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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 고추 탄저병균인 C. acimm/m의 유전체 기능과 실내에서의 살균제 효과와 작용 특성을 규명하기 위하여 효과적으로 원형질체를 획득할 수 있는 적합한 조건을 확립하고, 획득한 원형질체를 이용하여 탄저병 방제에 사용되는 살균제의 효과와 작용 특성을 조사하고자 하였다.
- 또한 호흡저해제인 trifloxystrobin과 kresoxim-methyl이첨가된 재생배지에 SHAM을 같이 첨가하여 원형질체의 재생률에 미치는 두 살균제의 억제효과가 변화하는 지의 여부를 조사하였다.
제안 방법
- C. acutatum JC24로부터 원형질체를 얻기 위하여, 25°C 의 PDA에서 7일간 배양한 병원균의 균총에서 수확한 포자의 현탁액에서의 농도를 bl" conidia/mL로 조정하였다. 멸균한 셀로판막을 멸균수로 2회 세척하여 PDA에 치상한 후, 포자 현탁액을 100 ㎕씩 도말하고 25°C의 암 상태에서 정해진 시간동안 각각 배양하였다.
- 조사하였다. Colletotrichum acutatum JC24를 PDA 에 접종하여 25°C의 암상태에서 7일 동안 배양하였고, 접종원으로 사용하기 위해서 동일한 조건에서 다시 한 번 배양하였다. 균총의 균사 선단에서 직경 5 mm의 균사 조각을 떼어내어 각각의 살균제를 정해진 농도별로 첨가한 PDA 배지에접종하였다.
- 조사하였다. PDA 재생 배지에 개/mL로 조정한 원형질체를 50 μl 씩 도말하고 25°C의 암상태에서 5일간 배양한 후 형성된 균총의 수를 조사하여 재생율을 계산하였다. 삼투압 안정제의 농도가 탄저병균의 원형질체 재생율에 미치는 효과를 비교하기 위하여 PDA 배지에 삼투압 안정제로 sorbitol를 각각 0.
- Tebuconazole, carbendazim의 농도가 각각 0.1, 10 |jg mL-1이 되도록 첨가한 PDB에 원형질체를 접종하고, 재생되는 모습을 관찰하였다. Fig.
- 이상의 방법으로 균사체의 배양 시간, 세포벽 분해효소의 종류와 농도, 삼투압 안정제의 종류와 농도, buffer의 pH 등이 원형질체의 생성량에 미치는 영향을 조사하였다. 균사체는 25°C의 암상태에서 10, 15, 20시간 배양한 후, 수확하여 사용하였으며, 각각의 균사체에서 생성된 원형질체의 수를 조사하였다. 세포벽 분해효소로는 lysing enzyme(sigma No.
- 균사체로부터 수확한 원형질체는 삼투압 안정제인 sorbitol 을 첨가한 PDA 재생배지에 도말하여 재생율을 조사하였다. PDA 재생 배지에 개/mL로 조정한 원형질체를 50 μl 씩 도말하고 25°C의 암상태에서 5일간 배양한 후 형성된 균총의 수를 조사하여 재생율을 계산하였다.
- Colletotrichum acutatum JC24를 PDA 에 접종하여 25°C의 암상태에서 7일 동안 배양하였고, 접종원으로 사용하기 위해서 동일한 조건에서 다시 한 번 배양하였다. 균총의 균사 선단에서 직경 5 mm의 균사 조각을 떼어내어 각각의 살균제를 정해진 농도별로 첨가한 PDA 배지에접종하였다. 병원균을 접종한 PDA는 25°C의 암조건에서 7 일간 배양한 후 아래 공식에 의해서 균사 생장 억제율을 구하였다.
- 균총의 균사 선단에서 직경 5 mm의 균사 조각을 떼어내어 각각의 살균제를 정해진 농도별로 첨가한 PDA 배지에접종하였다. 병원균을 접종한 PDA는 25°C의 암조건에서 7 일간 배양한 후 아래 공식에 의해서 균사 생장 억제율을 구하였다.
