DNA 메틸화는 조직특이적인 유전자 조절에 관여하고, 정상적인 배 발달에 필수적이다. POU5F1은 octamer-binding transcription factor 4 (Oct-4)를 encode하며, 초기 분화에 중요한 전사인자이다. 본 실험에서 소의 Oct-4가 조직특이적이고 발달의존적인 epigenetic 표지 인지를 검토하고자, 착상 전 수정란에서 Oct-4 전사산물과 상류 promoter 영역의 CpGs의 메틸화를 조사하였다. Oct-4 전사산물은 정자 그리고 2-cell에서 8-cell 수정란까지 낮은 수준으로 존재하지만, 상실배와 배반포에서 높게 검출되었다. 이러한 결과는 배 발달 과정의 상실배 단계에서 Oct-4의 de novo 발현이 시작됨을 의미한다. Oct-4 상류 promoter 영역에는 메틸화 가변 영역 (tissue-dependent differentially methylated region, T-DMR)이 존재한다. Oct-4 메틸화 가변 영역의 메틸화 상태는 정자, 성체 체조직과 난자에서 서로 다르고, 수정란으로부터 배반포 단계까지 변화하였는데, 이는 착상 전 초기 배 발달 과정에 active 메틸화와 탈메틸화가 일어남을 의미한다. 이상의 결과, Oct-4 유전자 상류 promoter 영역은 DNA 메틸화의 타깃이고, 그 메틸화 상태는 소 수정란 발달 동안에 다양하게 변화한다.
DNA 메틸화는 조직특이적인 유전자 조절에 관여하고, 정상적인 배 발달에 필수적이다. POU5F1은 octamer-binding transcription factor 4 (Oct-4)를 encode하며, 초기 분화에 중요한 전사인자이다. 본 실험에서 소의 Oct-4가 조직특이적이고 발달의존적인 epigenetic 표지 인지를 검토하고자, 착상 전 수정란에서 Oct-4 전사산물과 상류 promoter 영역의 CpGs의 메틸화를 조사하였다. Oct-4 전사산물은 정자 그리고 2-cell에서 8-cell 수정란까지 낮은 수준으로 존재하지만, 상실배와 배반포에서 높게 검출되었다. 이러한 결과는 배 발달 과정의 상실배 단계에서 Oct-4의 de novo 발현이 시작됨을 의미한다. Oct-4 상류 promoter 영역에는 메틸화 가변 영역 (tissue-dependent differentially methylated region, T-DMR)이 존재한다. Oct-4 메틸화 가변 영역의 메틸화 상태는 정자, 성체 체조직과 난자에서 서로 다르고, 수정란으로부터 배반포 단계까지 변화하였는데, 이는 착상 전 초기 배 발달 과정에 active 메틸화와 탈메틸화가 일어남을 의미한다. 이상의 결과, Oct-4 유전자 상류 promoter 영역은 DNA 메틸화의 타깃이고, 그 메틸화 상태는 소 수정란 발달 동안에 다양하게 변화한다.
DNA methylation is involved in tissue-specific gene control and essential for normal embryo development Octamer-binding transcription factor 4 (Oct-4) is one of the most important transcription factors for early differentiation. This study was performed whether the bovine Oct-4 is tissue specific or...
DNA methylation is involved in tissue-specific gene control and essential for normal embryo development Octamer-binding transcription factor 4 (Oct-4) is one of the most important transcription factors for early differentiation. This study was performed whether the bovine Oct-4 is tissue specific or developmental dependent epigenetic mark, we investigated transcripts and the methylation status of CpGs of 5'-promoter region of Oct-4 in bovine preimplantation embryos. Oct-4 transcripts were highly detected in morula and blastocyst, while they were present low levels in sperm and 2- to 8-cell stage embryos. These results suggest that de novo expression of Oct-4 initiates at morula stage of embryogenesis. Here we determined that there is a tissue-dependent differentially methylated region (T-DMR) in the 5'-promoter region of Oct-4. The methylation status of the Oct-4 T-DMR was distinctively different in the oocyte from that in the sperm and adult somatic tissues and changed from zygote to blastocyst stage, suggesting that active methylation and demethylation occur during preimplantation development. Based on these results, the 5'-promoter region of Oct-4 gene is target for DNA methylation and the methylation status changes variously during embryonic development in bovine.
