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문제 정의
- WSSV의 강한 전염성과 감염된 후 빠른 시일 안에 대량폐사를 일으키는 특징으로 인해 WSSV에 의한 감염을 검출하는 방법에 대해서는 지속적인 연구가 이루어져 왔으며(13, 21, 24, 29), 그 결과 최근에는 양^장의 환경 인자인 온도, 염분, pH, 용존산소 및 영양염류의 변동이 갑각류 면역체계에 영향을 주어 WSSV 감염을 쉽게 하는 것으로 보고되었다(20, 28). WSSV의 감염과 환경요인이 밀접한 관계를 나타낸다면, 양식수에 존재하는 WSSV의 농도와 환경요인과의 관계도 존재할 것이라 판단되어 본 연구에서는 해수의 환경요인의 변화와 해수에 존재하는 WSSV 양에 대한 관계를 분석하고자 하였다. 이 연구에서 조사한 물리화학적 요인 및 생물학적 요인은 총 13개로서 이들의 시료별, 시료채취 기간별 변화는 Fig.
- 그러나 연구의 대부분은 새우 조직 내의 WSSV의 존재 유무와 환경요인과의 관계에 대한 연구로서, 양식수에 존재하는 바이러스 및 환경요인과의 관계에 대해서는 연구가 전혀 없는 실정이다. 이러한 점에 기초하여 본 연구에서는 실제 양식수에 존재하는 WSSV의 양과 양식수 환경요인과의 관계를 파악하고자 하였다. 이를 위하여 우선 해수에 존재하는 WSSV를 QRT- PCR 방법을 이용하여 효율적으로 검출, 정량하는 방법을 정립하였으며 여러가지 물리, 화학, 생물학적 환경요인과 WSSV와의 상관관계를 분석하였다.
제안 방법
- 1). 2007년 6월 12일부터 2007년 9월 20일까지 2주 간격으로 총 8회 시료를 채취 하였고 시료 채취 시간은 오전 10시-11시로 일치시켰다. 양식장 내의 양^수와 양식장으로 유입되는 유입 해수 10 L를 멸균된 폴리에틸렌 채수병에 채수하였으며 냉장상태에 유의하여 실험실로 즉시 운반하였다.
- QRT-PCR 반응 용액은 2X IQ supermix (Bio-Rad, USA) 10 µl, primer 및 probe 각각 300 ㎚, template 5 μ1에 증류수를 첨가하여 20 µl 로 하였다. QRT-PCR 조건은 94℃에서 3분간 반응 후, 94℃에서 15초 동안 denaturing, 60℃에서 1분 동안 annealing-extension, 이후 형광반응을 관찰하는 과정을 45회 반복 수행하는 것으로 설정하였다. 모든 QRT-PCR에 WSSV 농도표준 DNA를 105 copy부터 10° copy까지 1/10으로 연속 희석하여 농도표준 그래프를 확보하였으며 Mini Opticon 3 (Bio-rad, USA) 프로그램에서 생성된 농도표준 그래프를 기초로 해수에 존재하는 WSSV의 농도를 계산하였다.
- QRT-PCR에 사용될 primer와 Taqman probe는 확보한 WSSV 클론의 염기서열을 기초로 하여 79 bp의 산물을 증폭할 수 있도록 제작되었다(Table 1). Taqman probe의 reporter dye로는 S에 6-carboxyfluorescein (FAM)을 적용하였고, quencher dye로는 BHQ-1 dark quencher를 3'에 사용하였다.
- 본 연구에서는 WSSV에 감염된 새우의 부속지로부터 WSSV의 nucleocapsid 단백질(VP35)을 증폭하여 825 bp의 PCR 산물을 확보할 수 있었으며, 이 PCR 산물의 클로닝을 이용하여 WSSV의 정량을 위한 절대표준농도(absolute standard concentra- tion)을 계산할 수 있었다. WSSV nucleocapsid 유전자의 클론으로부터 7.56X109 copies/pl 농도의 WSSV 절대표준을 확보하여 QRT-PCR에 사용하였다. 이 WSSV 절대표준을 1/10로 연속 희석하여 QRT-PCR의 표준농도곡선을 구하였을 때, log10 (WSSV copies)와 Ct (cycle number of threshold)값의 관계는 표준농도곡 선에서 상관계수(r2) 0.
