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문제 정의
- 본 연구에서는 식품의약품안전청에서 추진하는 한약재과 학화사업의 일환으로 지삼 (地參)이라고 불리는 지모의 감별 연구를 추진하였다. 지모 DNA의 trnL-F 영역 염기서열을 결정하고, 이 염기서열을 이용하여 지모의 기원식물을 확인하고, 시중에서 유통되고 있는 한약재 지모가 A.
- 이 계통수에서 재분류의 여지가 남아있는 속 (genus)들을 살펴보았다. 용설란과 (Agavaceae) clade에 있으면서 지모 다음으로 용설란과 (Agavaceae)에서 분지해 나온 속이 Hosta 속인 데, Hostcf속은 수선화과 (Hyacinthaceaee-3- 알려져 있기 때문에osta속의 분류에 더 많은 연구가 필요함을 알 수 있었다.
제안 방법
- 지모 샘플은 액체질소로 얼린 후 유발에서 마쇄하고 Plant DNA isolation kit (GeneALL)을 이용하여 genomic DNA를 추줄하였다. Agarose gel과 UV spectrophotometer 사용하여 분리된 DNA를 정량하였다.
- 또한, 용설란과 (Agavaceae)/} 속해 있는 Aspamgales목 (order)의 여러 과 (family)® 대표하는 속 (genus)들의 trnL-F 염기서열을 다운받았다. ClustalX 프로그램을 이용하여 다운받은 염기서열들을 정렬하였고 정렬된 염기서열의 개수는 outgroup으로 넣은 인삼 (Panax ginsenge 염기서열까지 54개였다. 정렬된 전체염기서열의 크기는 532bp이었고, 지모의 경우 정렬에 포함된 염기서열은 443 bp이었다.
- TrnL-F 계통수의 유용성을 확인하기 위하여 rbcL 유전자 염기서열을 이용하여 계통수를 그리고, trnL-Y 계통수와 비교해보았다. RbcL 유전자 염기서열 분석 결과 지모와 가장 가까운 종*r Hesperocallis undulata이었고, nucleotide divergence 가 2.
- TtmL-F 염기서열을 결정하기 위해, trnL-F 영역의 universal primer인 c와 f 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 프라이머의 염기서열은 c (5'-CGA AAT CGG TAG ACG CTA-3, )와 f (5'-ATT TGA ACT GGT GAC ACG AG-3') 이었으며 (Taberlet et al.
- 수행하였다. 계통수를 그리기 위하여 Bioedit 프로그램으로 식물체의 염기서열들을 편집하였고, ClustalX 프로그램으로 염기서열을 정렬하였다. r계통수는 MEGA3 프로그램을 사용하여 구축되었다.
- 최초로 얻어진 지모 TrnF 염기서열은 NCBI database에 등록하였다. 다음으로 국내 한약재 시장과 중국 한 약재 시장에서 유통 중인 지모 한약재를 다량 구입하여 trnLF의 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 유통 중인 지모 한약재 들이 모두 기원식물과 동일한 TrnL-F의 염기서열을 보여서 지 모 약재의 경우 진품이 유통되고 있음을 알 수 있었다.
- asphodeloides 종 (species) 진품이 맞는지 확인하였다. 더 나아가, trnL-F 계통수를 구축하여 그동안 백합과 (Liliaceae)로 분류되었던 지모의 계통학적 유연관계를 살펴보았다.
- 지모 （Anemarrhena asphodeloides^： 탁월한 해열작용과 진 정작용을 갖는 한약재로 한국, 중국, 일본에서 널리 이용되어왔다. 본 연구에서는 먼저 국내 연구소에서 형태학적 분류 결 과 지모로 확인된 3종의 식물체를 수집하여 엽록체 DNA의 ZmL-F 염기서열을 분석하였다. 분석 결과, 국내 연구기관에서 보관중인 지모 식물체들이 모두 동일한 FmL-F의 염기서열을 보여서, 형태학적 분류와 계통유전학적 분류가 동일함을 확인 하였다.
- 수집된 모든 지모 샘플에서 DNA를 분리하고 TrnL-F 영역을 PCR 증폭한 후 염기서열을 분석하였다. 먼저, 기원이 분명한 지모 기원식물 2개의 tmL-F 염기서열을 서로 비교한 결과, 동일한 것으로 확인되었다 (100% 일치).
