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문제 정의
- 본 연구에서는 소유래 물질을 원료로 하는 생물의약품, 조직공학 제제, 세포치료제 등에서 BPV 안전성을 확보하기 위해, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 BPV를 정량적으로 검출하고, 제조공정에서 BPV 제거 검증을 위한 시험법으로 활용이 가능한 민감도와 특이도가 우수한 real-time PCR 시험법을 확립하고자 하였다. 또한 확립된 real-time RT-PCR 시험법을 활용하여 인위적으로 BPV를 감염시킨 CHO 세포와 소유래 콜라겐에서 BPV를 정량적으로 검출하여 바이러스 안전성 검증 시험법으로의 활용 가능성을 평가하였다.
- 본 연구에서는 소유래 원료를 사용하는 생물의약품과 조직공학 제제, 세포치료제의 안전성을 보증하기 위해서 BPV를 정량적으로 신속하게 검출할 수 있는 민감도와 특이도가 우수한 real-time PCR 시험법을 개발하고자 하였다. BPV 전체 유전자를 대상으로 BPV에만 특이적인 primer 5쌍을 디자인하였다.
가설 설정
- 6, Quantitative detection of BPV in artificially infected CHO DG44 cell line. A. Morphology of CHO DG44 cell line not infected with BPV. B.
제안 방법
- 세포 배양액을 제거한 후 세포 배양액에 남아있을 수 있는 BPV을 완벽히 제거하기 위해 phosphate buffered saline으로 3번 세척한 다음 CHO DG44를 계대 배양하였다. 4일 동안 배양한 후 다시 계대 배양한 다음 4일 후에 현미경으로 CHO DG44의 모양을 관찰한 후 세포 배양액과 세포를 따로 수거하였다. 확립된 real-time PCR 방법을 이용하여 세포 배양액과 세포에 BPV가 존재하는지 여부를 확인하였다.
- BPV DNA 정량을 위한 real-time PCR 방법의 신뢰성(reliability)을 보증하기 위해 확립된 실험법의 민감도(sensitivity), 재현성 (reproducibility), 특이성 (specificity) 등을 검 증하였다. 민감도를 측정 하기 위해 Titer가 1.
- BPV를 2% 우혈청을 첨가한 DMEM 배지로 7배수로 희석하여 24 well plate에 배양된 세포에 0.25 mL씩 접종하였다. 음성대조군으로 세포배양배지를 0.
- BPV의 정량을 위해 감염성 있는 바이러스의 titerf- 50% tissue culture infectious dose(TCID5o)로 나타내었다. BPV를 2% 우혈청을 첨가한 DMEM 배지로 7배수로 희석하여 24 well plate에 배양된 세포에 0.
- BPV의 정량을 위해 일반 PCR을 통해 확립된 PCR 조건을 기초로 AccuPower Greenstar PCR Premix Ex Taq(Bioneer, Korea)을 사용하여 real-time PCR 조건을 확립하였다. BPV 정량을 위해 Corbett Research사(Australia)의 Rotor-Gene 3000 real-time PCR 기계를 사용하였다.
- CHO DG44 세포를 5% 우혈청을 첨가한 Iscove's modified Dulbecco's medium(IMDM: Gibco BRL, USA) 배 지 에 lOOx Hypoxanthine-Thyminidine suppliment(HT suppliment; Gibco BRL, USA) 1%를 첨가하여 배양하였다. T-25 flask에 배양된 CHO DG44에 BPV를 감염시킨 후 4일 동안 배양하였다.
- 1). Corbett Research사(Australia)의 PALM- CYCLER를 이용한 일반 PCR 반응을 통해 디자인한 primer 5쌍들의 특이성을 확인하고, annealing temperature와 MgC& 농도를 변화시켜 PCR 조건을 최적화하였다. 또한 증폭된 DNA가 목적하는 산물인지를 확인하기 위하여 PCR product의 DNA sequencing을 실시하였다.