- 37 x 106 개/mL로 가장 많은 원형질체를 얻을 수 있었다. 사용한 0.02 M phosphate buffer의 pH가 원형질체의 생성에 어떤 영향을 미치는 지를 조사하였다. Fig.
- 재생 배지는 25°C의 암상태에서 5일간 배양한 후, 형성된 균총의 수를 조사하였다. 살균제가 탄저병 균 원형질체 재생에 미치는 효과는 아래 식에서처럼 무처리 재생배지에서 형성된 균총 수에 대하여 살균제 처리 재생 배지에서의 균총 수를 비교하여 조사하였다.
- PDA 재생 배지에 개/mL로 조정한 원형질체를 50 μl 씩 도말하고 25°C의 암상태에서 5일간 배양한 후 형성된 균총의 수를 조사하여 재생율을 계산하였다. 삼투압 안정제의 농도가 탄저병균의 원형질체 재생율에 미치는 효과를 비교하기 위하여 PDA 배지에 삼투압 안정제로 sorbitol를 각각 0.3, 0.6, 0.9, 1.2 M씩 첨가하고 형성되는 콜로니 수를 비교하였다.
- 셀로판막 상에서 배양한 균사체의 배양 시간에 따른 원형질체 생성량을 조사하였다(Fig. 2). PDA에서 수확한 1 X 106 개/mL의 탄저병균의 포자를 100 ㎕씩 도말한 셀로판막 한 장당 20시간 배양한 균사체에서 1.
- 2 M 로 사용하였다. 실험에 사용한 0.02 M phosphate buffers] pH를 결정하기 위하여 6.2, 7.0, 7.6으로 pH를 각각 조절하여 실험하고, 생성되는 원형질체의 양을 조사하였다.
- 실험에 사용한 6종의 살균제는 각각의 종류에 따라서 처리한 농도를 달리 하였는데, propineb는 재생배지에서의 최종농도가 10, 5, 1 ng mL-1가 되도록, tebuconazole은 0.5와 0.1 μg mL-1, carbendazim과 carbendazim/diethofencarb^] 혼합제는 각각 100과 10 μg mL-1, trifloxystrobiri과 kresoxim・niethyl은 10과 1 ng mL, 가 되도록 재생 배지에 첨가하였다. 원제를 사용한 propineb, tebuconazole, carbendazim은 DMSO에 녹여 재생배지에 첨가하였으며, 배지에서의 최종농도는 1% 로 맞추었다.
- 1 μg mL-1, carbendazim과 carbendazim/diethofencarb^] 혼합제는 각각 100과 10 μg mL-1, trifloxystrobiri과 kresoxim・niethyl은 10과 1 ng mL, 가 되도록 재생 배지에 첨가하였다. 원제를 사용한 propineb, tebuconazole, carbendazim은 DMSO에 녹여 재생배지에 첨가하였으며, 배지에서의 최종농도는 1% 로 맞추었다. 다른 살균제는 멸균수에 고루게 현탁하여 배지에 첨가하였다.
- 47%, WG) 등을 선발하여 실험하였다. 원형질체의 재생을 위해서 삼투압 안정제인 sorbit이을 첨가한 PDA배지에 선발한 살균제를 정해진 농도별로 첨가하고, 수확한 원형질체(1 X 104 개/mL) 를 50㎕씩 도말하였다. 재생 배지는 25°C의 암상태에서 5일간 배양한 후, 형성된 균총의 수를 조사하였다.
- 셀로판막에 배양된 균사체는 25°C의 세포벽 분해효소에 2시간 처리하여 원형질체를 생성시켰으며, 삼투압 안정제로 2회 세척하고 멸균된 4겹의 거즈로 여과한 이후, 실험에 사용하였다. 이상의 방법으로 균사체의 배양 시간, 세포벽 분해효소의 종류와 농도, 삼투압 안정제의 종류와 농도, buffer의 pH 등이 원형질체의 생성량에 미치는 영향을 조사하였다. 균사체는 25°C의 암상태에서 10, 15, 20시간 배양한 후, 수확하여 사용하였으며, 각각의 균사체에서 생성된 원형질체의 수를 조사하였다.