- 얻어진 지모의 염기서열은 NCBI에서 Blast를 수행하였다. 계통수를 그리기 위하여 Bioedit 프로그램으로 식물체의 염기서열들을 편집하였고, ClustalX 프로그램으로 염기서열을 정렬하였다.
- , 1991), PCR conditione predenaturation 94℃, 1 min; denaturation 94℃, 60 sec; annealing 56℃, 30 sec; extension 72℃, 120 sec; 34 cycles 이 었다. 증폭된 PCR 산물을 정제하여 (주)제노텍에 염기서열 결정을 의뢰 하였다.
- 추진하였다. 지모 DNA의 trnL-F 영역 염기서열을 결정하고, 이 염기서열을 이용하여 지모의 기원식물을 확인하고, 시중에서 유통되고 있는 한약재 지모가 A. asphodeloides 종 (species) 진품이 맞는지 확인하였다. 더 나아가, trnL-F 계통수를 구축하여 그동안 백합과 (Liliaceae)로 분류되었던 지모의 계통학적 유연관계를 살펴보았다.
- 시중에 유통되고 있는 한약재 샘플은 한국과 중국의 한약재 유통 시장에서 11개를 구매하여, 총 29개의 지모 샘플을 확보하였다. 지모 샘플은 액체질소로 얼린 후 유발에서 마쇄하고 Plant DNA isolation kit (GeneALL)을 이용하여 genomic DNA를 추줄하였다. Agarose gel과 UV spectrophotometer 사용하여 분리된 DNA를 정량하였다.
대상 데이터
- NCBI에서 용설란과 (Zgavaceae)로 분류된 22개 속 (genus) 의 trnL-F 염기서열을 다운받았다. 이 염기서열들은 trnL 3'exon이나 trnL 유전자와 trnF exon 사이의 intergenic 영역보다는 주로 trnL intron의 염기서열이었다.
- 연구에 사용된 지모샘플을 Table 1에 나타내었다. 기존에 형태학적으로 분류가 이루어져서 기원이 확인된 지모 식물 2개를 농촌진흥청 작물과학원과 식약청 옥천약초시험장에서 각각 수집하였다. 마찬가지로 경희대 학교, 이화여자대학교, 동국대학교에서 형태학적 분류가 끝나서 효능연구가 진행되고 있는지 모 샘플을 16개 확보하였다.
- 이 염기서열들은 trnL 3'exon이나 trnL 유전자와 trnF exon 사이의 intergenic 영역보다는 주로 trnL intron의 염기서열이었다. 또한, 용설란과 (Agavaceae)/} 속해 있는 Aspamgales목 (order)의 여러 과 (family)® 대표하는 속 (genus)들의 trnL-F 염기서열을 다운받았다. ClustalX 프로그램을 이용하여 다운받은 염기서열들을 정렬하였고 정렬된 염기서열의 개수는 outgroup으로 넣은 인삼 (Panax ginsenge 염기서열까지 54개였다.
- 기존에 형태학적으로 분류가 이루어져서 기원이 확인된 지모 식물 2개를 농촌진흥청 작물과학원과 식약청 옥천약초시험장에서 각각 수집하였다. 마찬가지로 경희대 학교, 이화여자대학교, 동국대학교에서 형태학적 분류가 끝나서 효능연구가 진행되고 있는지 모 샘플을 16개 확보하였다. 시중에 유통되고 있는 한약재 샘플은 한국과 중국의 한약재 유통 시장에서 11개를 구매하여, 총 29개의 지모 샘플을 확보하였다.
- 마찬가지로 경희대 학교, 이화여자대학교, 동국대학교에서 형태학적 분류가 끝나서 효능연구가 진행되고 있는지 모 샘플을 16개 확보하였다. 시중에 유통되고 있는 한약재 샘플은 한국과 중국의 한약재 유통 시장에서 11개를 구매하여, 총 29개의 지모 샘플을 확보하였다. 지모 샘플은 액체질소로 얼린 후 유발에서 마쇄하고 Plant DNA isolation kit (GeneALL)을 이용하여 genomic DNA를 추줄하였다.
성능/효과
- 그 외 Massonia sp., Camassia quamash 외 여러 종의 TrnL-F 염기서열이 92% 정도의 유사성을 보였다. 지모는 백합과 (Liliaceae)로 분류되어 왔으나 최근 NCBI Taxonomy browser (http://www.