- real-time PCR 조건을 확립하였다. Forward primer로 BPV-F4를 reverse primer로 BPV-R4를 사용하여 PCR 반응의 annealing temperature를 최적화하였다(Fig. 2). Titer가 1.
- BPV 정량을 위해 Corbett Research사(Australia)의 Rotor-Gene 3000 real-time PCR 기계를 사용하였다. PCR 반응액은 AccuPower Greenstar PCR Premix Ex Taq 12.5 pL, 10 pmol forward primer 0.5 pL, 10 pmol reverse primer 0.5 HL, template 2 μL에 멸균된 3차 증류수를 넣어 총 25가 되게 하였다. 핵산증폭은 pre-incubatione 95℃에서 1분, denaturatione 95℃에서 10초, annealinge 20초(annealing 온도 최적화를 위해 50℃, 52℃, 54℃, 56℃, 58℃, 60℃ 에서 real-time PCR 수행 ), extentione 72℃에서 20초로 하여 45 cycle을 수행하였다.
- 확립된 real-time PCR 방법을 이용하여 세포 배양액과 세포에 BPV가 존재하는지 여부를 확인하였다. Real-time PCR 양성 대조군으로는 titer가 1.3 X 102 TCIDWmL인 BPV를 사용하였으며 , 음성 대조군으로는 CHO 세포주 배양배지 또는 비감염된 CHO 세포주를 사용하였다.
- Agarose gel electrophoresis of the PCR products. Specificity of the real-time PCR assay was evaluated using the optimized protocol and then the PCR products were analyzed by 1.5% agarose gel electrophoresis. M, 100 bp DNA ladder; 1, Bovine parvovirus; 2, Minute virus of mice; 3, Human parvovirus B19; 4, Porcine parvovirus; 5, Bovine herpesvirus; NC, Negative control.
- EBTr 세포를 10% 우혈청(Gibco BRL, USA)을 첨가한 Dulbecco's Minimun Essential Medium(DMEM: Gibco BRL, USA) 배지에 배양하였다. T-150 flask에 배양된 단층 세포에 바이러스를 감염시킨 후주 기적으로 세포병변효과(cytopathic effect: CPE)를 관찰하였다. CPE가 명백하게 관찰 될 때 배양액과 세포를 수거한 다음, 400 X g에서 5분간 원심 분리하여 상층액은 따로 모으고 pellete 재현탁하였다.
- 세포주에서 BPV 검출 시험을 실시하였다. T-25 flask에 배양된 CHO DG44 세포에 BPV를 인위적으로 오염시킨 후 T-25 flask에 3번 이상 계대 배양하면서 병변효과를 관찰하였다. BPV는 CHO DG44 세포주에서 병변효과를 나타내지 않았다(Fig.
- Titer가 1.3 X 104 TCIDso/mL인 BPV를 순차적으로 10배씩 희석한 후 각 희석액 0.2 mL을 소유래 콜라겐 1.8 mL에 spiking한 다음 확립된 real-time PCR 방법을 사용하여 BPV를 검출하였다. Real-time PCR 음성 대조군으로는 바이러스를 첨가하지 않은 콜라겐을 사용하였다.
- BPV 검출시험을 실시하였다. Titer가 1.3 x 104 TCIDWmL인 BPV를 순차적으로 10배씩 희석한 후 각 희석액 0.2 mL을 소유래 콜라겐 1.8 mL에 spiking 한 다음 확립된 real-time PCR 방법을 사용하여 BPV를 검출하였다. 각 시료에 대해 real-time PCR cycle 수에 따른 fluorescence 값의 증가를 관찰한 결과 1.
- Titer를 측정하고자 하는 시료들과 함께 Titer가 1.3 x 105 TCIDWmL인 BPV를 순차적으로 1.3 x 10'1 TCHAo/mL까지 10단계 희석한 후 real-time PCR을 수행하여 정량을 위한 표준곡선을 작성하였다. 시료 속에 들어있는 BPV DNA의 양을 표준곡선에 대입하여 정량하였다.