- 정제된 825 bp의 PCR 산물을 TaKaRa Perfect-T cloning kit (TaKaRa, Japan)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 Escherichia coli DH5에 형질전환시켜 WSSV-inserted plasmid를 제작하였다. WSSV의 증폭산물이 클로닝된 클론을 확인 후 이 클론을 액체 LB 배지에서 18시간 배양한 다음, Plasmid Miniprep kit (DyneBio, Korea)로 plasmid를 주줄하였다. 주줄한 plasmid의 260 ㎚ 흡광도를 측정하여 DNA 농도를 계산하였으며 plasmid copy 수로 환산하였다.
- QRT-PCR 조건은 94℃에서 3분간 반응 후, 94℃에서 15초 동안 denaturing, 60℃에서 1분 동안 annealing-extension, 이후 형광반응을 관찰하는 과정을 45회 반복 수행하는 것으로 설정하였다. 모든 QRT-PCR에 WSSV 농도표준 DNA를 105 copy부터 10° copy까지 1/10으로 연속 희석하여 농도표준 그래프를 확보하였으며 Mini Opticon 3 (Bio-rad, USA) 프로그램에서 생성된 농도표준 그래프를 기초로 해수에 존재하는 WSSV의 농도를 계산하였다.
- 양식장 내의 양^수와 양식장으로 유입되는 유입 해수 10 L를 멸균된 폴리에틸렌 채수병에 채수하였으며 냉장상태에 유의하여 실험실로 즉시 운반하였다. 물리화학적 환경요인 및 생물학적 요인은 현장 또는 실험실로 운반한 즉시 측정하였다.
- 회수한 즉시 50 mM qSQ로 농축액을 중화하고 TE 완충용액으로 안정화시킨 다음 Vivaspin (Sartorius, UK) 컬럼을 사용하여 최종적으로 200 gl로 농축하였다. 바이러스 농축액 으로부터 DNeasy tissue kit (Qiagen, USA)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 바이러스 핵산 을 추출하였다. 추출된 핵산은 이후 QRT-PCR의 주형으로 사용되었으며, GF/C 여과막과 HA 여과막에서 정량된 WSSV의 copy 수를 합산하여 해수 속에 존재하는 바이러스 양을 계산하였다.
- 본 연구에서는 WSSV에 감염된 새우의 부속지로부터 WSSV의 nucleocapsid 단백질(VP35)을 증폭하여 825 bp의 PCR 산물을 확보할 수 있었으며, 이 PCR 산물의 클로닝을 이용하여 WSSV의 정량을 위한 절대표준농도(absolute standard concentra- tion)을 계산할 수 있었다. WSSV nucleocapsid 유전자의 클론으로부터 7.
- 2006년 8월에 횐반점 질병 (white spot syndrome disease)을 보인 흰다리새우vannamei, white leg shrimp)를 수거 하여 WSSV 농도표준의 제작을 위한 시료로 사용하였다. 새우의 부속지 (pleopod)와 아가미 조직 25 mg에서 High Pure viral RNA Kit (Roche, USA)로 핵산을 추출하였다. 추출된 핵산을 주형으 로 하여 Yang (3))에 의해 발표된 primer (Wl, W2; Table 1)를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 1.
- 이러한 점에 기초하여 본 연구에서는 실제 양식수에 존재하는 WSSV의 양과 양식수 환경요인과의 관계를 파악하고자 하였다. 이를 위하여 우선 해수에 존재하는 WSSV를 QRT- PCR 방법을 이용하여 효율적으로 검출, 정량하는 방법을 정립하였으며 여러가지 물리, 화학, 생물학적 환경요인과 WSSV와의 상관관계를 분석하였다.
- 증폭된 825 bp의 PCR 산물을 agarose 젤에서 자른 다음, Qiagen PCR purification kit를 이용하여 정제하였다. 정제된 825 bp의 PCR 산물을 TaKaRa Perfect-T cloning kit (TaKaRa, Japan)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 Escherichia coli DH5에 형질전환시켜 WSSV-inserted plasmid를 제작하였다. WSSV의 증폭산물이 클로닝된 클론을 확인 후 이 클론을 액체 LB 배지에서 18시간 배양한 다음, Plasmid Miniprep kit (DyneBio, Korea)로 plasmid를 주줄하였다.
- 종속영양세균은 Marine agar 배지(MA; Difco, USA)를 사용, 주입평판법으로 접종하여 20℃에서 7일 동안 배양한 다음 30~300개 범위 내에 형성된 콜로니 수를 계수하여 평균을 구하였다. 병원성 세균 및 병원성 세균 존재의 지표로 사용하고 있는 지표세균(indicator bacteria)으로서 총 대장균군(total coliforms), 분원성 대장균군(fecal coliforms), 분원성 enterococci, Vibrio spp.