- RbcL 유전자 염기서열 분석 결과 지모와 가장 가까운 종*r Hesperocallis undulata이었고, nucleotide divergence 가 2.4%, 염기 차이는 30bp이었다 (Table 3). 다음으로 지모와 가까운 종은 모두 NCBI Taxonomy browser에서 용설란과 (Agavaceaee- 분류된 속 (genus)이었다.
- 1). TmL-F 영역을 이용하는 장점으로 첫째, trnL-F 영역은 NCBI에 방대한 양의 데이터가 축적되어 있어서, 감별하고자 하는 시료의 염기서열을 결정한 후 NCBI Blast를 통해 데이터베이스의 염기서열과 비교하여 결론을 내릴 수가 있다. 둘째, TrnL-F 영역을 구성하는 염기의 개수가 작기 때문에 건조과정에서 손상된 한약재 DNA로부터 PCR 증폭 산물을 얻는데 어렵지 않다.
- divergence를 분석할 수 없었다. TrnL-F 염기서열 분석 결과 지모와 가장 가까운 종은 Hosta jbrtUHei와 Hosta veniri, 이었고, nucleotide divergence가 4.9%, 염기 차이는 26 bp이었다 (Table 2). 다음으로 지모와 가까운 종들은 모두 NCBI Taxonomy browser에서 용설란과 (Agavaceae)의 속 (genus)들이었다.
- 다음으로 지모와 가까운 종은 모두 NCBI Taxonomy browser에서 용설란과 (Agavaceaee- 분류된 속 (genus)이었다. TrnL-F 염기서열에 서지 모와 가장 가까웠던 Hosta속은 rbcL 유전자 염기서열에서다소 차이를 보였지만, 지모와 가장 가까운 Hesperocallis imdulah유¥ HosS속의 rbcL 염기서열과의 차이가 크지 않았다. RbcL 계통수에서 (Fig.
- 그 결과, 유통 중인 지모 한약재 들이 모두 기원식물과 동일한 TrnL-F의 염기서열을 보여서 지 모 약재의 경우 진품이 유통되고 있음을 알 수 있었다. TrnLF의 염기서열로 계통수를 작성한 결과 지모는 아스파라거스목 （Asparagales）, 용설란과 (Agavaceae)에 속한 것으로 보여 졌 다. 엽록체 rbcL 유전자 염기서열로 얻은 계통수와 비교한 결 과 trnL-F 계통수와 rbcL 계통수가 비슷한 결과를 보여주어서 분자유전학적 분류에 두 유전자가 상호보완적으로 이용될 수 있음을 확인하였다.
- 이 계통 수에서 지모 (A. asphodeloidese Hosta 속과 다른 용설란과 (Agavaceae) clade에서 sister group (자매군)으로 분지해 나왔고 이때 bootstrap value는 55%에 불과했다. 이것은 지모가 용설란과 (Agavaceae)에 속하는지 아니면 독자적인 과 (family)®- 형성하는지 결정하기 위해 용설란과 (/gowzceQe)를중심으로 더 많은 다양한 속 (genus)의 trnL-F 염기서열이 밝혀져야 함을 의미하고 그래서 bootstrap value가 높아진 계통수를 얻어야 함을 의미한다.
- 실제로 백합과 (Liliaceae는 두계통수에서 모두 아스파라거스목 (Asparagus)의 바깥에 위치하고 있으며 outgroup (P. ginseng 바로 안쪽에 위치하여서, 지모가 분류되어 있는 아스파라거스목 (Asparagales)에서 상당한 차이가 있음을 확인하였다.
- 계통학적 분석은 Neighbor-Joining method로 수행되었고 인삼 (Panax ginseng)^: 외군 (outgroup)으로 사용하였는데 계통수에는 용설란과 (Agavaceae)^] 여러 속 (genus)들과 용설란과 (/gQmc&ae)가 속해있는 Aspamgales목 (order)의 여러과 (Family)를 대표하는 두 개 이상의 속 (genus)들로 구성되었다 (Fig. 2). Bootstrap 분석 결과, 12~100%의 bootstrap value가 나타나 계통수가 전체적으로 안정적이지 않았다.