- 25 mL씩 접종하였다. 그 후 CO2 배양기에서 5% CO2, 35O(C로 배양하면서 계속적으로 현미경으로 CPE를 관찰하였다.
- 일반적으로 BT 세포주 단층세포에 원료물질, 세포주 파쇄액 , 공정 시료, 반제품, 완제품 등을 첨가한 후 7일 이상 배양을 하면서 병변효과를 관찰하여 오염여부를 판단하거나 haemadsorption tes를 통해 바이러스 오염여부를 판단한다. 또한 BT 세포주 단층세포에 원료물질, 세포주 파쇄액, 공정시료, 반제품, 완제품 등을 첨가한 후 7일 이상 배양 한 다음 소유래 바이러스에 대한 항혈청을 이용해 면역형광 방법으로 바이러스 오염 여부를 판단한다. 이러한 생물학적 실험법의 경우 시간이 많이 걸리고, 비용이 많이 드는 단점이 있다.
- Corbett Research사(Australia)의 PALM- CYCLER를 이용한 일반 PCR 반응을 통해 디자인한 primer 5쌍들의 특이성을 확인하고, annealing temperature와 MgC& 농도를 변화시켜 PCR 조건을 최적화하였다. 또한 증폭된 DNA가 목적하는 산물인지를 확인하기 위하여 PCR product의 DNA sequencing을 실시하였다.
- 확립하고자 하였다. 또한 확립된 real-time RT-PCR 시험법을 활용하여 인위적으로 BPV를 감염시킨 CHO 세포와 소유래 콜라겐에서 BPV를 정량적으로 검출하여 바이러스 안전성 검증 시험법으로의 활용 가능성을 평가하였다.
- 핵산증폭은 pre-incubatione 95℃에서 1분, denaturatione 95℃에서 10초, annealinge 20초(annealing 온도 최적화를 위해 50℃, 52℃, 54℃, 56℃, 58℃, 60℃ 에서 real-time PCR 수행 ), extentione 72℃에서 20초로 하여 45 cycle을 수행하였다. 마지막 cycle 후에는 모든 반응물에 대하여 72℃부터 95℃까지 영역에서 melting curve 분석을 실시하였다. 최적 MgCh 농도를 설정하기 위해 최적화된 annealing 온도 52℃에서 MgCl#를 2 mM에서 5mM까지 변화시켜 첨가해준 BPV DNA 농도에 따른 crossing point 값을 비교하였다.
- 증하였다. 민감도를 측정 하기 위해 Titer가 1.3 x 105 TCIDso/mL인 BPV를 순차적으로 10배씩 희석한 후 realtime PCR을 수행하였다. 각 시료에 대해 real-time PCR cycle 수에 따른 fluorescence값의 증가를 관찰한 결과 민감도는 1.
- 등을 검증하였다. 민감도를 측정하기 위해 titer가 1.3 x 105 TCIDso/mL인 BPV를 순차적3 1.3 x 104 TCIDWmL까지 10단계 희석한 후 real-time PCR을 수행하였다. 재 현성 검증을 위해 titer가 1.
- 선택된 sequence는 특정 바이러스에만 존재하여 특이성이 높아야 한다. 생물의약품의 원료물질, 공정 중간물질, 최종제품 등에 미량으로 오염될 수 있는 바이러스 검출을 위한 정량 PCR의 경우 높은 민감도가 요구된다[19, 25], 위와 같은 조건을 만족하는 PCR을 확립하기 위해 Primer3 Software# 이용하여 BPV 특이적인 primer 5쌍을 디자인하였다(Table 1). 일반 PCR을 실행하여 각각의 primer 쌍들의 민감도를 확인하였다.
- 세포배양 상청액 4mL을 회수하고, CHO DG44 세포를 trypsine- 처리하여 4 mL 부피로 회수하였다. 세포배양 상청액과 CHO 세포에서 각각 DNA를 추출하고, 확립된 real-time PCR을 활용하여 BPV를 정량 검출하였다(Fig. 6C). 세포배 양액 에서는 1.