DNA methylation is involved in tissue-specific gene control and essential for normal embryo development Octamer-binding transcription factor 4 (Oct-4) is one of the most important transcription factors for early differentiation. This study was performed whether the bovine Oct-4 is tissue specific or developmental dependent epigenetic mark, we investigated transcripts and the methylation status of CpGs of 5'-promoter region of Oct-4 in bovine preimplantation embryos. Oct-4 transcripts were highly detected in morula and blastocyst, while they were present low levels in sperm and 2- to 8-cell stage embryos. These results suggest that de novo expression of Oct-4 initiates at morula stage of embryogenesis. Here we determined that there is a tissue-dependent differentially methylated region (T-DMR) in the 5'-promoter region of Oct-4. The methylation status of the Oct-4 T-DMR was distinctively different in the oocyte from that in the sperm and adult somatic tissues and changed from zygote to blastocyst stage, suggesting that active methylation and demethylation occur during preimplantation development. Based on these results, the 5'-promoter region of Oct-4 gene is target for DNA methylation and the methylation status changes variously during embryonic development in bovine.
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문제 정의
Oct-4가 발현하지 않는 체세포인 섬유아세포를 이용 DNA 메틸화 억제제 5'-aza dC 또는 히스톤 탈아세틸화 억제제인 TSA 처리에 의한 Oct-4 전사산물의 발현 유도를 통하여 Oct-4 발현이 DNA 메틸화 및 chromatin remodeling 에 의하여 제어 받는지를 확인하고자 실시하였다. 실험 결과 5'-aza dC 또는 TSA 처리한 어떠한 시험구에서도 Oct-4 발현은 유도되지 않았다(Fig.
본 실험은 착상 전 초기 배 발달 과정에서 Oct-4 발현이 그 상류 T-DMR의 DNA 메틸화에 의해서 제어 받는지 조사하고자 실시하였다. 정상발달 동안에 소 Oct-4 발현에 관한 많은 결과들이 있는데, RT-PCR에 의 한 Oct-4 발현은 난자와 배반포에서 높게 발현하며, 착상 전 초기 배 발달과정에서 모두 발현하고(van Eijk 등, 1999; Kirchhof 등, 2000), RT-PCR과 in situ hybridization에 의한 결과에서는 미수정란에서 미약하게 존재하며 compaction0] 일어나는 상실 배전까지는 그 전사산물이 존재하지 않으며(Kurosaka 등 2004), 또 다른 결과는 배반포에서 발현이 미수정란보다 20 배 이싱.
제안 방법
5mM의 hydroquinone 농도로 55°C에서 12시간 빛을 차단하여 반응시켰다. Bisulfite 처리된 샘플은 Wizard DNA Clean-Up system(Promega, Madison, WI)을 이용하여 정제하였다. Bisulfite 처리된 DNA는 AmpliTaq Gold(App- lied Biosystems)을 이용하여 Oct-4 전사 개시점 상류 pro moter 영역으로 추정되는 영역을 포함 약 l, 072bp를 다음의 primer set을 이용하여 증폭시 켰다.
018 mg/ml epinephrine) 가 함유된 수정용 배양액(Fertiliza- tion-TALP)을 사용하였다. Mineral oil 이 도포된 100 ul 수정용 소적에 난구세포를 제거하지 않은 성숙된 난자 20개씩을 침적, 각 소적당 1()6개씩의 정자를 첨가 후 5% CO% 39°C 배양액에 24시간 배양하였다. 수정란은 난구 세포를 완전히 제거한 후 0.
)를 이용하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 BLAST를 이용하여 상동성을 검색하였고, DNA Sequence Navigator(PE App lied Biosystems, USA) program을 사용하여 분석하였다.
그 발현은 발달단계별 5개의 미수정란과 수정란들을 이용하여 3반복 분석되었다. Oct-4의 발현은 정자에서 미약하게 미수정란에서 보통 수준으로 발현되었다.
다음으로 착상 전 발달단계별 수정란에서 Oct-4 상류 T-DMR의 메틸화 변화를 조사하였다(Fig. 3). 2-cell 수정란에서 CpGs 메틸화는 정자 미수정란과 차이를 보이는데, CpGs 1번과 15〜19 대부분은 거의 완전히 탈메틸화를 보이고 나머지는 메틸화 되었다.
Oct-4의 발현은 Forward primer로 5'- ATCCTCGGACCTGGATAGGC-3'를 reverse primer로 5'- TCTATCAGCAAACCGACITG-3'를 이용하여, PCR은 증폭 조건은 95 °C 에서 1분간 pre-denaturation 반응 후, 94 °C 에서 30초, annealing 온도는 56 °C 에서 30초, 72 °C 에서 1 분간 35회 반복시켰고, 72°C 에서 10분간 최종 신장 시켜 반응을 종료하였다. 대조구로 B-actin을 사용하였고 For ward primer로 5'-CAGATCATGTTCGAGACCTT-3'를 re verse primer로 5'-GAAGGTAGTTTCGTGAATGC-3'를 이용하였다.
