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문제 정의
- 본 연구에서는 MPA를 생산하는 P. brevicompactum ATCC 16024에 대해 자외선과 NTG 돌연변이를 유도하여 균체의 생산성을 증가시키고자 하였다. 또한 다양한 변이주 선별 실험을 위한 생물학적 정량분석 (Bioassay) 방법이 요구됨에 따라 MPA의 생산에 대하여 생물학적 정량과 HPLC 정량분석을 이용하여 비교 분석하였다.
제안 방법
- 4는 MPA의 농도 (HPLC 분석)와 생물학적 정량분석법에 의한 대상균주의 저해환의 관계를 나타낸 것이다. 0.1 g/L이하의 농도 범위에서는 MPA 의 농도가 증가함에 따라 저해환의 직경이 선형으로 증가하였지만, 그보다 더 높은 농도에서는 비례하지 않았으며, 0.6 g/L 이상에서는 저해환의 크기에 영향을 미치지 못해 생물학적 정량분석은 0.1 g/L 이하로 희석하여 정량 분석하였다. Fig.
- MPA의 항진균 활성을 측정하기 위하여 Candida albicans를 시험균으로 하여 직경 9cm 배양접시에 20 ml의 PDA배지를 가한 평판배지에 시험균을 도말하고, 직경 8 mm, 두께 0.5 mm의 종이원판 (paper disc)에 20 ㎕의 배양액을 가한 후 배지 위에 올려놓고, 30℃ 배양기에서 24시간 배양하여, 평판배지에 생성된 생장저해환의 직경으로 MPA의 생산량을 측정하였다.
- P. brevicompactum ATCC 16024가 생산하는 MPA의 항균활성을 조사하기 위하여 수종의 세균과 진균에 대한 항균 활성을 측정하였다. Table 1에 대상균주와 배양 조건에 대하여 나타내었다.
- P. brevicompactum ATCC 16024를 PDB에서 10일간 배양한 배양액으로부터 MPA를 추출하였다. 세포 내부의 MPA와 세포 외부의 MPA의 농도를 각각 측정하기 위해 균체와 배양여액을 나누고, 추출 용매 (에탄올)를 첨가하여 MPA를 추출하였다.
- 자외선 광원과 시료와의 거리는 균주의 생존율 변화에 큰 영향을 미치지 못한 것으로 판단하여본 실험에서의 광원과 시료와의 거리는 65cm로 고정하여 실험을 수행하였다. 고생산성 균주를 탐색할 때 무작위 선별된 변이주 군집 모두를 배양하여 검정하는 것은 많은 시간, 비용, 인력을 필요로 하므로 대량 정량분석을 위하여 Candida albicans에 대한 MPA의 항진균 활성을 이용하여 변이주를 선별하였다. 본 실험에서는 자외선 투광시간을 120초로 하여 1% 미만의 생존된 균주를 대상으로 C.
- 초음파 처리 시간에 따른 MPA 추출양은 초음파 처리 30분까지는 MPA의 양이 증가하다가 30분 이후로는 MPA의 추출양에 큰 차이를 보이지 않게 되었다(data not shown). 따라서 배양액의 최적 추출조건으로 30분간 초음파 처리한 배양물을 에탄올과 1：10의 비율로 혼합하여 추출하는 것으로 선정하였다.
- brevicompactum ATCC 16024에 대해 자외선과 NTG 돌연변이를 유도하여 균체의 생산성을 증가시키고자 하였다. 또한 다양한 변이주 선별 실험을 위한 생물학적 정량분석 (Bioassay) 방법이 요구됨에 따라 MPA의 생산에 대하여 생물학적 정량과 HPLC 정량분석을 이용하여 비교 분석하였다.
- 세포 내부의 MPA와 세포 외부의 MPA의 농도를 각각 측정하기 위해 균체와 배양여액을 나누고, 추출 용매 (에탄올)를 첨가하여 MPA를 추출하였다. 또한, 추출 효율을 증가시키기 위해 균질화 및 초음파 처리 (37kHz)방법으로 MPA 추출 실험을 하였다.
- Table 1에 대상균주와 배양 조건에 대하여 나타내었다. 박테리아는 nutrient agar (NA) 배지를 사용하여 E. coli와 S. aureus, S. entaritidis는 37℃ 배양기에서 24시간, B. cereus는 30℃ 배양기에서 12시간 배양하여 측정하였고, 진균류는 potato dextrose agar (PDA) 배지를 사용하여 V. lecanii는 25℃, A. fumigatas는 28℃배양기에서 120시간, C. albicans는 30℃배양기에서 24시간 배양하여 생성된 생장저해환을 비교하여 항균활성을 측정하였다.
- 고생산성 균주를 탐색할 때 무작위 선별된 변이주 군집 모두를 배양하여 검정하는 것은 많은 시간, 비용, 인력을 필요로 하므로 대량 정량분석을 위하여 Candida albicans에 대한 MPA의 항진균 활성을 이용하여 변이주를 선별하였다. 본 실험에서는 자외선 투광시간을 120초로 하여 1% 미만의 생존된 균주를 대상으로 C. albicans에 대한 MPA 의 항진균 활성을 측정하였다. 대조구와 비교해 P.