- 3 x 10'1 TCHAo/mL까지 10단계 희석한 후 real-time PCR을 수행하여 정량을 위한 표준곡선을 작성하였다. 시료 속에 들어있는 BPV DNA의 양을 표준곡선에 대입하여 정량하였다. 표준곡선은 BPV의 농도에 따라 real-time PCR에 의해 검출되는 crossing point 값을 TCID50 equivalent/mL로 전환하여 작성 하였다[19].
- , USA)을 사용하여 100V 전압으로 30분정도 전기영동한 후 ethidium bromideS. 염색하여 PCR 반응산물을 확인하였다.
- 25 mL씩 접종하였다. 음성대조군으로 세포배양배지를 0.25 mL씩 접종하였다. 그 후 CO2 배양기에서 5% CO2, 35O(C로 배양하면서 계속적으로 현미경으로 CPE를 관찰하였다.
- 생물의약품의 원료물질, 공정 중간물질, 최종제품 등에 미량으로 오염될 수 있는 바이러스 검출을 위한 정량 PCR의 경우 높은 민감도가 요구된다[19, 25], 위와 같은 조건을 만족하는 PCR을 확립하기 위해 Primer3 Software# 이용하여 BPV 특이적인 primer 5쌍을 디자인하였다(Table 1). 일반 PCR을 실행하여 각각의 primer 쌍들의 민감도를 확인하였다. Titer가 1.
- BPV의 정량을 위해 일반 PCR을 통해 확립된 PCR 조건을 기초로 AccuPower Greenstar PCR Premix Ex Taq(Bioneer, Korea)을 사용하여 real-time PCR 조건을 확립하였다. BPV 정량을 위해 Corbett Research사(Australia)의 Rotor-Gene 3000 real-time PCR 기계를 사용하였다.
- 3 x 104 TCIDWmL까지 10단계 희석한 후 real-time PCR을 수행하였다. 재 현성 검증을 위해 titer가 1.3 X 105 TCIDWmL인 BPV를 순차적으로 1.3 X104 TCHZWmL까지 10단계 희석한 표준시료를 서로 다른 날에 3회 정량 분석하여 crossing point 값을 비교하였다. 특이성 검증을 위해 minute virus of mice(ATCC VR 1346), human parvovirus B19(BBI Diagnostics, USA), porcine parvovirus(ATCC VR 742), bovine herpesvirus type 1(ATCC VR-188)에 대한 cross- reactivity를 측정하였다.
- 마지막 cycle 후에는 모든 반응물에 대하여 72℃부터 95℃까지 영역에서 melting curve 분석을 실시하였다. 최적 MgCh 농도를 설정하기 위해 최적화된 annealing 온도 52℃에서 MgCl#를 2 mM에서 5mM까지 변화시켜 첨가해준 BPV DNA 농도에 따른 crossing point 값을 비교하였다.
- 최적 온도에서 MgC12 농도를 변화시켜 PCR 조건을 최적화하였다 (Table 2). Titer가 1.
- PCR 조건을 최적화 한 결과 annealing temperature와 MgCl2 농도는 각각 52℃와 4 mM이었다. 최적 조건에서 PCR의 민감도를 측정하였다. Titer가 1.
- 3 X104 TCHZWmL까지 10단계 희석한 표준시료를 서로 다른 날에 3회 정량 분석하여 crossing point 값을 비교하였다. 특이성 검증을 위해 minute virus of mice(ATCC VR 1346), human parvovirus B19(BBI Diagnostics, USA), porcine parvovirus(ATCC VR 742), bovine herpesvirus type 1(ATCC VR-188)에 대한 cross- reactivity를 측정하였다. 시험에 사용한 바이러스의 titer는 각각 6 X 104 TCID50/mL, 9.
