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문제 정의
- 의 실험에서 포화도가 가장 높은 군에서 심부보다 표층에 국한되어 재광화가 일어난 것을 보고하였는데 이렇게 표층에 침착된 무기질은 결국 심부의 재광화 현상에 있어서 무기질 침투를 방해하는 기능을 하기 때문에 탈회 병소의 완전한 재광화를 억제할 가능성이 있다고 하였다. 이에 이 실험에서는 심부의 변화를 확인하고자 전체 실험군의 포화도를 낮게 형성하였다. Group 1 에서는 포화도는 낮지만, 비이온화된 유기산의 양이 많고, pH가 4.
제안 방법
- 50ml 플라스틱 통에 재광화 완충용액 30 ml을 채우고 시편이 잠기도록 설치한 후 섭씨 25℃ 항온조에 10일(Group 1, 2, 3, 4) 혹은 12일 (Group 5, 6, 7, 8)간 반응시키고, 이 때 용액을 2일 간격으로 교체하였다. 0.15mm 시편은 매일 편광 현미경 하에서 증류수에 침윤시켜 배율 100배인 상태에서 관찰 및 촬영하고, 나머지 치관 1/2의 형태는 10일 혹은 12일 후 spatial resolution을 0.009mm로 설정하여 micro-CT로 촬영하였다.
- 50ml 플라스틱 통에 재광화 완충용액 30 ml을 채우고 시편이 잠기도록 설치한 후 섭씨 25℃ 항온조에 10일(Group 1, 2, 3, 4) 혹은 12일 (Group 5, 6, 7, 8)간 반응시키고, 이 때 용액을 2일 간격으로 교체하였다. 0.
- Micro-CT로 촬영하고 NRecon 프로그램 (Micro Photonics, U.S.A.)을 이용하여 상을 얻은 후, Photoshop 프로그램 (Adobe, U.S.A.)을 이용하여 재광화 전과 후의 동일 slice를 중첩시켜 동일 면적을 얻어 Scion Image pro-gram으로 density를 측정하고 Spread sheet program (Excel, Microsoft, U.S.A.)으로 graph를 재구성하여 비교하였다.
- 각 군당 10개의 시편을 실험하였고, 한 치아로부터 얻은 3개 혹은 4개의 시편이 각 군당 고르게 분포하도록 하였다.
- 경화 후 저속 diamond wheel saw (Minitom, Struers, Denmark) 를 이용하여 치아 장축에 평행하게 협설측으로 이등분되도록 하여 1/2 치관 부위를 얻고, 나머지 부위는 치아 장축에 평행하게 0.4 - 0.5 mm 의 절편을 만든 다음 #800 사포를 이용하여 0.15 mm 두께로 연마하였다.
- 3 M의 용액을 제조하였다. 그리고 인산칼륨분말 (Sigma Co., St. Louis., U.S.A. 분자량 136.1)을 이용하여 0.9 M의 용액을 제조한 다음 각각 용액의 농도를 정량 분석하였다.
- 일부 시편은 편광 현미경 (I221, 동원정밀, 한국) 하에서 증류수에 침윤시켜 배율 100배인 상태에서 디지털 카메라 (Coolpix 950 Nikon corporation, Japan)로 0일,1일,2일,3일째 사진 촬영하였다. 나머지 시편은 3일째micro-computed tomography (SKYSCAN 1076 High resolution in-vivo micro-CT system, Micro Photonics, U.S.A.)로 spatial resolution을 0.009mm로 설정하여 촬영을 시행하였다.
- 0인 네 가지의 재광화 용액에 12일간 처리하여 나타나는 무기질의 양적 변화를 편광 현미경에서 얻은 상에서의 탈회 깊이, 우식 표면층 깊이로 측정하였다. 또한 micro-CT를 이용하여 탈회와 재광화 후를 촬영하여 얻은 상으로부터 lesion 부위의 평균 density를 비교하였다.
- 01mm 표시된 슬라이드로 촬영한 상과 그 길이를 환산하여 각 군간 평균값을 계산하였다. 또한 우식 표면층 깊이는 표면에서 우식 표면층의 음성 복굴절 끝까지의 수직 길이를 위와 같은 방법으로 산출하였다. 이후 전체 탈회 깊이 변화율은 재광화 후 전체 탈회 깊이를 탈회 후 전체 탈회 깊이로 나누어 백분율로 확인하였고, 우식 표면층 깊이 변화율도 재광화 후 우식 표면층 깊이를 탈회 후 우식 표면층 깊이로 나누어 백분율로 확인하였다.