세포 특이적 발현 조절 메커니즘이 아직까지 밝혀져 있지 않기에, 본 실험에서는 DNA 메틸화가 Oct-4 발현 조절의 메커니즘을 포함하고 있는지 명확히 하기 위하여, 체세포(신장, 귀 섬유아세포), 정자, 난자, 착상 전 수정란에서 Oct-4 발현을 RT-PCR에 의하여 확인하였고, Oct-4 상류 promoter 영역의 DNA 메틸화 패턴을 bi sulfite sequencing에 의하여 조사하였다. 또한, 귀 섬유아세포 배양액에 5-aza dC(메틸화 억제제)과 Trichostatin A (탈아세틸화 억제제)를 처리 Oct-4 발현 유도 실험을 수행하였다.
체외성숙에 사용된 배양액은 10% FBS (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA) 가 함유된 TCM-199(Gibco-BRL) 에 10 pg/ml FSH-P(Fo- llitropin-V), 1 yg/ml estiradiol-17beta 그리고 10 ng/ml EGF를 첨기휴여 사용하였다. 성숙난자는 4-well dish(Nunc, Denmark)를 사용해 mineral oil 이 피복된 500 p I 체외 성숙용 배양액에 30~50개의 난자를 침적하여, 39°C, 5% COz 조건의 배양기에서 20시간 동안 체외성숙을 실시하였다. 체외수정은 0.
소 Oct-4의 발달. 세포 특이적 발현 조절 메커니즘이 아직까지 밝혀져 있지 않기에, 본 실험에서는 DNA 메틸화가 Oct-4 발현 조절의 메커니즘을 포함하고 있는지 명확히 하기 위하여, 체세포(신장, 귀 섬유아세포), 정자, 난자, 착상 전 수정란에서 Oct-4 발현을 RT-PCR에 의하여 확인하였고, Oct-4 상류 promoter 영역의 DNA 메틸화 패턴을 bi sulfite sequencing에 의하여 조사하였다. 또한, 귀 섬유아세포 배양액에 5-aza dC(메틸화 억제제)과 Trichostatin A (탈아세틸화 억제제)를 처리 Oct-4 발현 유도 실험을 수행하였다.
Mineral oil 이 도포된 100 ul 수정용 소적에 난구세포를 제거하지 않은 성숙된 난자 20개씩을 침적, 각 소적당 1()6개씩의 정자를 첨가 후 5% CO% 39°C 배양액에 24시간 배양하였다. 수정란은 난구 세포를 완전히 제거한 후 0.3% BSA가 함유된 CR2aa 배양액 50 pl 소적 당 10개씩 넣어 3일간 배양하였고, 그 후 5% FBS가함유된 50 ill 소적에 옮긴 후 다시 5일간 배양하고 배반포 및 수정란의 각 단계를 확인PBS로 4회 이상 세척 후 회수하였다. Genomic DNA 추줄에 Mil oocyte는 50개, 2-ceII 100개, 4-ceII 30개, 8-cell 15개, 상실배 개, blastocyst 10 개를 회수 사용 전까지 -80°C에 보관하였다.
회수된 세포는 10% FBS가 함유된 DMENI에서 배양하여 4회 정 도계 대한 후 동결보존 하였다. 융해된 후 1회 계대한 섬유아세포를 이용하여 5-aza dC(DNA methylation inhibitor, Sigma) 무처리군, 5-Aza-dC 1 nM, 5Aza-dC 5 jjM, 그리고 Trichostatin A(TSA; inhibitor of histone deacetylase 1, Sigma) 200nM, 5-Aza-dC 5 uM+TSA 200 nM, 5-Aza-dC 5 yM+TSA 400 nM 농도로 맞춰 DMEM 배양액 (Invi- trogen)에서 3일간 배양 후 앞에서 기술한 것과 같이 RNA 추출 및 RT-PCR로 Oct-4 발현 유무를 검정하였다.
정자와 미수정란 그리고 수정 후 2-cell에서 부화 배반포까지 착상 전 초기 배 발달 단계의 수정란 그리고 성체조직 신장과 섬유아세포에서 Oct-4 발현이 RT-PCR에 의해서 조사되었다. 그 발현은 발달단계별 5개의 미수정란과 수정란들을 이용하여 3반복 분석되었다.
