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문제 정의
- 본 연구에서 IL-23가 IL-1β와 TNF-α 같은 염증성 사이토카인을 통해서 환자의 활액내 세포에서 발현이 증가되는 것을 조사하였고, 흥미롭게도 IL-17에 의해서 IL-23p19의 생성이 현저하게 증가됨을 세포와 세포배양액에서 조사하였다.
- 본 연구에서는, 류마티스 관절염 환자의 활액내 세포에서 Th17 세포에서 분비되는 IL-17과 염증성 사이토카인에 의해서 IL-23 p19이 생성되는지 조사하였다.
- 또한, 대표적 염증성사이토카인인 IL-1β 역시 IL-17과 IL-23 모두 유도할 수 있고 특히 IL-23 생성에는 IL-17과 동시에 상승 작용을 유도하는 것을 조사하였다. 이러한 IL-17에 의한 IL-23p19의 증가를 T세포를 제외한 비자기 T세포에서 조사해 본 결과 활액 단핵세포 실험과 유사한 결과를 확인하였다. IL-17이 직접적으로 비자기 세포를 자극하여 IL-23p19의 발현을 유도하는 것과 IL-1b와 함께 동시에 자극하면 IL-23p19 발현이 더욱 활성화 되는 것을 조사하였다.
제안 방법
- 4% 파라포름알데하이드에 고정된 각 활막(류마티스 관절염 환자, 골관절염환자) 조직을 통상의 방법대로 파라핀에 포매한 후 절편기를 이용하여 7 um절편을 만들어 슬라이드에 붙인 후 헤마톡실린과 에오진(hematoxylin-eosin) 염색을 하여 광학현미경으로 관찰하였다. 사이토카인의 발현의 측정은 면역조직화학 염색방법으로 ABC (Vector laborites, Burlingame, CA, USA) kit를 사용하여 염색하였으며, 슬라이드에 부착된 절편을 자일렌과 에탄올로 탈파라핀과 함수를 시킨 후 3% H2O2로 내인성과산화효소를 차단시키고, 인산화 완충액(phosphate buffered saline, PBS)으로 수세한다.
- 이러한 IL-17에 의한 IL-23p19의 증가를 T세포를 제외한 비자기 T세포에서 조사해 본 결과 활액 단핵세포 실험과 유사한 결과를 확인하였다. IL-17이 직접적으로 비자기 세포를 자극하여 IL-23p19의 발현을 유도하는 것과 IL-1b와 함께 동시에 자극하면 IL-23p19 발현이 더욱 활성화 되는 것을 조사하였다. 류마티스관절염 환자의 활액세포를 활성화 시키기 위해 LPS로 자극하여 IL-23발현과 생성을 증가 시킨 조건에서 IL-17, IL-1β, TNF-α 이들사이토카인의 분비를 억제하는 중화항체를 사용하여 세포에 처리하여 IL-23 발현과 생성을 조사하였고 이때 IL-17을 차단하는 항체를 처리하면 활액세포에서 증가되어 있던 IL-23의 발현과 생성이 억제 되었다.
- Mayer's 헤마톡실린으로 대조염색한 후 수세하고 봉입 하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- 관절염 환자의 말초혈액과 활액에서 단핵세포를 분리하여 IL-23p19의 발현을 비교하였다. 세포들을 분리 한 후, 순수 배양액에서 세포 배양후 세포내 IL-23p19의 mRNA 발현을 RT-PCR로 조사하였으며 이때 말초혈액 단핵세포에 비하여 활액 단핵 세포에서 IL-23p19의 mRNA 발현이 통계적으로 유의하게 증가되었다(Fig.
- 또한, 대표적 염증성사이토카인인 IL-1β 역시 IL-17과 IL-23 모두 유도할 수 있고 특히 IL-23 생성에는 IL-17과 동시에 상승 작용을 유도하는 것을 조사하였다.
- 류마티스관절염 환자 활액 단핵세포를 LPS로 자극하여 세포 활성을 유도한 후, IL-17, IL-1β, TNF-α이들의 중화항체를 사+용하여 이들의 신호전달을 차단했을 때 IL-23p19발현과 생성이 조절되는지 조사하였다.