- 원형질체의 재생을 위해서 삼투압 안정제인 sorbit이을 첨가한 PDA배지에 선발한 살균제를 정해진 농도별로 첨가하고, 수확한 원형질체(1 X 104 개/mL) 를 50㎕씩 도말하였다. 재생 배지는 25°C의 암상태에서 5일간 배양한 후, 형성된 균총의 수를 조사하였다. 살균제가 탄저병 균 원형질체 재생에 미치는 효과는 아래 식에서처럼 무처리 재생배지에서 형성된 균총 수에 대하여 살균제 처리 재생 배지에서의 균총 수를 비교하여 조사하였다.
- 셀로판막상에서 10시간 배양한 균사체에서는 생성되어 나온 원형질체를 확인하기가 어려웠다. 탄저병균의 원형질체 생성을 위해서 사용한 lysing enzyme과 driselase 를 사용하였는데, Fig. 3에서 보는 것과 같이 driselase의 처리구에서는 원형질체가 전혀 생성되지 않았다. 그러나 lysing enzyme을 처리하였을 때에는 0.
- 탄저병균의 원형질체를 재생 PDB배지에 접종하고 재생되는 모습을 관찰하였다(Fig. 6). 접종 6시간 후부터 대부분의원형질체에서 발아관이 생성되는 것을 관찰할 수 있었으며, 12시간 후에는 생성된 발아관이 정상적인 균사로 분화하는것을 알 수 있었다.
대상 데이터
- 양의 원형질체를 수확할 수 있었다. 삼투압안정제로는 1.2 M sorbitol을 사용하였고, 세포벽분해효소로는 2%의 lysing enzyme을 사용하였다. pH는 0.
- 균사체는 25°C의 암상태에서 10, 15, 20시간 배양한 후, 수확하여 사용하였으며, 각각의 균사체에서 생성된 원형질체의 수를 조사하였다. 세포벽 분해효소로는 lysing enzyme(sigma No. L1412)과 driselase(sigma No. D9515)를 각각 0.5, 1, 2%로 사용하였으며, 삼투압 안정제로는 KC1 과 mannitol, sorbitol을 0.3, 0.6, 0.9, 1.2 M 로 사용하였다. 실험에 사용한 0.
- 균총의 선단에서 직경 5 mm의 균사조각을떼어내어 Cryotube™(직경; 12 mm, 높이; 48 mm)에 5조각씩 넣고, 1 mL의 멸균수를 넣어 상온에서 보관하였다. 실험에 사용하고자 할 때에는 보관 중인 균주를 PDA에 접종하여 25°C의 PDA배지에서 7일간 배양한 후, 실험에 사용하였다.
- 탄저병균 원형질체의 재생에 미치는 효과를 조사하기 위하여 보호용 살균제인 propineb(a.i. 93%, 원제), ergostrol 생합성 저해제인 tebuconazole(a.i. 99%, 원제), P-tublin 생합성 저해제인 carbendazim(a.i. 90%, 원제), carbendazim 과 diethofbncarb의 혼합제(a.i. 50%, WP), 호흡저해제인 trifloxystrobin(a.i. 22%, SC), kresoxim-methyl(a.i. 47%, WG) 등을 선발하여 실험하였다. 원형질체의 재생을 위해서 삼투압 안정제인 sorbit이을 첨가한 PDA배지에 선발한 살균제를 정해진 농도별로 첨가하고, 수확한 원형질체(1 X 104 개/mL) 를 50㎕씩 도말하였다.
이론/모형
- 위에서 선발한 살균제가 고추 탄저병균인 Colletotrichum acutatum JC24의 균사 생장에 미치는 억제 효과를 한천희석법으로 조사하였다. Colletotrichum acutatum JC24를 PDA 에 접종하여 25°C의 암상태에서 7일 동안 배양하였고, 접종원으로 사용하기 위해서 동일한 조건에서 다시 한 번 배양하였다.