- WSSV의 증폭산물이 클로닝된 클론을 확인 후 이 클론을 액체 LB 배지에서 18시간 배양한 다음, Plasmid Miniprep kit (DyneBio, Korea)로 plasmid를 주줄하였다. 주줄한 plasmid의 260 ㎚ 흡광도를 측정하여 DNA 농도를 계산하였으며 plasmid copy 수로 환산하였다. Copy 수가 결정된 이 plasmid는 이후 QRT-PCR을 위한 WSSV 농도표준으로 사용되었다.
- 5% agarose 젤을 이용하여 전 기영동을 수행하였다. 증폭된 825 bp의 PCR 산물을 agarose 젤에서 자른 다음, Qiagen PCR purification kit를 이용하여 정제하였다. 정제된 825 bp의 PCR 산물을 TaKaRa Perfect-T cloning kit (TaKaRa, Japan)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 Escherichia coli DH5에 형질전환시켜 WSSV-inserted plasmid를 제작하였다.
- 바이러스 농축액 으로부터 DNeasy tissue kit (Qiagen, USA)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 바이러스 핵산 을 추출하였다. 추출된 핵산은 이후 QRT-PCR의 주형으로 사용되었으며, GF/C 여과막과 HA 여과막에서 정량된 WSSV의 copy 수를 합산하여 해수 속에 존재하는 바이러스 양을 계산하였다.
- 새우의 부속지 (pleopod)와 아가미 조직 25 mg에서 High Pure viral RNA Kit (Roche, USA)로 핵산을 추출하였다. 추출된 핵산을 주형으 로 하여 Yang (3))에 의해 발표된 primer (Wl, W2; Table 1)를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 1.5% agarose 젤을 이용하여 전 기영동을 수행하였다. 증폭된 825 bp의 PCR 산물을 agarose 젤에서 자른 다음, Qiagen PCR purification kit를 이용하여 정제하였다.
- 해수에 들어있는 바이러스의 농축은 Katayama 등(16)과 Choo (6)에 의하여 제시된 방법을 변형하여 사용하였다. 해수 500 ml을 GF/C (Whatman, 1.
대상 데이터
- 연구대상 시료는 강화도 길상면에 위치한 대하(Fenneropenaeus chinensis) 양식장(37°38'23"N, 126°3'39"E)의 양식수와 양식장의 원수로 사용되는 유입 해수로 정하였다(Fig. 1). 2007년 6월 12일부터 2007년 9월 20일까지 2주 간격으로 총 8회 시료를 채취 하였고 시료 채취 시간은 오전 10시-11시로 일치시켰다.
- 2006년 8월에 횐반점 질병 (white spot syndrome disease)을 보인 흰다리새우vannamei, white leg shrimp)를 수거 하여 WSSV 농도표준의 제작을 위한 시료로 사용하였다. 새우의 부속지 (pleopod)와 아가미 조직 25 mg에서 High Pure viral RNA Kit (Roche, USA)로 핵산을 추출하였다.
- Taqman probe의 reporter dye로는 S에 6-carboxyfluorescein (FAM)을 적용하였고, quencher dye로는 BHQ-1 dark quencher를 3'에 사용하였다. QRT-PCRe Bio-rad 사의 Mini opticon (Bio-Rad, USA)을 사용하였다. QRT-PCR 반응 용액은 2X IQ supermix (Bio-Rad, USA) 10 µl, primer 및 probe 각각 300 ㎚, template 5 μ1에 증류수를 첨가하여 20 µl 로 하였다.
- QRT-PCR에 사용될 primer와 Taqman probe는 확보한 WSSV 클론의 염기서열을 기초로 하여 79 bp의 산물을 증폭할 수 있도록 제작되었다(Table 1). Taqman probe의 reporter dye로는 S에 6-carboxyfluorescein (FAM)을 적용하였고, quencher dye로는 BHQ-1 dark quencher를 3'에 사용하였다. QRT-PCRe Bio-rad 사의 Mini opticon (Bio-Rad, USA)을 사용하였다.
- 2007년 6월 12일부터 2007년 9월 20일까지 2주 간격으로 총 8회 시료를 채취 하였고 시료 채취 시간은 오전 10시-11시로 일치시켰다. 양식장 내의 양^수와 양식장으로 유입되는 유입 해수 10 L를 멸균된 폴리에틸렌 채수병에 채수하였으며 냉장상태에 유의하여 실험실로 즉시 운반하였다. 물리화학적 환경요인 및 생물학적 요인은 현장 또는 실험실로 운반한 즉시 측정하였다.