- 류마티스관절염 환자와 골관절염 환자의 활막 조직에서, 관절 활막내 면역세포의 침윤과 IL-23, IL-17, IL-1β, TNF-α의 발현 양상을 헤마톡실린/에오진, 조직 면역화학염색을 통하여 확인 하였다.
- 류마티스관절염 환자의 활액세포를 활성화 시키기 위해 LPS로 자극하여 IL-23발현과 생성을 증가 시킨 조건에서 IL-17, IL-1β, TNF-α 이들사이토카인의 분비를 억제하는 중화항체를 사용하여 세포에 처리하여 IL-23 발현과 생성을 조사하였고 이때 IL-17을 차단하는 항체를 처리하면 활액세포에서 증가되어 있던 IL-23의 발현과 생성이 억제 되었다.
- 대상자의 성별은 여성이 30명 이상이며, 평균나이는 56±2세이다. 본 연구는 가톨릭중앙의료원 임상연구관리 규정을 준수하여 실험하였다.
- 비특이적인 반응을 차단할 목적으로 anti-mouse serum을 30분 반응시킨 후 primary Ab를 4℃에서 IL-1b,IL-17, IL-23p19, TNF-a (R&D systems, 1：100)을 다음날(16∼18 h)까지 반응시켰다.
- 4% 파라포름알데하이드에 고정된 각 활막(류마티스 관절염 환자, 골관절염환자) 조직을 통상의 방법대로 파라핀에 포매한 후 절편기를 이용하여 7 um절편을 만들어 슬라이드에 붙인 후 헤마톡실린과 에오진(hematoxylin-eosin) 염색을 하여 광학현미경으로 관찰하였다. 사이토카인의 발현의 측정은 면역조직화학 염색방법으로 ABC (Vector laborites, Burlingame, CA, USA) kit를 사용하여 염색하였으며, 슬라이드에 부착된 절편을 자일렌과 에탄올로 탈파라핀과 함수를 시킨 후 3% H2O2로 내인성과산화효소를 차단시키고, 인산화 완충액(phosphate buffered saline, PBS)으로 수세한다. 비특이적인 반응을 차단할 목적으로 anti-mouse serum을 30분 반응시킨 후 primary Ab를 4℃에서 IL-1b,IL-17, IL-23p19, TNF-a (R&D systems, 1：100)을 다음날(16∼18 h)까지 반응시켰다.
- 세포 배양액 내에서도 역시 IL-17과 IL-1β의 차단에 의해 IL-23p19 분비가 됨을 조사하였다(Fig. 5B).
- 관절염 환자의 말초혈액과 활액에서 단핵세포를 분리하여 IL-23p19의 발현을 비교하였다. 세포들을 분리 한 후, 순수 배양액에서 세포 배양후 세포내 IL-23p19의 mRNA 발현을 RT-PCR로 조사하였으며 이때 말초혈액 단핵세포에 비하여 활액 단핵 세포에서 IL-23p19의 mRNA 발현이 통계적으로 유의하게 증가되었다(Fig. 2A). 배양한 세포 배양액에서 IL-23 생성을 Sandwich ELISA로 조사하였고 이때 IL-23 생성양도 말초혈액 단핵 세포에 비하여 활액 단핵세포에서 IL-23p19의 생성이 통계적으로 유의하게 증가되었다(Fig.
- Buffy coat 층만을 따서 새 tube에 담은 후 PBS로 세척하고 세포 수를 계산한 다음 활액 단핵세포를 사용하였으며, non T 세포의 사용은 CD3+ T 세포를 MACs bead를 이용해서 분리 하여 제거한 후 사용하였다. 세포를 anti-human CD3+ Micro beed (Milteny biotec, Bergisch Gladbach, Germany)와 4℃, 15분간 반응 시킨 후, 1% BSA, 2 mM EDTA (Amresco Ohio USA)가 포함된 PBS용액(pH7.4) 으로 세척하고 Column (Milteny biotec)을 통과시켜 양성 분획으로 CD3+ T세포를 분리하였다.
- 염기서열은 (5'→3'): IL-23p19 sense GCA GAT TCC AAG CCT CAG TC, IL-23p19 anti sense TTC AAC ATA TGC AGG TCC CA and glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) sense CGA TGC TGG GCG TGA C, GAPDH anti sense CGT TCA GCT CAG GGA TGA CC를 사용하여, 94℃에서 30초, GAPDH 55℃/IL-23p19 60℃에서 1분, 55℃에서 25회 시행하였다.