- 다음으로 국내 한약재 시장과 중국 한 약재 시장에서 유통 중인 지모 한약재를 다량 구입하여 trnLF의 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 유통 중인 지모 한약재 들이 모두 기원식물과 동일한 TrnL-F의 염기서열을 보여서 지 모 약재의 경우 진품이 유통되고 있음을 알 수 있었다. TrnLF의 염기서열로 계통수를 작성한 결과 지모는 아스파라거스목 （Asparagales）, 용설란과 (Agavaceae)에 속한 것으로 보여 졌 다.
- 지모의 /thL-F 염기서열을 NCBI에서 Blast하였다. 그 결과, 지모의 trnL-F 염기서열이 NCBI에 등록되어 있지 않음을 확인하였고 본 연구에서 얻어진 지모 fr-wL-F 염기서열을 NCBI 에 등록하였다 (accession number EU180056). 지모의 trnL-F 염기서 열은 Hosta ventricosa trnL-F (AF508512, identities = 606/634 (95%)), Hesperocallis undulata frnL-F (AY561253, identities = 595/623 (95%))와 가장 유사한 것으로 나타났다.
- 셋째, trnL-F 영역은 size가 직기 때문에 sequencing할 때 Big-Dye PCR 반응을 forward와 reverse 반응 한번씩 만으로 염기서열을 결정할 수 있다. 넷째, trnL-F 영역은 intron과 intergenic 영역 (두 개의 coding 유전자 사이의 non-coding 영역)이기 때문에 rbcL 유전자와 같은 다른 엽록체 유전자들보다 염기서열 변이가 커서 종 (species)간, 변종 (variety)간 또는 품종 (cultivar) 구별에도 사용이 가능하다.
- 9%, 염기 차이는 26 bp이었다 (Table 2). 다음으로 지모와 가까운 종들은 모두 NCBI Taxonomy browser에서 용설란과 (Agavaceae)의 속 (genus)들이었다.
- 4%, 염기 차이는 30bp이었다 (Table 3). 다음으로 지모와 가까운 종은 모두 NCBI Taxonomy browser에서 용설란과 (Agavaceaee- 분류된 속 (genus)이었다. TrnL-F 염기서열에 서지 모와 가장 가까웠던 Hosta속은 rbcL 유전자 염기서열에서다소 차이를 보였지만, 지모와 가장 가까운 Hesperocallis imdulah유¥ HosS속의 rbcL 염기서열과의 차이가 크지 않았다.
- 이것으로 두 기원 식물들이 서로 동일한 것임을 확인할 수 있었다. 다음으로 한국과 중국에서 유통되는 한약재 샘플들 27개의 fmL-F 염기서열을 두 기원식물의 염기서열과 비교한 결과 모두 동일한 것으로 확인되었다 (100% 일치). 이것으로 한국과 중국의 한약재 시장에서 유통되는 한국산 지모와 중국산 지모 약재들이 모두 기원 식물인 A.
- 두 계통수 (trnL-Y 계통수와 rbcL 계통수)에서 아스파라거스과 (Asparagaceae), 수선화과 (Hyacinthaceae), 붓꽃과 (Iridaceae) 등은 아스파라거스목 (Asparagales) 내에서 높은 bootstrap value들을 가지는 안정된 ciade를 형성하고 있어서 분류가 잘 되어진 것을 알 수 있었다. NCBI Taxonomy browsei에서 백합속 (Liliaceae)은 백합과 (Liliaceae), 백합목 (Liliales)으로 등록되어 있다.
- PCR 증폭한 후 염기서열을 분석하였다. 먼저, 기원이 분명한 지모 기원식물 2개의 tmL-F 염기서열을 서로 비교한 결과, 동일한 것으로 확인되었다 (100% 일치). 이것으로 두 기원 식물들이 서로 동일한 것임을 확인할 수 있었다.
- 백합과 (Liliaceae)는 백합목 (M*s)에 속하며 아스파라거스 목 (Asparageles)하고는 완전히 다른 목 (order)이다. 본 연구에서 지모의 trnL-F 계통수와 rbcL 계통수 결과가 유사한 결론을 도줄하였는데 이것은 NCBI Taxonomy browser의 분류와 일치하고 있었다. 이 두 계통수는 기존에 발표된 Asparagales목의 계통수와 유사함을 또한 확인하였다 (Chase et al.