- 5 HL, template 2 μL에 멸균된 3차 증류수를 넣어 총 25가 되게 하였다. 핵산증폭은 pre-incubatione 95℃에서 1분, denaturatione 95℃에서 10초, annealinge 20초(annealing 온도 최적화를 위해 50℃, 52℃, 54℃, 56℃, 58℃, 60℃ 에서 real-time PCR 수행 ), extentione 72℃에서 20초로 하여 45 cycle을 수행하였다. 마지막 cycle 후에는 모든 반응물에 대하여 72℃부터 95℃까지 영역에서 melting curve 분석을 실시하였다.
- 5 |1L를 첨가하여 최종부피를 25 |1L로 맞주었다. 핵산증폭은 pre-incubatione 95℃에서 2분, denatura- tiome 95℃에서 30초, annealinge 30초(annealing 온도 최적화를 위해 48℃, 50℃, 52℃, 54℃, 56℃, 58℃에서 PCR 수행), extentione 72℃에서 1 분으로 하여 40 cycle을 수행하였다. 40 cycle PCR 후 72℃에서 5분 반응시킨 후 1.
- 확립된 BPV DNA 정량법의 신뢰성 (reliability)을 보증하기 위해 확립된 실험법의 민감도(sensitivity), 재현성(reproducibility) 등을 검증하였다. 민감도를 측정하기 위해 titer가 1.
- 확립된 BPV DNA 정량법의 재현성 검증을 위해 서로 다른 날에 BPV 표준시료에서 DNA를 추출하고 real-time PCR을 수행한 후 crossing point 값을 비교하였다(Fig. 4). BPV log titer(log10 TCIDWmL; x)에 대한 crossing point 값(y) 간의 표준 회귀식은 첫째 날의 경우 y = -3.
- 4일 동안 배양한 후 다시 계대 배양한 다음 4일 후에 현미경으로 CHO DG44의 모양을 관찰한 후 세포 배양액과 세포를 따로 수거하였다. 확립된 real-time PCR 방법을 이용하여 세포 배양액과 세포에 BPV가 존재하는지 여부를 확인하였다. Real-time PCR 양성 대조군으로는 titer가 1.
- 확립된 real-time PCR을 생물의약품 제조공정 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 BPV를 오염시킨 CHO 세포주에서 BPV 검출 시험을 실시하였다. CHO DG44 세포를 5% 우혈청을 첨가한 Iscove's modified Dulbecco's medium(IMDM: Gibco BRL, USA) 배 지 에 lOOx Hypoxanthine-Thyminidine suppliment(HT suppliment; Gibco BRL, USA) 1%를 첨가하여 배양하였다.
- 확립된 real-time PCR을 생물의약품 제조공정에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 BPV를 오염시킨 CHO 세포주에서 BPV 검출 시험을 실시하였다. T-25 flask에 배양된 CHO DG44 세포에 BPV를 인위적으로 오염시킨 후 T-25 flask에 3번 이상 계대 배양하면서 병변효과를 관찰하였다.
- 확립된 real-time PCR을 소유래 콜라겐 제조공정 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 BPV를 오염시킨 콜라겐에서 BPV 검출 시험을 실시하였다. Titer가 1.
- 확립된 real-time PCR을 소유래 콜라겐 제조공정에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 BPV를 오염시킨 콜라겐에서 BPV 검출시험을 실시하였다. Titer가 1.
대상 데이터
- BPV DNA는 GENE ALL™ Blood SV mini Kit(General Biosystem, Korea)을 사용하여 분리하였다. PCR 반응을 위해 바이 러스 genomic DNA 2 μL, 10 pmol forward primer 1 |iL, 10 pmol reverse primer 1 pL, 2X GoTaq#Green Master Mix(Promega, USA) 12.