- 개의 세포를 세포 배양액 1 ml에 넣어 24 well plate (costar, Cambridge, MA)에 부유한 후 LPS 자극 또는 자극 없이 12시간 동안 37℃ 배양기에서 배양 하였다. 위와 같이 처리한 세포로부터 총 RNA를 RNA zol BTM (TEL TEST, Friendswood, TX)를 이용하여 추출하였다. 추출한 총 RNA를 주형으로 cDNA를 합성하기 위하여 0.
- 5 ul를 가하고 전체를 nuclease free water (Promeg, Madison, WI) 20 ul로 맞춘 뒤, 25℃ 10분, 42℃에서 60분, 72℃에서 10분간 반응시켰다. 이렇게 생성된 cDNA 산물을 이용하여 중합효소 연쇄 반응을 시행하였다. 본 실험에서 사용한 GAPDH, IL23p19의 시발체는 모두 Genotec Co (Seoul, Korea)에서 구입하였다.
- 위와 같이 처리한 세포로부터 총 RNA를 RNA zol BTM (TEL TEST, Friendswood, TX)를 이용하여 추출하였다. 추출한 총 RNA를 주형으로 cDNA를 합성하기 위하여 0.5 ug random ninemer (TakaRA, Shiga, JAPAN)와 70oC에서 5분 반응시킨 뒤 4℃에서 급냉 시킨 다음 10 mM dNTP mix (Invitrogen, Carlsbad, California) 1 ul, 역 전사 효소 M-MuLV (MBI Fermentas, Hanover, MD) 1unit, 5X M-MuLV 희석용액(MBI Fermentas) 4 ul, RNase Imhibitor (MBI Fermentas) 0.5 ul를 가하고 전체를 nuclease free water (Promeg, Madison, WI) 20 ul로 맞춘 뒤, 25℃ 10분, 42℃에서 60분, 72℃에서 10분간 반응시켰다. 이렇게 생성된 cDNA 산물을 이용하여 중합효소 연쇄 반응을 시행하였다.
- 활막 세포로부터 beed를 이용하여 CD3 T세포를 분리하여 제거한후 비자기 T세포만 획득하여 이들 세포에 IL-17 (1, 10 ng/ml), IL-1β(1, 10 ng/ml)와 TNF-α (1, 10 ng/ml)를 자극하여 IL-23p19의 발현을 조사하였다.
- 활액 단핵 세포를 분리하여, 세포에 IL-17 (1, 10 ng/ml), IL-1β(1, 10 ng/ml), TNF-α(1, 10 ng/ml)로 자극하여 이들이 IL-23p19의 발현에 어떠한 영향을 주는지 비교 조사하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 세포들은 56℃에서 1시간 동안 불활성화된 10% 우 태아 혈청, Penicillin (100 U/ml) Streptomycine (100 g/ml)이 포함된 세포 배양액(RPMI 1,640, Gibco BRL, USA)을 첨가와 1：1로 섞어 Ficoll과 배양액으로 희석한 활액을 1：4의 비율로 Ficoll 층이 흐트러지지 않게 50 ml tube에 천천히 띠운 다음 혈액을 2,000 rpm, 30분간 원심분리 하였다. Buffy coat 층만을 따서 새 tube에 담은 후 PBS로 세척하고 세포 수를 계산한 다음 활액 단핵세포를 사용하였으며, non T 세포의 사용은 CD3+ T 세포를 MACs bead를 이용해서 분리 하여 제거한 후 사용하였다. 세포를 anti-human CD3+ Micro beed (Milteny biotec, Bergisch Gladbach, Germany)와 4℃, 15분간 반응 시킨 후, 1% BSA, 2 mM EDTA (Amresco Ohio USA)가 포함된 PBS용액(pH7.
- LPS (SIGMA, USA), recombinant human IL-17 (1∼10 ng/ml (R&D, USA)), recombinant human IL-1β(1∼10 ng/ml)과 recombinant human TNF-α(1∼10 ng/ml (Endogen, USA))를 사용하였다.