- 아래 기술된 Lactic acid, Calcium, Phosphate의 농도가 되도록 stock 용액으로부터 계산된 량을 취하고, 3.08 mM NaN3를 첨가한 다음 8N 수산화칼륨 표준용액으로 pH meter (Model 920A, Orion Research Inc., U.S.A.) 계측 하에 pH 4.3이 되도록 조절하였다. 위 용액을 ion chromatography (790 Personal Ion Chromatography, Metrohm, Switzerland)로 각 이온의 농도를 다시 정량 분석하여 이를 시편의 탈회 용액으로 사용하였다.
- 15 mm 두께로 연마하였다. 연마 후 초음파 세척기로 10분간 세정한 후 협설면 쪽의 손상이나 균열이 없는 부위 중 약 2 - 3 mm 정도의window를 제외하고 bonding agent (Scotchbond MP,3M, U.S.A.)와 nail varnish를 도포하였다. 먼저 얻은 치관 1/2은 역시 손상이나 균열이 없는 법랑질 부위에 약 2 mm x 2 mm 정도의 window를 형성하고 나머지 부위는 nail varnish를 도포하고 건조시켰다.
- 우식이 없고 탈회되지 않은 발거한 구치를 선택하여 치면에 부착된 연조직과 치석을 periodontal curette으로 제거하고 불소가 포함되지 않은 연마제로 치면을 연마한 다음초음파 세척기로 10분간 세정하고 증류수로 세척 건조하였다.
- 이 실험에서 사용한 탈회 용액과 재광화 용액의 pH, 포화도, 유산의 농도 등은 법랑질에 대해 여러 가지 조건을 변화시켰던 이전의 실험 결과를 토대로 조성하였는데, 우선 시편의 탈회 과정에서는 이전의 연구 결과를 바탕으로 pH를 4.3으로 정하였다. 박 등15), 오 등16)의 실험에서 인공 우식부위가 와동의 형성 없이 법랑질에서 표면하층이 관찰되면서 우식이 가장 잘 일어날 수 있는 pH로 정한 것이다.
- 이 실험에서 탈회된 시편을 재광화 시키기 위하여 불소 농도를 2 ppm, pH를 4.3 혹은 6.0으로 정하고 칼슘과 인 이온 농도에 의한 포화도를 일정하게 하였는데 재광화 용액중 pH를 4.3으로 정한 것은 이전의 실험에서 중성에 가까운 pH 실험에서 재광화 시 무기질의 침착이 표층 부위에 국한되어 일어났기 때문에 탈회의 과정과 동시에 탈회된 병소의 심층부에서의 무기질 침착 효과를 보기 위하여 pH 4.3인 Group 1, 2, 3, 4군을 시행하였다. 또한 이에 대한 대조로 pH 6.
- 이 실험에서 탈회와 재광화를 거친 후 평가하는 방법으로 크게 두 가지를 선택하였는데, 하나는 0.15 mm의 시편을 이용한 편광 현미경 관찰이었고, 나머지는 micro-CT를 이용한 탈회 부위의 평가였다. Micro-CT를 이용하여 상을 얻은 후 Photoshop program을 이용하여 재광화 전과 후의상을 겹쳐서 동일 면적을 얻은 다음 Scion Image program을 이용하여 density를 얻고 그 수치를 Spreadsheet pro-gram (Excel)을 이용하여 다시 graph로 구성하여 비교한 바 육안으로 확인된 내용보다 더 정확한 수치를 통한 비교가 가능하였다.
- 이 실험의 재광화 용액에서 유산의 농도를 100, 50, 25, 10 mM로 달리하는 군을 제조하였는데, 여기서 유산은 탈회 현상을 일으킨다. 초기 치아 우식의 진행에 영향을 미치는 요소로 Gray와 Francis18)는 이온화 되지 않은 산의 농도와 pH, 산의 해리 상수 등이 영향을 준다고 하였으며, Featherstone 등19)은 이온화되지 않은 산의 농도가 가장중요한 요소라 하였다.