- BPV 유전자를 증폭하기 위해 사용한 올리고핵산 primer 염기서 열은 NCBI data base에 보고된 BPV complete geno(NC 001540)을 기초로 Primer3 Software를 이용하여 디자인하였다(Table 1). Corbett Research사(Australia)의 PALM- CYCLER를 이용한 일반 PCR 반응을 통해 디자인한 primer 5쌍들의 특이성을 확인하고, annealing temperature와 MgC& 농도를 변화시켜 PCR 조건을 최적화하였다.
- BPV(ATCC VR 767)의 배양과 정량을 위해 EBTr 세포(ATCC CCL 44)를 사용하였다. EBTr 세포를 10% 우혈청(Gibco BRL, USA)을 첨가한 Dulbecco's Minimun Essential Medium(DMEM: Gibco BRL, USA) 배지에 배양하였다.
- CCL 44)를 사용하였다. EBTr 세포를 10% 우혈청(Gibco BRL, USA)을 첨가한 Dulbecco's Minimun Essential Medium(DMEM: Gibco BRL, USA) 배지에 배양하였다. T-150 flask에 배양된 단층 세포에 바이러스를 감염시킨 후주 기적으로 세포병변효과(cytopathic effect: CPE)를 관찰하였다.
- 특이성 검증을 위해 minute virus of mice(ATCC VR 1346), human parvovirus B19(BBI Diagnostics, USA), porcine parvovirus(ATCC VR 742), bovine herpesvirus type 1(ATCC VR-188)에 대한 cross- reactivity를 측정하였다. 시험에 사용한 바이러스의 titer는 각각 6 X 104 TCID50/mL, 9.4 X105 IU/mL, 106 TCID50/mL, 106 TCIDWmL이었다.
데이터처리
- Reproducibility of real-time PCR assay for quantitative detection of BPV. The standard curves were obtained by the regression analysis of crossing point values versus initial virus titer. These results were obtained from three independent assays performed at different days.
이론/모형
- BPV 정량을 위해 Corbett Research사(Australia)의 Rotor-Gene 3000 real-time PCR 기계를 사용하였다. PCR 반응액은 AccuPower Greenstar PCR Premix Ex Taq 12.
성능/효과
- BPV 전체 유전자를 대상으로 BPV에만 특이적인 primer 5쌍을 디자인하였다. 5쌍의 primer 중 NS-l(Non structural protein 1) 유전자를 대상으로 디자인한 primer 쌍 BPV-F4, BPV- R4의 민감도가 가장 우수하였다. 선별된 primer를 활용하여 annealing temperature와 MgCb 농도 등 PCR 조건을 최적화 한 결과 확립된 실험법의 민감도는 1.
- 3A). Melting curve 분석 결과 BPV DNA에 특이 적 인 부분과 primer dimer 등 비특이적인 부분으로 나뉘었으며 , 완충 용액대조군에서는 BPV DNA에 특이적인 peak를 확인할 수 없었다(Fig. 3B). 증폭된 PCR 산물을 1.
- 1). PCR 산물을 sequencing한 후 blast searching(www.ncbi. nlm.nih.gov/BLAST/) 한 결과 PCR 산물이 BPV 유전자임을 확인할 수 있었다(자료 미제시 ).
- 5A). Realtime PCR 산물을 1.5% agarose gel 상에서 분석한 결과 BPV 양성 대조군에서만 PCR 반응 산물이 생성되었고, 다른 바이러스와 완충용액 음성 대조군에서는 PCR 반응 산물이 생성되지 않았다(Fig. 5B). 이와 같은 결과에서 확립된 real-time PCR 방법은 BPV에 특이적인 실험법임을 확인하였다.
- 일반 PCR을 실행하여 각각의 primer 쌍들의 민감도를 확인하였다. Titer가 1.3 x 103 TCIDemL과 1.3 x 101 TCIDWmL인 BPV를 시료로 PCR을 수행한 결과 primer 쌍 BPV-F4, BPV-R4가 가장 민감도가 우수하였다(자료 미제시 ). PCR 조건을 최적화 한 결과 annealing temperature와 MgCl2 농도는 각각 52℃와 4 mM이었다.
