 때문에 수율에서는 약간 차이가 있지만 비점이 낮아 농축 및 분리를 하는데 장점이 있는 ethyl acetate를 이용하여 추출하는 것이 유리할 것으로 판단되었다. 녹차 추출물의 유기용매 주출에 따른 squalene synthase 저해물질의 특성이 crude catechin의 추출 및 분리 방법과 유사하여, Fig.
- 예비실험을 통하여 물 또는 80% 수용성 methanol 등의 2가지 추출용매를 사용하여 비교해 본 결과(data not shown), 추출용매에 따른 수율의 차이는 크게 나타나지 않아 본 실험에서는 열수추출 방법을 이용하여 추출하였다. Table 1에서와 같이 천연물을 열수로 추출하여 얻은 추출물을 이용하여 SQS에 대한 저해활성을 조사한 결과, 크게 저해율 25% 이하, 저해율 25~50%, 저해율 50~75%, 저해율 75% 이상으로 분류할 수 있었다. 32종의 시료 중, 9종이 50% 이상의 저해효과를 나타냈으며 그 중, 녹차, 된장, 울금 추출물이 75% 이상의 높은 저해효과를 나타냈다.
- (+)-Catechin, (-)-epicatechin, (-)-epi- catechin gallate, (-)-epigallocatechin, (-)-epigallocatechin gallate 등 catechin 표준용액의 농도에 따른 squalene synthase 저해작용을 조사하였다. 그 결과, Table 2에 나타난 바와 같이 (-)-epigallocatechin gallate, (-)-epicatechin gallate, (-)-epigallocatechin, (-)-epicatechin, (+)-catechin의 순으로 저해 활성이 강한 것으로 나타났다. (+)-Catechin과 (-)-epicatechin의 경우, 1,000 µM 농도에서 각각 35.
- 녹차 열수추출 시료를 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, Lbutan이을 사용해 각각 3회 반복 추출하여 나온 유기용매 층의 squalene synthase 저해활성을 측정한 결과, n-hexane, chloroform, ethyl acetate, 1-butanol 추출물의 저해 활성은 각각 4.3, 12.3, 71.3, 77.7%를 나타냈으며 특히 ethyl acetate와 butanol 층에서 높은 저해활성을 보였다(Fig. 2). Ethyl acetate 보다는 1-butanol에서의 추출율이 더 높았지만 butanol 층의 경우, 추출물의 농축이 어렵고 또한 1-butanol 층으로 여러가지 화합물이 함께 추출되는 단점이 있기 때문에 수율에서는 약간 차이가 있지만 비점이 낮아 농축 및 분리를 하는데 장점이 있는 ethyl acetate를 이용하여 추출하는 것이 유리할 것으로 판단되었다.
- 었다. 녹차에 함유되어 있는 squalene synthase에 대한 저해물질의 용매추출성을 검토한 결과 ethyl acetate와 n-butanol 층에 저해물질이 많이 함유되어 있는 것으로 확인되었으며 저해물질은 녹차의 polyphenol 화합물인 catechin에 의한 것으로 추정되었다. Catechin 표준용액의 각 농도에 따른 squalene synthase 저해작용을 살펴본 결과, (-)-epigallocatechin gallate, (-)-epicatechin gallate, (-)-epigallocatechin, (-)-epicatechin, (+)-atechin의 순으로 저해활성이 강한 것으로 나타났으며 가장 강한 저해활성을 나타내는 (-)-epigallocatechin gallate의 IC50값은 90 µM이었다.
- 7%의 저해활성을 나타내어 비교적 낮은 농도에서도 squalene synthase에 대한 저해작용을 확인할 수 있었다. 또한 가장 강한 squalene synthase 저해활성을 나타내는 (-)- epigallocatechin gallate의 저해 양상을 살펴보기 위하여 (-)- epigallocatechin gallate의 농도를 달리하여 저해활성을 측정한 결과, squalene synthase에 대한 (-)-epigallocatechin gallate 의 IC50 값은 90 µM로 나타났다. Squalen synthase는 4차 구조를 가지는 효소로서 효소의 IC50 값을 측정할 경우, 4차 구조일 때 S자 형태의 반응곡선을 보이므로 curve-fitting을 통하여 IC50 값을 구할 수 있었다(Fig.
- 콜레스테롤 생합성 과정에 있어서 속도조절 단계 효소의 하나인 squalene synthase에 대한 저해물질의 탐색을 목적으로, 30종의 다양한 천연물을 대상으로 squalene synthase에 대해 저해효과를 검토한 결과 녹차 추출물에서 비교적 저해 활성이 높고 재현성이 있게 저해효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 녹차에 함유되어 있는 squalene synthase에 대한 저해물질의 용매추출성을 검토한 결과 ethyl acetate와 n-butanol 층에 저해물질이 많이 함유되어 있는 것으로 확인되었으며 저해물질은 녹차의 polyphenol 화합물인 catechin에 의한 것으로 추정되었다.
후속연구
- Squalene synthase(SQS)는 acetyl-CoA에서 시작하여 콜레스테롤이 합성되는 콜레스테롤 생합성 과정 중에서 famesyl pyrophosphate(FPP)가 squalene으로 전환되는 단계를 촉매하는 효소이다[21,24]. SQS 저해제는 HMG-CoA reductase 저해제와는 달리 콜레스테롤 생합성 경로상 하류(downstream)에 해당하는 효소를 저해하는 것이기 때문에 HMG-CoA reductase에 의해 파생되는 많은 생체내 isoprenoid 물질들의 전구체 비생성 현상이 나타나지 않아, HMG-CoA 저해제에 의한 여러가지 부작용[16]을 막을 수 있을 것으로 기대된다. 포유동물의 이소프레노이드 합성 경로는 스테롤을 형성할 뿐만 아니라 돌리콜(dolichol), 유비퀴논(ubiquinone), 헴 A의 파네실 그룹(famesyl groups of heme A), 프레닐화된 단백질의 파네실과 제라닐제라닐 그룹(famesyl & geranylgeranyl groups of prenylated proteins), 이소펜테닐 아데닌의 이소펜테닐 곁사슬(isopentenyl side chain of isopentenyl adenine) 등도 형성한다.
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