- 이렇게 생성된 cDNA 산물을 이용하여 중합효소 연쇄 반응을 시행하였다. 본 실험에서 사용한 GAPDH, IL23p19의 시발체는 모두 Genotec Co (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 염기서열은 (5'→3'): IL-23p19 sense GCA GAT TCC AAG CCT CAG TC, IL-23p19 anti sense TTC AAC ATA TGC AGG TCC CA and glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) sense CGA TGC TGG GCG TGA C, GAPDH anti sense CGT TCA GCT CAG GGA TGA CC를 사용하여, 94℃에서 30초, GAPDH 55℃/IL-23p19 60℃에서 1분, 55℃에서 25회 시행하였다.
- 본 연구는 강남성모병원 류마티스 연구센터에서 1997년에 개정된 미국 류마티스 학회(American College of Rheumatology, ACR)의 RA 분류 기준을 4가지 이상 만족시키는 38명의 RA 환자를 대상으로 진행되었다. 대상자의 성별은 여성이 30명 이상이며, 평균나이는 56±2세이다.
- 중성화 항체로는 anti IL-17 10 ug/ml (R&D, USA), anti IL-1β(R&D, USA)와 anti TNF-α(R&D, USA)를 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 평균표준오차로 표현하였으며 통계적 유의성은 SPSS 통계 프로그램(version 11.5, Chicago, IC)을 사용하여 student's t-teat를 실시하였고 P값이 0.05이하 일 때 통계적으로 유의 하다고 분석하였다.
이론/모형
- 관절염 환자의 활액 세포(Synovial fluid mononuclear cells, SFMC)를 분리하기 위해서 관절내 활액(Synovial fluid)을 heparin으로 처리한 주사기를 이용하여 채취한 후 단핵구세포를 Ficoll-Paque TM (Amersham Biosciences, SWEDEN)를 이용하여 centriguge gradient법으로 분리하였다. 실험에 사용된 세포들은 56℃에서 1시간 동안 불활성화된 10% 우 태아 혈청, Penicillin (100 U/ml) Streptomycine (100 g/ml)이 포함된 세포 배양액(RPMI 1,640, Gibco BRL, USA)을 첨가와 1：1로 섞어 Ficoll과 배양액으로 희석한 활액을 1：4의 비율로 Ficoll 층이 흐트러지지 않게 50 ml tube에 천천히 띠운 다음 혈액을 2,000 rpm, 30분간 원심분리 하였다.
- 5 mM의 dNTP (Takara, Shiga, Japan)을 사용하였다. 증폭을 위해 Dual-bay Thermal cycler system (M Research)를 사용하였다. 음성 대조군으로 추출한 cDNA 대신 증류수를 사용하여 시행한 PCR반응에서 PCR 산물이 관찰되지 않도록 하여 PCR 오염이 없음을 확인하였다.
성능/효과
- IL-17, IL-1β, TNF-α 이들 사이토카인을 조합하여 자극해 본 결과, IL-23p19의 증가는 IL-17 단독에서보다 IL-1β를 함께 자극해주면 IL-1β와 TNF-α를 동시에 넣어준 조건과 함께 통계적으로 유의하게 IL-23p19 발현이 증가하였다.
- IL-17, IL-1β, TNF-α를 동시에 자극했을때 2개의 조합을 통해서 증가되었던 IL-23p19의 발현양보다 높게 증가시키지는 못하는 것으로 조사되었다(Fig. 3B).
- 그 결과, 류마티스관절염 활막조직내에 면역세포가 의미 있게 증가되어 있으며 IL-23p19, IL-17, IL-1β, TNF-α이 골관절염에서는 거의 발현 되지 않았으며, 류마티스관절염에서 이들 사이토카인 발현이 의미있게 증가되어 있음을 확인했다(Fig. 1).
- 류마티스관절염 환자의 활액세포에서 IL-23p19의 발현이 말초 혈액 세포 보다 통계적으로 유의하게 증가되었으며, IL-23 단백질 생성 도 활액세포 배양액에서 현저하게 높았다. 류마티스관절염 환자의 활막조직과 활액세포에서 모두 IL-23 발현과 생성이 의미있게 증가됨을 조사하였다. 이러한 염증성 사이토카인 IL-23p19이 환자의 혈액보다 활액 즉병인 조직과 관련된 부위의 체액에서 증가되어 있는 것은 질환병인 반응에 관여하는 것을 간접적으로 확인 하는 결과이다.