- 2). Titer가 1.3 x leTCIDso/mL, 1.3 x lO3TCID5o/mL, 1.3 x lOeCIDso/ mL인 BPV를 시료로 annealing temperature를 50℃, 52℃, 54℃, 56℃, 58℃, 60℃로 변화시키며 real-time PCR을 수행하였을 때 52℃에서 crossing point가 가장 낮게 나타나 52OC가 최적 온도임을 알 수 있었다.
- (Table 2). Titer가 1.3 xlO5 TCID50/mL, 1.3 x 103 TCIDWmL, 1.3 x 101 TCIDWmL인 BPV를 시료^ MgCl2 농도를 2mM, 3mM, 4mM, 5mM로 변화시 켜가며 realtime PCR을 수행하였을 때 2mM에서 crossing point가 가장 낮게 나타나 최적 MgC12 농도는 2 mM임을 알 수 있었다.
- 최적 조건에서 PCR의 민감도를 측정하였다. Titer가 1.3 xlO5 TCID50/mL인 BPV를 순차적으로 희석하여 PCR 한 결과 13x10# TCIDso/mL까지 PCR 산물을 확인할 수 있었다(Fig. 1). PCR 산물을 sequencing한 후 blast searching(www.
- 8 mL에 spiking 한 다음 확립된 real-time PCR 방법을 사용하여 BPV를 검출하였다. 각 시료에 대해 real-time PCR cycle 수에 따른 fluorescence 값의 증가를 관찰한 결과 1.3xlO#TCID5o/mL까지 정량적으로 검출할 수 있었다(Fig. 7).
- 3 x 105 TCIDso/mL인 BPV를 순차적으로 10배씩 희석한 후 realtime PCR을 수행하였다. 각 시료에 대해 real-time PCR cycle 수에 따른 fluorescence값의 증가를 관찰한 결과 민감도는 1.3 X IO4 TCIDemL임을 확인할 수 있었다(Fig. 3A). Melting curve 분석 결과 BPV DNA에 특이 적 인 부분과 primer dimer 등 비특이적인 부분으로 나뉘었으며 , 완충 용액대조군에서는 BPV DNA에 특이적인 peak를 확인할 수 없었다(Fig.
- 다른 parvovirus 과 바이 러스들(minute virus of mice, human parvovirus B19, porcine parvovirus)과 DNA 바이러스인 bovine herpesvirus를 대상으로 특이성을 실험할 결과 BPV의 경우에만 fluorescence값의 증가를 관찰할 수 있었고, 다른 바이러스에서는 완충용액 음성 대조군과 같이 fluorescence값의 증가를 관찰할 수 없었다(Fig. 5A). Realtime PCR 산물을 1.
- 본 연구를 통해 확립된 BPV 검출 시험법을 CHO 세포주에서 BPV 검출 시험에 활용하였을 때, BPV에 오염된 CHO 세포주가 병변현상을 일으키지는 않았지만, CHO 세포주와 세포주 배양 상등액에서 BPV를 효과적으로 검출할 수 있었다. 따라서 BPV real-time PCR 시험법은 동물 세포주 검증과 생산공정 검증에서 BPV 오염 여부를 정성적 또는 정량적 검출할 수 있는 우수한 시험법임을 확인할 수 있었다. 동물세포주 검증에서 real-time PCR을 활용한 BPV 검출 시험은 지금까지 보고된 바 없다.
- 하지만 BPV를 효과적으로 검출할 수 있는 시험법이 확립되지 않아 real-time PCR 시험법 같은 민감한 시험법이 요구되고 있다. 본 연구를 통해 확립된 BPV 검출 시험법을 0.5% 콜라겐에 적용하였을 때 1.3 X 10# TCID50/mL까지 정량적으로 검출할 수 있어 콜라겐의 품질보증에 활용할 수 있는 우수한 시험법임을 확인하였다. 민감도를 높이기 위해서는 콜라겐으로부터 BPV DNA 추출 조건의 최적화가 필요하다고 판단된다.