- 이 연구에서는 유산 완충 탈회 용액을 이용하여 법랑질을 탈회시키고, 유산의 농도가 100, 50, 25, 10mM이고 pH가 4.3인 네 가지의 재광화 용액에 10일, pH 6.0인 네 가지의 재광화 용액에 12일간 처리하여 나타나는 무기질의 양적 변화를 편광 현미경에서 얻은 상에서의 탈회 깊이, 우식 표면층 깊이로 측정하였다. 또한 micro-CT를 이용하여 탈회와 재광화 후를 촬영하여 얻은 상으로부터 lesion 부위의 평균 density를 비교하였다.
- 이에 이 연구는 유산 완충 용액의 pH 및 유산의 농도 변화에 따른 법랑질에서 인공 우식 병소의 재광화 양상을 편광 현미경과 micro-computed tomography (micro-CT)를 이용하여 비교 관찰하였다.
- 또한 우식 표면층 깊이는 표면에서 우식 표면층의 음성 복굴절 끝까지의 수직 길이를 위와 같은 방법으로 산출하였다. 이후 전체 탈회 깊이 변화율은 재광화 후 전체 탈회 깊이를 탈회 후 전체 탈회 깊이로 나누어 백분율로 확인하였고, 우식 표면층 깊이 변화율도 재광화 후 우식 표면층 깊이를 탈회 후 우식 표면층 깊이로 나누어 백분율로 확인하였다.
- 50ml 플라스틱 통에 탈회 완충용액 30ml을 채우고 시편이 잠기도록 설치한 후 섭씨 25℃ 항온조에 3일간 반응시켰다. 일부 시편은 편광 현미경 (I221, 동원정밀, 한국) 하에서 증류수에 침윤시켜 배율 100배인 상태에서 디지털 카메라 (Coolpix 950 Nikon corporation, Japan)로 0일,1일,2일,3일째 사진 촬영하였다. 나머지 시편은 3일째micro-computed tomography (SKYSCAN 1076 High resolution in-vivo micro-CT system, Micro Photonics, U.
- 편광 현미경을 이용하여 시편을 100배로 관찰하고 현미경에 연결된 디지털 카메라로 촬영한 후, 전체 탈회 깊이의 평가를 위해 임의의 각기 다른 지점에서 다섯 부위를 선택하여 표면층에서 양성 복굴절 끝까지 수직 길이를 측정하고 0.01mm 표시된 슬라이드로 촬영한 상과 그 길이를 환산하여 각 군간 평균값을 계산하였다. 또한 우식 표면층 깊이는 표면에서 우식 표면층의 음성 복굴절 끝까지의 수직 길이를 위와 같은 방법으로 산출하였다.
대상 데이터
- 30% 유산용액 (Sigma Co., St. Louis., U.S.A. 분자량90.09, 밀도 1.080)을 이용하여 1 M의 유산용액을 제조하고, 염화칼슘분말 (Sigma Co., St. Louis., U.S.A. 분자량147.0)을 이용하여 0.3 M의 용액을 제조하였다. 그리고 인산칼륨분말 (Sigma Co.
데이터처리
- 15 mm의 시편을 이용한 편광 현미경 관찰이었고, 나머지는 micro-CT를 이용한 탈회 부위의 평가였다. Micro-CT를 이용하여 상을 얻은 후 Photoshop program을 이용하여 재광화 전과 후의상을 겹쳐서 동일 면적을 얻은 다음 Scion Image program을 이용하여 density를 얻고 그 수치를 Spreadsheet pro-gram (Excel)을 이용하여 다시 graph로 구성하여 비교한 바 육안으로 확인된 내용보다 더 정확한 수치를 통한 비교가 가능하였다.
성능/효과
- 1. pH 4.3에서 유산 농도가 증가할수록 우식 표면층의 증가와 표층하 탈회부 중 심층부의 isotropic zone 등의 재광화 현상을 보이나, 전체 탈회 깊이 역시 증가하였다.
- 2. pH 6.0에서 우식 표면층에 국한된 재광화 현상을 보이고, 전체 탈회 깊이는 변화가 없었다.
- Group 1에서 전체 탈회 깊이의 변화률은 117.4 %로 재광화 기간이 증가함에 따라 더 증가함을 보였고, 2군은 109.4 %, 3군은 106.6 %, 4군은 104.1 %로 전체 탈회 깊이 증가량은 점차 줄었다. (Figure.