- 포자 현탁액은 생리식염수로 ml당 포자가 103에서 104되게 희석하여 PDA 배지에 100 ㎕씩 분주하였다. 분주한 평판배지를 20 W 자외선등 2~5 (254 nm)개가 45~65cm 거리에 설치된 UV mutator (자체제작)에서 15초 간격으로 150초까지 자외선을 조사시켜 돌연변이 유도를 한 후 즉시 알루미늄 호일로 차광하여 광회복에 의한 DNA 복구가 일어나지 않도록 하였다. 28℃의 배양기에서 10일간 배양하였다(Fig.
- brevicompactum ATCC 16024를 PDB에서 10일간 배양한 배양액으로부터 MPA를 추출하였다. 세포 내부의 MPA와 세포 외부의 MPA의 농도를 각각 측정하기 위해 균체와 배양여액을 나누고, 추출 용매 (에탄올)를 첨가하여 MPA를 추출하였다. 또한, 추출 효율을 증가시키기 위해 균질화 및 초음파 처리 (37kHz)방법으로 MPA 추출 실험을 하였다.
- 자외선 조사시간이 60초일 때 10%, 75초일 때 6%, 120초 일 때 1% 미만의 생존율을 얻었다. 자외선 광원과 시료와의 거리는 균주의 생존율 변화에 큰 영향을 미치지 못한 것으로 판단하여본 실험에서의 광원과 시료와의 거리는 65cm로 고정하여 실험을 수행하였다. 고생산성 균주를 탐색할 때 무작위 선별된 변이주 군집 모두를 배양하여 검정하는 것은 많은 시간, 비용, 인력을 필요로 하므로 대량 정량분석을 위하여 Candida albicans에 대한 MPA의 항진균 활성을 이용하여 변이주를 선별하였다.
- 6). 항진균 활성을 이용한 1차 변이주 선별 후, 선별된 변이주를 액침 배양하여 MPA 생산량을 측정하였다. Fig.
대상 데이터
- , USA)에서 28℃로 10일간 배양하여 사용하였다. Candida albicans KCCM 11282 (Korean Culture Center of Microorganisms)는 (사)한국종균협회에서 분양받아 대상균주로 사용하였으며, PDA에서 30℃로 24시간 배양하여 사용하였다. 각 균주는 한천배지에서 활성화시켜 사용 하였고, 장기간 보관 시 15% 글리세롤 stock 상태로 -70℃에서 보관하여 사용하였다.
- 6의 생물학적 정량 방법과도 잘 일치하는 것으로 나타났다. P. brevicompactum UB-3, UB-9, 그리고 UC-4에서 각각 1.146 g/L, 2.051 g/L, 그리고 1.390 g/L의 MPA를 생산하였다. 따라서, 자외선 돌연변이주로 UB-9가 MPA 생산에 적합한 변이주로 결정되었다.
- fumigatas 에 대해서는 항균력이 없는 것으로 나타났다. 따라서 본 연구에서는 생물학적 정량분석의 대상 균주로 C. albicans 을 이용하였다.
- 3% 생존율을 얻었다. 본 실험에서는 NTG 처리시간을 60분으로 하여 1.12%의 생존된 균주를 대상으로 자외선 돌연변이에서와 같이 변이주를 선별하였다. 1차 선별된 변이주의 액침배양 결과를 Fig.
- 본 연구에 이용된 균주 Penicillium brevicompactumATCC 16024는 (주)코람바이오텍 (Dajeon, Korea)로부터 분양받았으며, Potato Dextrose Agar (PDA) (Aldrich Co., USA)에서 28℃로 10일간 배양하여 사용하였다. Candida albicans KCCM 11282 (Korean Culture Center of Microorganisms)는 (사)한국종균협회에서 분양받아 대상균주로 사용하였으며, PDA에서 30℃로 24시간 배양하여 사용하였다.
- 분석에 사용한 HPLC (Waters Co., USA)는1515 isocratic pump, 717 plus autosampler, 2996 photodiode array detector로 구성하여 사용하였으며, Monomeric C18 column (4.6 mm×250 mm) (Grace Vydac., USA)을 이용하여 254 nm의 파장에서 측정하였다.
성능/효과
- NTG 처리시간 0~10분 사이에 생존율이 급격하게 떨어졌으나, 그 이후의 생존율은 미세하게 감소함을 보였다. 0.02% NTG 처리 10분이 지났을 때의 생존율은 2.02%였고, 60분에서 1.12%, 90분에서 0.3% 생존율을 얻었다. 본 실험에서는 NTG 처리시간을 60분으로 하여 1.
- 10에 나타내었다. 1차 선별된 변이주에서 대조군보다 MPA 생산이 높게 나타난 변이주는 P. brevicompactum NA-9와 NC-3이었으며, 각각 1.575 g/l, 2.238 g/l의 MPA 생산성을 보였다.