- 본 연구에서는 먼저 국내 연구소에서 형태학적 분류 결 과 지모로 확인된 3종의 식물체를 수집하여 엽록체 DNA의 ZmL-F 염기서열을 분석하였다. 분석 결과, 국내 연구기관에서 보관중인 지모 식물체들이 모두 동일한 FmL-F의 염기서열을 보여서, 형태학적 분류와 계통유전학적 분류가 동일함을 확인 하였다. 최초로 얻어진 지모 TrnF 염기서열은 NCBI database에 등록하였다.
- rbcL 유전자나 matK 유전자는 1, 500bp 이상의 크기인 반면 frnL-F 영역은 900 bp 크기밖에 안 된다. 셋째, trnL-F 영역은 size가 직기 때문에 sequencing할 때 Big-Dye PCR 반응을 forward와 reverse 반응 한번씩 만으로 염기서열을 결정할 수 있다. 넷째, trnL-F 영역은 intron과 intergenic 영역 (두 개의 coding 유전자 사이의 non-coding 영역)이기 때문에 rbcL 유전자와 같은 다른 엽록체 유전자들보다 염기서열 변이가 커서 종 (species)간, 변종 (variety)간 또는 품종 (cultivar) 구별에도 사용이 가능하다.
- TrnLF의 염기서열로 계통수를 작성한 결과 지모는 아스파라거스목 （Asparagales）, 용설란과 (Agavaceae)에 속한 것으로 보여 졌 다. 엽록체 rbcL 유전자 염기서열로 얻은 계통수와 비교한 결 과 trnL-F 계통수와 rbcL 계통수가 비슷한 결과를 보여주어서 분자유전학적 분류에 두 유전자가 상호보완적으로 이용될 수 있음을 확인하였다.
- asphodeloides 종이라는 것을 확인할 수 있었다. 이것으로 지모의 형태학적인 분류 (Han et al., 1997; Bae, 2000; Kim et al., 2002; Kim et al., 2004)와 DNA 염기서열에 기반을 둔 분자유전학적인 분류가 동일한 결과를 보인다는 것을 확인할 수 있었다.
- 다음으로 한국과 중국에서 유통되는 한약재 샘플들 27개의 fmL-F 염기서열을 두 기원식물의 염기서열과 비교한 결과 모두 동일한 것으로 확인되었다 (100% 일치). 이것으로 한국과 중국의 한약재 시장에서 유통되는 한국산 지모와 중국산 지모 약재들이 모두 기원 식물인 A. asphodeloides 종이라는 것을 확인할 수 있었다. 이것으로 지모의 형태학적인 분류 (Han et al.
- 그 결과, 지모의 trnL-F 염기서열이 NCBI에 등록되어 있지 않음을 확인하였고 본 연구에서 얻어진 지모 fr-wL-F 염기서열을 NCBI 에 등록하였다 (accession number EU180056). 지모의 trnL-F 염기서 열은 Hosta ventricosa trnL-F (AF508512, identities = 606/634 (95%)), Hesperocallis undulata frnL-F (AY561253, identities = 595/623 (95%))와 가장 유사한 것으로 나타났다. 그 외 Massonia sp.
- 분류되고 있다. 지모의 trnL-F 염기서열의 Blast 결과로는 지모가 백합과 (Liliaceae)보다는 용설란과 (Agavaceaefe 속하는 것으로 주측되었고 이에 지모의 재분류가 필요하다고 여겨졌다.
후속연구
- 용설란과 (Agavaceae) clade에 있으면서 지모 다음으로 용설란과 (Agavaceae)에서 분지해 나온 속이 Hosta 속인 데, Hostcf속은 수선화과 (Hyacinthaceaee-3- 알려져 있기 때문에osta속의 분류에 더 많은 연구가 필요함을 알 수 있었다. 그 다음으로 분지해 나온 TrnL7속을 비롯한 다른 속 (genus)들은 모두 NCBI에서 용설란과 (Agavaceae)^.
- 분류된 속 (genus)이었/다. 지모 (A. asphodeloides) 밑에 위치한 而th函cum속은 용설란과 (Agavaceae)^ 분류되어 있으나 이 계통 수에서는 Ruscaceaee clade에 위치하여 분류 연구가 더 필요함을 알 수 있었다.
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