성능/효과
- Aspergillus flavusS\- Penicillium chrysogenum 등과 같은 사상균의 삼투압 안정제로는 일반적으로 무기염이 효과가 우수하며, Saccharomyces와 같은 효모의 경우는 다당류가 좋은 효과를 나타낸다고 보고되어있다(Moore와 Peberdy, 1976; Peberdy 등, 1976; Stephen과 Nasim, 1981). C. acutatum 역시 0.9 M의 농도로 KC1 과 mannitol 또는 sorbitol을 비교하여 보면 KC1 의 경우가 원형질체를 더 많이 수확할 수 있지만, 1.2 M의 농도에서는 sorbitol을 사용하였을 때, 무기 염 인 KC1 보다 많은 원형질체를 수확할 수 있었다. 특히 C.
- 11과 같이 trifloxystrobin 처리구에서 나타난 균총을 무처리구의 균총과 비교하면, 균총의 직경이 작아져 있는 것을 알 수 있었다. Fig. 10에서 trifloxystrobin뿐만 아니라 kresoxim-methyl 역시 탄저병균 원형질체의 재생률에는 전혀 영향을 미치지 않고 있었지만, SHAM을 재생배지에 살균제와 동시에 처리하였을 경우에는 trifloxystrobin과 kresoxim-methyl 모두 10 과 1 Ug ml「의 처리구에서 15.1 과 2.1%, 0과 21.9%이었던 재생 억제율이 SHAM을 처리한 처리구에서는 64.7과 20.7% 와 91.8과 71.3%로 증가하였다.
- 1, 10 |jg mL-1이 되도록 첨가한 PDB에 원형질체를 접종하고, 재생되는 모습을 관찰하였다. Fig. 9에서 보는 것과 같이 접종하고 12 시간 후에 조사하면, 무처리구에 접종한 원형질체는 정상적인 균사체로 분화되어 있는데 비해서 tebuconazole 처리 구에서는 2차 분지하는 균사의 절간 거리가 짧아져 있으며, 분지한 균사의 길이 역시 무처리구에 비하여 신장이 크게 억제되어있는 것을 볼 수 있었다. Carbendazim 처리구에서는 원형질체가 균사체로 분화하는 과정에서 2차 분지되는 균사의 분지각도가 90。에 가깝게 증가해 있는 것을 볼 수 있으며, 재생된 균사의 선단이 만곡되어 있는 것을 알 수 있었다.
- PDA 위의 셀로판막에서 20시간 배양한 균사체에 세포벽 분해 효소를 처리하고 30분 후부터 Fig. 1에서 보는 것과 같이 직경 6.75 ㎍의 원형질체가 형성되는 것을 관찰할 수 있었다. 세포벽 분해효소를 처리하는 시간이 길어짐에 따라서 원형질체의 크기도 증가하는 것을 알 수 있었다.
- 배양 24시간 후에는 정상적인 균사체로발달한 것을 볼 수 있었다. PDA 재생배지에서 삼투압 안정제로 사용한 sorbitoP] 원형질체의 재생률에 미치는 영향을 조사한 결과, Fig. 7과 같이 사용한 농도가 1.2 M의 경우에 재생률은 2.8%로 사용한 모든 농도 중에서 가장 높은 재생률을 보였다. 그러나 실험에 사용한 모든 농도 간에 통계적인유의성은 인정되지 않았다.
- 2). PDA에서 수확한 1 X 106 개/mL의 탄저병균의 포자를 100 ㎕씩 도말한 셀로판막 한 장당 20시간 배양한 균사체에서 1.17 X 106 개/mL의 원형질체를 얻을 수 있었다. 셀로판막상에서 10시간 배양한 균사체에서는 생성되어 나온 원형질체를 확인하기가 어려웠다.
- Tebuconazole은 병원균의 ergosterol 생합성을 저해하는 살균제로 알려져 있다(Ziogas 등, 1991). Tebuconazole을 원형질체에 0.5와 0.1 μg ml을처리하였을 때, 재생 억제효과는 100과 0.9%이었으나, 동일한 농도에서 균사생장에 대한 억제효과는 85.1 와 75.7%로 나타났다. Ergosterol 생합성 저해 살균제는 식물병원진균의 sterol 대사 과정을 억제하여 균사의 생장을 억제할 뿐만 아니라 높은 농도에서는 세포막의 투과성에도 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다(Sancholle 등, 1983; Dahmen 등, 1988).