- 9에 나타내었다. NTG 처리시간 0~10분 사이에 생존율이 급격하게 떨어졌으나, 그 이후의 생존율은 미세하게 감소함을 보였다. 0.
- P. brevicompactum ATCC 16024에서 생산되는 MPA는 표 1에서 나타낸 바와 같이 C. albicans와 V. lecanii에 대해서는 항진균력이 나타났으나 E. coli, S. entaritidis, S. aureus, B. cereus, A. fumigatas 에 대해서는 항균력이 없는 것으로 나타났다. 따라서 본 연구에서는 생물학적 정량분석의 대상 균주로 C.
- 또한 MPA는 세포외 물질로서 판명되었고, 배양액으로부터 MPA를 추출할 때에는 초음파 처리를 수행함으로써 추출 효율을 높일 수 있었다. P. brevicompactum ATCC 16024의 MPA 생산성 증가를 위한 균주개발에서 자외선과 NTG 돌연변이 유도 결과 각각의 방법에서 P. brevicompactum UB-9과 P. brevicompactum NC-3의 변이주를 얻었으며, 액침배양에서 UB-9은 2.051 g/l, 그리고 NC-3은 2.238 g/l의 MPA를 생산하여, 각각 2.71배, 그리고 2.96배 생산성이 증가하였다.
- 4는 배양액의 추출 방법과 배양액 부분별 MPA농도에 관하여 생물학적 정량법과 HPLC를 이용해 비교 분석한 결과이다. 그림에서 보이는 것처럼 균질화 처리는 MPA 추출에 효용을 보이지 못했지만, 초음파 처리는 효과적으로 MPA를 배양액으로부터 추출할 수 있었다. 또한 배양액에서는 MPA의 농도가 상대적으로 높게 나타났지만, 균체에서 추출한 MPA의 농도는 아주 낮은 것으로 P.
- albicans에 대한 MPA 의 항진균 활성을 측정하였다. 대조구와 비교해 P. brevicompactum UB-9의 생장저해환의 비율이 2.13으로 다른 변이주들의 항진균 활성에 비해 다소 높은 값을 나타내었다(Fig. 6). 항진균 활성을 이용한 1차 변이주 선별 후, 선별된 변이주를 액침 배양하여 MPA 생산량을 측정하였다.
- 390 g/L의 MPA를 생산하였다. 따라서, 자외선 돌연변이주로 UB-9가 MPA 생산에 적합한 변이주로 결정되었다.
- 1 g/L 이하에서는 선형으로 증가하여 비교적 합리적인 상관관계를 얻을 수 있었으므로 변이주의 선별 실험에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단되었다. 또한 MPA는 세포외 물질로서 판명되었고, 배양액으로부터 MPA를 추출할 때에는 초음파 처리를 수행함으로써 추출 효율을 높일 수 있었다. P.
- 그림에서 보이는 것처럼 균질화 처리는 MPA 추출에 효용을 보이지 못했지만, 초음파 처리는 효과적으로 MPA를 배양액으로부터 추출할 수 있었다. 또한 배양액에서는 MPA의 농도가 상대적으로 높게 나타났지만, 균체에서 추출한 MPA의 농도는 아주 낮은 것으로 P. brevicompactum ATCC 16024에서 생산되는 MPA는 세포외 생산물 (extracellular product)인 것으로 판단되었다. 생물학적 정량 방법에서 균체 내부의 MPA 를 얻을 수 없었던 이유는, 미량의 MPA 항진균 활성이 너무 미약하여 육안에 의한 저해환으로 표시될 수 없었던 것으로 사료된다.
- brevicompactum ATCC 16024이 생산하는 MPA의 돌연변이 유도에 의한 균주 개발에 대한 연구를 수행하여 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다. 생물학적 정량분석과 HPLC를 이용한 정량분석의 비교 결과, 시료중 MPA의 양이 0.1 g/L 이하에서는 선형으로 증가하여 비교적 합리적인 상관관계를 얻을 수 있었으므로 변이주의 선별 실험에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단되었다. 또한 MPA는 세포외 물질로서 판명되었고, 배양액으로부터 MPA를 추출할 때에는 초음파 처리를 수행함으로써 추출 효율을 높일 수 있었다.
- 6에 나타내었다. 자외선 조사시간이 60초일 때 10%, 75초일 때 6%, 120초 일 때 1% 미만의 생존율을 얻었다. 자외선 광원과 시료와의 거리는 균주의 생존율 변화에 큰 영향을 미치지 못한 것으로 판단하여본 실험에서의 광원과 시료와의 거리는 65cm로 고정하여 실험을 수행하였다.
- 021 g/l의 MPA를 얻었다. 처리하지 않은 배양액과 균체에서 얻은 MPA의 농도와 비교하여 초음파 처리한 시료에서 얻어낸 MPA는 각각 142%와 204%로 MPA 추출양이 증가하는 것으로 확인되었다.
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