- 편광 현미경에서 물에 침윤하여 100배로 관찰한 결과, 전반적으로 우식 표면층은 비교적 연속적으로 관찰되었다. 법랑질 초기 우식 병소의 특징적인 건전 표층 (surface zone)과 표층하 탈회부 (subsurface lesion)를 관찰할 수 있었는데, 건전 표층은 정상 법랑질과 같은 음성 복굴절을 나타내었고, 병소 본체는 황갈색으로 관찰되었으며 양성 복굴절 양상을 보였다.
- 우식 표면층 깊이 변화는 1군에서 116.2 %로 재광화 후우식 표면층이 증가했음을 보여주고, 2군에서는 103.8 %로 우식 표면층 증가량이 1군에 비해 줄었으며, 3군과 4군에서는 재광화 전후 큰 변화가 없었다. (Figure.
- 이 실험 결과 포화도가 일정한 유산 완충 용액으로 재광화 유도시 pH가 낮고 유산의 농도가 높을수록 표면으로부터 심층부 동역학적 변화에 더 영향을 주었으며, micro-CT를 이용한 우식 병소 부위의 density 확인을 통해 무기질의 침착과 방출 현상을 객관적으로 평가할 수 있었다.
- 전체 탈회 깊이 변화율은 99.8 % 등 거의 탈회 후와 재광화 후 변화가 없음을 보여주고 있었다. (Figure.
- 일반적으로 재광화의 진행 양상은 우식 병소 전체 깊이가 감소하는 소견과 우식 표면층의 계속적인 증가 형태로 관찰되는데, 우식 병소 전체에 무기질이 침착하여 탈회가 적게 일어났던 병소의 가장자리부터 재광화 되는 양상을 보인다. 조직학적으로 우식 표면층은 1-5%, 우식 표면하층의 가장자리는 5%, 병소 자체는 25% 정도의 세공이 공간을 차지하는데, 무기질이 침착함에 따라 세공이 차지하는 비율이작은 가장자리에서부터 먼저 세공이 감소하면서 변화를 보이고, 우식 표면하층도 세공의 공간이 작았던 부위로부터 무기질이 침착하면서 세공의 부피가 감소하여 isotropic zone이 증가하는 양상을 보인다. 물을 용매로 편광 현미경 하에서 관찰시 5 %보다 적은 공간 존재 시에는 음성 복굴절 또는 고유 복굴절로 관찰되고, 5 %의 공간 존재 시에는 isotropic zone으로 관찰되었고, 5 %보다 많은 공간이 있는 경우는 양성 복굴절로 관찰된다고 하였다.
- 편광 현미경에서 물에 침윤하여 100배로 관찰한 결과, 전반적으로 우식 표면층은 비교적 연속적으로 관찰되었다. 법랑질 초기 우식 병소의 특징적인 건전 표층 (surface zone)과 표층하 탈회부 (subsurface lesion)를 관찰할 수 있었는데, 건전 표층은 정상 법랑질과 같은 음성 복굴절을 나타내었고, 병소 본체는 황갈색으로 관찰되었으며 양성 복굴절 양상을 보였다.
후속연구
- 즉, 표면층에 국한된 재광화가 아닌 심부까지 도달하는 재광화를 일으킬 수 있는 동시에 탈회 깊이는 줄일 수 있는 최적의 조건을 찾는 노력이 계속되어져야 한다. 또한 탈회나 재광화의 현상 관찰시 주로 탈회 깊이나 형성된 표면층의 두께에 대한 연구가 주로 되어 왔는데, 재광화되는 심부의 변화를 알기 위하여서는 촬영된 이미지의 density를 측정함으로써 육안으로 확인할 수 없는 것들의 변화를 관찰하는 실험이 필요하리라 생각된다.
- 이번 실험에서는 같은 pH에서 유산의 농도를 다르게 했을 때의 현상을 확인하였는데, 유산의 농도 범위를 더 좁혀 시행할 필요가 있으며, 유산과 pH와의 관계를 다각적으로 설정하고 해석할 필요가 있겠다. 즉, 표면층에 국한된 재광화가 아닌 심부까지 도달하는 재광화를 일으킬 수 있는 동시에 탈회 깊이는 줄일 수 있는 최적의 조건을 찾는 노력이 계속되어져야 한다.
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