- 8%인데 비하여, 10 ng 처리 구에서의 원형질체 재생은 100% 억제되었다. Tebuconazole의 경우에는 0.5 ng mL의 처리구에서 원형질체의 재생은 100% 억제되었지만, 균사생장은 85.1%가 억제되었다. 하지만 0.
-
고찰
고추 탄저병균으로부터 원형질체를 얻기 위하여 25°C에서 20시간 배양한 탄저병균의 균사체를 사용하였을 때 가장 많은 양의 원형질체를 수확할 수 있었다. 삼투압안정제로는 1.
- 58 X 106 개/mL로, 그 수가 급격하게 증가하였다. 모든 삼투압 안정제를 1.2 M로 처리하였을 경우에는, 사용한 KC1, mannitol, sorbitol 모두에서 1.70 x 106 개/mL 이상의 원형질체를 얻을 수 있었으며, 그 중에서 sorbitol의 경우가 2.37 x 106 개/mL로 가장 많은 원형질체를 얻을 수 있었다. 사용한 0.
- 미토콘드리아의 호흡을 저해하는 것으로 알려져 있는 trifloxystrobin은 탄저병균의 원형질체 재생률에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(Fig. 10). 그러나 Fig.
- 보호용 살균제인 propineb는 50 |ig mL'1 처리 구에서 균사 생장 억제 효과가 43.8%인데 비하여, 10 ng 처리 구에서의 원형질체 재생은 100% 억제되었다. Tebuconazole의 경우에는 0.
- Ergosterol 생합성 저해 살균제는 식물병원진균의 sterol 대사 과정을 억제하여 균사의 생장을 억제할 뿐만 아니라 높은 농도에서는 세포막의 투과성에도 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다(Sancholle 등, 1983; Dahmen 등, 1988). 본 실험의 결과를 보면 tebuconazole의 0.1 |ig mL1 처리에서는 원형질체가 크기는 작지만 균총을 형성하고 있었는데, 이는 세포막의 투과성에는 직접적으로 영향을 미치지 못하고 균사의 생장만을 억제하였기 때문이라고 생각한다. 하지만 0.
- 75 ㎍의 원형질체가 형성되는 것을 관찰할 수 있었다. 세포벽 분해효소를 처리하는 시간이 길어짐에 따라서 원형질체의 크기도 증가하는 것을 알 수 있었다.
- 원형질체를 이용한 살균제의 재생 억제 효과와, 한천 희석법으로 균사 생장 억제 효과를 비교하여 보면 살균제의 효과에 차이가 있었다 보호용 살균제인 prcpineb의 경우 10 ug mL의 처리 구에서 균사생장 억제효과는 43.8%이었지만, 원형질체의 재생은 100% 억제되었다. 김 등(2003)은 micrititer plate를 사용하여 propineb가 C.
- 0으로 조절하여 실험을 수행하였다. 원형질체의 재생을 위해서는 PDA 배지에 삼투압안정제로 첨가한 sorbitol 의 농도를 1.2 M로 조절하였을 때, 2 - 10%의 재생률을 보였다. 이상의 방법으로 살균제의 효과를 실험하는데 충분한 양의 원형질체를 얻을 수 있었으며, 재생률에 대한 효과를 검정함으로써 살균제가 가지는 다양한 특성을 조사할 수 있었다.
- 하지만 carbendazim 과 diethofencarb의 혼합제가 원형질체의 재생을 전혀 억제하지 못하는 이유는 다른 보충 실험들을 통해서 찾아보아야 할 것으로 판단한다. 이상의 결과를 보면 세포벽이 없는 원형질체에 살균제를 처리할 경우는, 균체 내부로 살균제가 흡수되는 양과 경향이 세포벽을 가지는 포자나 균사와는 매우 다를 것으로 예측되고, 그에 따라서 균사 생장 억제와 원형질체의 재생 억제 효과가 다르게 나타나는 것이 아닌가 생각한다.