- 이러한 생물학적 실험법의 경우 시간이 많이 걸리고, 비용이 많이 드는 단점이 있다. 본 연구를 통해 확립된 BPV 검출 시험법을 CHO 세포주에서 BPV 검출 시험에 활용하였을 때, BPV에 오염된 CHO 세포주가 병변현상을 일으키지는 않았지만, CHO 세포주와 세포주 배양 상등액에서 BPV를 효과적으로 검출할 수 있었다. 따라서 BPV real-time PCR 시험법은 동물 세포주 검증과 생산공정 검증에서 BPV 오염 여부를 정성적 또는 정량적 검출할 수 있는 우수한 시험법임을 확인할 수 있었다.
- 99 이상으로 재현성뿐만 아니라 회귀성이 매우 높음을 알 수 있었다. 생물의 약품의 품질관리 평가에 있어 시험법의 민감도와 재현성은 분석의 정확성 , 특이성 , 검출한계 등과 함께 매우 중요한 요인으로 고려되는데, 본 연구에서 확립한 정량법은 BPV를 정량하는데 있어 민감도와 재현성이 우수함을 확인할 수 있었다.
- 5쌍의 primer 중 NS-l(Non structural protein 1) 유전자를 대상으로 디자인한 primer 쌍 BPV-F4, BPV- R4의 민감도가 가장 우수하였다. 선별된 primer를 활용하여 annealing temperature와 MgCb 농도 등 PCR 조건을 최적화 한 결과 확립된 실험법의 민감도는 1.3 X W1 TCID50/mL이었다. 확립된 BPV DNA 정량법의 재현성 검증을 위해 서로 다른 날에 BPV 표준시료에서 DNA를 추출하고 real-time PCR을 수행한 후 crossing point 값을 비교한 결과, BPV log titer(logio TCID50/mL; x) 에 대한 crossing point 값(y 간의 표준 회귀식의 결정계수(F)는 모두 0.
- 5B). 이와 같은 결과에서 확립된 real-time PCR 방법은 BPV에 특이적인 실험법임을 확인하였다.
- 3B). 증폭된 PCR 산물을 1.5%(w/v) agarose gel 을 사용하여 전기 영동한 결과 각 MVM 양성시료에서 예상 크기의 밴드를 확인할 수 있었지만, 완충용액 대조구에서는 PCR 산물을 확인할 수 없었다(자료 미제시 ).
- 4 X TCID50 equivalent/mL BPV가 검출되었다. 증폭된 PCR 산물을 1.5%(w/v) agarose gel을 사용하여 전기 영동한 결과 각 BPV 양성시료, 세포배양액 , 세포에서 예상 크기의 밴드를 확인할 수 있었지만, 음성 대조군에서는 PCR 산물을 확인할 수 없었다(Fig. 6D).
- 3 X W1 TCID50/mL이었다. 확립된 BPV DNA 정량법의 재현성 검증을 위해 서로 다른 날에 BPV 표준시료에서 DNA를 추출하고 real-time PCR을 수행한 후 crossing point 값을 비교한 결과, BPV log titer(logio TCID50/mL; x) 에 대한 crossing point 값(y 간의 표준 회귀식의 결정계수(F)는 모두 0.99 이상으로 재현성뿐만 아니라 회귀성이 매우 높음을 알 수 있었다. 생물의 약품의 품질관리 평가에 있어 시험법의 민감도와 재현성은 분석의 정확성 , 특이성 , 검출한계 등과 함께 매우 중요한 요인으로 고려되는데, 본 연구에서 확립한 정량법은 BPV를 정량하는데 있어 민감도와 재현성이 우수함을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 본 연구를 통해 확립된 BPV real-time 시험법도 세포배양 유래 생물의약품 제조 공정에서 바이러스 제거 검증과 크로마토그래피 세척 검증에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
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