- 온도 및 염분은 현장에서 수질측정기(YSI Model 30)을 이용하여 측정하였으며 시료 채취기간 동안의 일별 기온의 변화는 기상청의 기후자료를 참고하였다. 용존산소(DO), 생화학적 산소요구량(BOD), 엽록소 a (chlorophyll a), 아질산 질소(nitrite-N), 암모니아 질소(ammonium-N), 인산인(phosphate-P), 규산 규소 (silicate-Si)의 측정은 해양환경공정시험방법(1) 및 표준방법(2)을 따랐다.
- 총 대장균군, 분원성 대장균군, 분원성 enterococci, Vibrio spp.의 검출을 위한 선택배지로는 각각 m-Endo LES agar, m-FC agar, m-Enterococcus agar, thiosulfate citrate bile sucrose (TCBS) agar (Difco, USA)를 이용하였다.
이론/모형
- 온도 및 염분은 현장에서 수질측정기(YSI Model 30)을 이용하여 측정하였으며 시료 채취기간 동안의 일별 기온의 변화는 기상청의 기후자료를 참고하였다. 용존산소(DO), 생화학적 산소요구량(BOD), 엽록소 a (chlorophyll a), 아질산 질소(nitrite-N), 암모니아 질소(ammonium-N), 인산인(phosphate-P), 규산 규소 (silicate-Si)의 측정은 해양환경공정시험방법(1) 및 표준방법(2)을 따랐다. 질산 질소(nitrate-N)는 salicylic acid 방법(15)을 적용하여 측정하였다.
- 병원성 세균 및 병원성 세균 존재의 지표로 사용하고 있는 지표세균(indicator bacteria)으로서 총 대장균군(total coliforms), 분원성 대장균군(fecal coliforms), 분원성 enterococci, Vibrio spp. 의 배양 및 정량은 cellulose acetate 여과막(0.45 ㎛ pore size, Millipore)을 사용한 막여과법(membrane filtration)을 이용하였다(2). 총 대장균군, 분원성 대장균군, 분원성 enterococci, Vibrio spp.
- 용존산소(DO), 생화학적 산소요구량(BOD), 엽록소 a (chlorophyll a), 아질산 질소(nitrite-N), 암모니아 질소(ammonium-N), 인산인(phosphate-P), 규산 규소 (silicate-Si)의 측정은 해양환경공정시험방법(1) 및 표준방법(2)을 따랐다. 질산 질소(nitrate-N)는 salicylic acid 방법(15)을 적용하여 측정하였다.
성능/효과
- 3D). BOD 및 엽록소 a의 결과로 보아 유입수의 유기물 증가의 원인은 식물플랑크톤의 대발생으로 사료되었다.
- 3). WSSV 의 양과 각 환경요인들간에 상관관계를 분석한 결과 WSSV의 양과 BOD, 엽록소 a, 분원성 enterococci 사-이에는 실질적인 상관관계가 있는 것으로 분석되었다. WSSV의 양은 BOD와 Pearson correlation coefficient 0.
- 본 연구에서 측정된 모든 물리화학적 환경요인과 생물학적 요인을 WSSV의 변화양상과 그래프를 그려서 확인하였을 때 양식수 내의 WSSV의 분포와 유사한 분포양상을 보이는 요인에는 BOD, 엽록소 a, 분원성 enterococci/]- 포함되었다(Fig. 3). WSSV 의 양과 각 환경요인들간에 상관관계를 분석한 결과 WSSV의 양과 BOD, 엽록소 a, 분원성 enterococci 사-이에는 실질적인 상관관계가 있는 것으로 분석되었다.
- 이들 세균은 인체유해 병원성 세균 및 지표세균으로서 인체에 유해한 세균의 지표로 사용된다. 분원성 enterococci를 제외하고는 WSSV의 분포와 이들 지표세균 분포 사이의 상관관계는 변화의 추이로 보아 그리 크지 않은 것으로 판단되었다.
- 영양염류의 농도는 전반적으로 양식수보다 유입수에서 대부분 높았으며 규산 규소의 경우 양식수에서는 검출되지 않았다(Table 2). 이는 양식수 내의 엽록소 a의 양이 유입수보다 월등히 높았던 사실로 비추어 보이-, 양식수 내의 식물플랑크톤이 영양염류를 생장에 사용한 결과이며, 특히 규조류 (diatom)에 의한 규산 규소 의 이용이 매우 활발하였던 결과라 추정할 수 있다(3, 8).