- 비 염증성 질환이기 때문에 이러한 염증성 사이토카인의 발현이 류마티스관절염에 비해 적은것으로 생각된다. 류마티스관절염 환자의 활액세포에서 IL-23p19의 발현이 말초 혈액 세포 보다 통계적으로 유의하게 증가되었으며, IL-23 단백질 생성 도 활액세포 배양액에서 현저하게 높았다. 류마티스관절염 환자의 활막조직과 활액세포에서 모두 IL-23 발현과 생성이 의미있게 증가됨을 조사하였다.
- 2A). 배양한 세포 배양액에서 IL-23 생성을 Sandwich ELISA로 조사하였고 이때 IL-23 생성양도 말초혈액 단핵 세포에 비하여 활액 단핵세포에서 IL-23p19의 생성이 통계적으로 유의하게 증가되었다(Fig. 2B).
- 본 연구에서는 류마티스관절염 환자의 관절 활막조직에서 염증성 사이토카인인 IL-23, IL-17, IL-1β, TNF-α가 퇴행성관절염 보다 증가되어 있음을 확인하였다.
- 증폭을 위해 Dual-bay Thermal cycler system (M Research)를 사용하였다. 음성 대조군으로 추출한 cDNA 대신 증류수를 사용하여 시행한 PCR반응에서 PCR 산물이 관찰되지 않도록 하여 PCR 오염이 없음을 확인하였다. PCR이 끝난 후의 반응물은 1.
- 이러한 결과로 TNF-α는 IL-23p19의 생성은 증가시키지만 IL-17과 함께 동시 상승작용에는 영향을 미치지 않는 것으로 보여진다.
- 하지만 TNF-α는 IL-17과 함께 자극시 이러한 효과는 관찰되지 않았다. 이러한 결과로 Th17 세포가 분화 할 때, IL-23가 필요한 것처럼 IL-23 의 발현과 생성에도 Th17세포가 발현하는 IL-17이 작용을 하는것으로 조사되었고 이러한 결과를 통해 IL-23와 IL-17을 세포들에서 상호 양성 피드백 역할을 하는것으로 생각된다. 또한, 대표적 염증성사이토카인인 IL-1β 역시 IL-17과 IL-23 모두 유도할 수 있고 특히 IL-23 생성에는 IL-17과 동시에 상승 작용을 유도하는 것을 조사하였다.
- 이와 같은 결과들로 볼 때 류마티스관절염환자의 관절내 활액 세포에서 IL-23p19는 IL-17에 의해 유도되며, IL-1β와 IL-17는 서로 상호 상승작용이 있어서 IL-23p19의 발현과 생성을 더욱 활성화 시킨다. 이러한 결과로 류마티스관절염 환자의 관절활액 세포에서 사이토카인 상호작용으로 인해 세포의 활성과 염증매개 반응이 더욱 가속화 되는 것을 규명하였다. 이들 사이토카인의 제어 기전을 연구하여 류마티스관절염과 같은 자가면역질환의 치료표적 물질 연구에 도움이 될것으로 기대된다.
- 이러한 비자기 세포 배양에서도 앞서 보였줬던 전체 활막 단핵세포에서 보여준 결과(Fig. 3A, B)와 동일하게 IL-17과 IL-β의해 IL-23p19의 발현이 의미있게 증가되었고(Fig. 4A) IL-17과 IL1β을 동시에 자극했을 때 IL-23p19의 발현이 의미있게 증가됨을 조사하였다(Fig. 4B).
- 흥미롭게도 LPS 자극을 통해 IL-23p19발현이 활성화된 활액 단핵세포들은 IL-17과 IL-1β를 차단하였을 때, IL-23p19의 발현이 통계적으로 유의하게 감소되었으며, 이들 두 개의 사이토카인을 동시에 차단하면 IL-23p19의 발현이 통계적으로 유의하게 더욱 감소됨을 조사하였다(Fig. 5A).
후속연구
- 이러한 결과로 류마티스관절염 환자의 관절활액 세포에서 사이토카인 상호작용으로 인해 세포의 활성과 염증매개 반응이 더욱 가속화 되는 것을 규명하였다. 이들 사이토카인의 제어 기전을 연구하여 류마티스관절염과 같은 자가면역질환의 치료표적 물질 연구에 도움이 될것으로 기대된다.
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