- 2 M로 조절하였을 때, 2 - 10%의 재생률을 보였다. 이상의 방법으로 살균제의 효과를 실험하는데 충분한 양의 원형질체를 얻을 수 있었으며, 재생률에 대한 효과를 검정함으로써 살균제가 가지는 다양한 특성을 조사할 수 있었다.
- 6). 접종 6시간 후부터 대부분의원형질체에서 발아관이 생성되는 것을 관찰할 수 있었으며, 12시간 후에는 생성된 발아관이 정상적인 균사로 분화하는것을 알 수 있었다. 배양 24시간 후에는 정상적인 균사체로발달한 것을 볼 수 있었다.
- 1%가 억제되었다. 하지만 0.1 Hg mL1 처리구에서 원형질체 재생 억제효과는 0.9%로 거의 억제하지 못하는 수준이었지만, 균사생장은 75.7%나 억제하고 있었다. Fig.
후속연구
- actaum에 대한 strobilurin 계 살균제의 효과 검정이 어려워서 살균제 저항성 발현에 대한 모니터 링을 수행할 수가 없었다. 그러나 본 실험의 결과처럼 탄저병균의 원형질체에 strobilurin계 살균제와 SHAM을동시 처리한다면 실내실험에서도 strobilurin계 살균제의 효과 검정이 가능할 것이며, 또한 식물 병원균의 살균제 저항성발현에 대한 모니터링할 수 있을 것으로 생각한다.
- 특히 SHAM이라는 대체호흡을 억제하는 저해제와 동시 처리함으로써 trifloxystrobin과 kresoxim-methyl과 같은 strobilurin계 살균제의 실내검정이 가능해져서 저항성 발현에 대한 모니터링을 수행할 수 있을 것으로 생각한다. 또한 C. actaum에서 얻은 원형질체를 이용함으로써 REMI 방법을 통한 다양한 인공 돌연변이균의 확보가 가능해져서, 고추 탄저병 균의 유전자 기능을 연구하는데 도움이 될 수 있을 것으로 생각한다.
- 이싱과 같이 고추 탄저병균인 C. actaum에 세포벽 분해효소를 처리함으로써 원형질체를 쉽게 얻을 수 있었는데, 수확한 원형질체는 살균제의 특성을 조사하는데 충분히 이용할 수 있을 것으로 판단한다. 특히 SHAM이라는 대체호흡을 억제하는 저해제와 동시 처리함으로써 trifloxystrobin과 kresoxim-methyl과 같은 strobilurin계 살균제의 실내검정이 가능해져서 저항성 발현에 대한 모니터링을 수행할 수 있을 것으로 생각한다.
- actaum에 세포벽 분해효소를 처리함으로써 원형질체를 쉽게 얻을 수 있었는데, 수확한 원형질체는 살균제의 특성을 조사하는데 충분히 이용할 수 있을 것으로 판단한다. 특히 SHAM이라는 대체호흡을 억제하는 저해제와 동시 처리함으로써 trifloxystrobin과 kresoxim-methyl과 같은 strobilurin계 살균제의 실내검정이 가능해져서 저항성 발현에 대한 모니터링을 수행할 수 있을 것으로 생각한다. 또한 C.
- 8-Tubulin의 중합을 억제하는 것으로 알려진 caibendazim의 경우(Davidse, 1986), 100 ug mL의 처리 구에서 균사생장 억제율보다 재생억제율이 떨어지는 경향이 보였지만 통계적인 유의성은 인정할 수 없었다. 하지만 carbendazim 과 diethofencarb의 혼합제가 원형질체의 재생을 전혀 억제하지 못하는 이유는 다른 보충 실험들을 통해서 찾아보아야 할 것으로 판단한다. 이상의 결과를 보면 세포벽이 없는 원형질체에 살균제를 처리할 경우는, 균체 내부로 살균제가 흡수되는 양과 경향이 세포벽을 가지는 포자나 균사와는 매우 다를 것으로 예측되고, 그에 따라서 균사 생장 억제와 원형질체의 재생 억제 효과가 다르게 나타나는 것이 아닌가 생각한다.
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