- 56X109 copies/pl 농도의 WSSV 절대표준을 확보하여 QRT-PCR에 사용하였다. 이 WSSV 절대표준을 1/10로 연속 희석하여 QRT-PCR의 표준농도곡선을 구하였을 때, log10 (WSSV copies)와 Ct (cycle number of threshold)값의 관계는 표준농도곡 선에서 상관계수(r2) 0.996&으로 매우 높게 나타나 제작된 primer 와 Taqman probe가 QRT-PCR에 효과적으로 적용될 수 있음이 확인되었다(Fig. 2). 해수에 존재하는 WSSV를 정량하기 위한 QRT-PCR에 이 절대표준은 매번 사용되었으며 항상 log10 (WSSV copies)과 Ct 값의 상관계수는 0.
- 3A). 특히 7월 10일에 양식수와 유입 수 모두 WSSV의 양이 급격히 증가하였는데, 이때 BOD, 엽록소 a, 분원성 enterococci도 같은 양상으로 증가되는 현상이 관찰되어 WSSV의 분포가 여러 생물학적 환경요인과 깊은 관계가 있음을 보여주었다(Fig. 3).
- WSSV의 감염경로와 감염요인에 대한 연구로서 새우의 모체로부터 바이러스가 전달되는 수직적 전염뿐만 아니라 질병발생 및 중간숙주 및 양식환경 요인과의 관계에 주목하는 수평적 전염에 대한 연구는 지속적으로 수행되어 왔다(18, 19, 20).특히 양식수 의 환경요인과 새우의 집단 발병은 밀접한 관계가 있는 것으로 나타났으며 전반적인 연구결과는 새우가 WSSV에 감염되었다 하더라도 수환경이 양호하면 대량폐사에는 이르지 않는 것으로 밝혀졌다. 그러나 연구의 대부분은 새우 조직 내의 WSSV의 존재 유무와 환경요인과의 관계에 대한 연구로서, 양식수에 존재하는 바이러스 및 환경요인과의 관계에 대해서는 연구가 전혀 없는 실정이다.
- 017)를 나타내었다. 한편 다른 항목들의 유의확률은 모두 0.16-0.97로 나타나 WSSV의 양과 직접적인 관련이 없는 것으로 판단되었다. 최근에 WSSV의 감염경로에 대한 연구로부터 식물 플랑크톤이 바이러스의 중간 숙주임을 보고된 바 있는데(19), 본 연구결과는 이러한 사실을 뒷받침해주는 결과라 볼 수 있다.
후속연구
- 본 연구결과는 한 곳의 정점에서 대하양^이 이루어지는 한 시기의 결과를 대상으로 이루어진 것이므로 이를 일반화하기에는 무리가 따른다. 그러나 본 연구의 결과는 WSSV와 이들 환경요인간의 관계를 집중적으로 연구할 수 있는 토대가 될 수 있을 것이며 새우 조직 내의 WSSV를 검출하는 연구만이 아니라 WSSV 의 주요한 서식환경인 해수에서의 WSSV의 양에 대한 장기적인 모니터링의 필요성을 제시하고 있다. 본 연구를 통해 정립된 해수에 존재하는 WSSV의 농축방법과 정량 PCR 방법은 신속하게 앙식수에 존재하는 WSSV의 양을 파악하여 새우질병의 가능성을 사전에 인지할 수 있도록 하여 대응책을 모색하는 데에 응용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 최근에 WSSV의 감염경로에 대한 연구로부터 식물 플랑크톤이 바이러스의 중간 숙주임을 보고된 바 있는데(19), 본 연구결과는 이러한 사실을 뒷받침해주는 결과라 볼 수 있다. 본 연구결과는 한 곳의 정점에서 대하양^이 이루어지는 한 시기의 결과를 대상으로 이루어진 것이므로 이를 일반화하기에는 무리가 따른다. 그러나 본 연구의 결과는 WSSV와 이들 환경요인간의 관계를 집중적으로 연구할 수 있는 토대가 될 수 있을 것이며 새우 조직 내의 WSSV를 검출하는 연구만이 아니라 WSSV 의 주요한 서식환경인 해수에서의 WSSV의 양에 대한 장기적인 모니터링의 필요성을 제시하고 있다.
- 그러나 본 연구의 결과는 WSSV와 이들 환경요인간의 관계를 집중적으로 연구할 수 있는 토대가 될 수 있을 것이며 새우 조직 내의 WSSV를 검출하는 연구만이 아니라 WSSV 의 주요한 서식환경인 해수에서의 WSSV의 양에 대한 장기적인 모니터링의 필요성을 제시하고 있다. 본 연구를 통해 정립된 해수에 존재하는 WSSV의 농축방법과 정량 PCR 방법은 신속하게 앙식수에 존재하는 WSSV의 양을 파악하여 새우질병의 가능성을 사전에 인지할 수 있도록 하여 대응책을 모색하는 데에 응용될 수 있을 것으로 사료된다.
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