조직으로부터 RNA 또한 TRIzol 이용 추출하였다. cDNA 합성은 SuperScript II 1st strand 합성 키트를(Invitrogen) 이용하여 제조하였다.
PCR 증폭조건은 94°C 에서 10분간 pre-denaturation 반응 후, 94 °C 에서 30초, anneal ing 온도는 56°C에서 30초, 72°C에서 1분간 43회 반응시 켰곳, 72°C에서 10분간 신장시켜 증폭반응을 종료하였다. 증가된 PCR 산물은 2% agarose gel 전기영동하여 증폭 여부를 확인 후 증폭된 PCR 산물의 염기서열은 pGEM T-easy Vector System(Promega, USA)을 이 용하여 PCR 산물을 클로닝한 후, Bigdye terminator와 ABI 377 자동염기서열 분석 장치 (PE Applied Biosystems, U.S.A.)를 이용하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 BLAST를 이용하여 상동성을 검색하였고, DNA Sequence Navigator(PE App lied Biosystems, USA) program을 사용하여 분석하였다.
05% typsin처리후, Ca2+, Mg2+, free PBS로 세척하여 준비하였다. 회수된 세포는 10% FBS가 함유된 DMENI에서 배양하여 4회 정 도계 대한 후 동결보존 하였다. 융해된 후 1회 계대한 섬유아세포를 이용하여 5-aza dC(DNA methylation inhibitor, Sigma) 무처리군, 5-Aza-dC 1 nM, 5Aza-dC 5 jjM, 그리고 Trichostatin A(TSA; inhibitor of histone deacetylase 1, Sigma) 200nM, 5-Aza-dC 5 uM+TSA 200 nM, 5-Aza-dC 5 yM+TSA 400 nM 농도로 맞춰 DMEM 배양액 (Invi- trogen)에서 3일간 배양 후 앞에서 기술한 것과 같이 RNA 추출 및 RT-PCR로 Oct-4 발현 유무를 검정하였다.
대상 데이터
조직으로부터 RNA 또한 TRIzol 이용 추출하였다. cDNA 합성은 SuperScript II 1st strand 합성 키트를(Invitrogen) 이용하여 제조하였다. 각각의 실험에서 PCR 증폭은 1 ul의 DNA를 주형으로 r-Taq polymerasefToybbo) 이용 20 pl vo- lume으로 수행되었다.
귀섬유아세포는 2살된 소의 귀 생체조직 절편을 통하여 채취되었고, 이 섬유아세포를 10% FBS가 함유된 DMEM 에서 배양하였다. 5일간 배양 후 세포를 0.
다음 방법과 같다. 도축장에서 도축된 소의 난소에서 10 ml 주사기에 18G 주사침을 이용하여 직경 2~6 mm 난포로부터 채취하였다. 채취된 난자는 실체현미경 하에서 난구세포가 치밀하게 부착되고 세포질이 균일한 것만을 선별하여 체외성숙에 공시하였다.
조사된 영역은 소 Oct、promoterS- 추정되는 전사 개시점 상류 영 역 -1, 072 bp 내 19개의 CpG site(l〜 19번)와 CpG가 다수 포함되어 있는 CpG Island 영역인 exortl 일부 영역의(+27bp) 2개 CpG site(21 〜22번)이다. 조사된 체조직인 신장, 간뿐만 아니라 정자 미수정란 및 착상 전 수정란의 CpG Island 영역인 exon 1은(20〜21) 모두 탈메틸화 되었다(Fig.
Louis, Mo, USA) 제품을 사용하였다. 체외성숙에 사용된 배양액은 10% FBS (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA) 가 함유된 TCM-199(Gibco-BRL) 에 10 pg/ml FSH-P(Fo- llitropin-V), 1 yg/ml estiradiol-17beta 그리고 10 ng/ml EGF를 첨기휴여 사용하였다. 성숙난자는 4-well dish(Nunc, Denmark)를 사용해 mineral oil 이 피복된 500 p I 체외 성숙용 배양액에 30~50개의 난자를 침적하여, 39°C, 5% COz 조건의 배양기에서 20시간 동안 체외성숙을 실시하였다.
채취된 난자는 실체현미경 하에서 난구세포가 치밀하게 부착되고 세포질이 균일한 것만을 선별하여 체외성숙에 공시하였다. 체외수정 및 체외배양에 사용된 시약은 별도의 표기가 없는 한 Sigma사(St. Louis, Mo, USA) 제품을 사용하였다. 체외성숙에 사용된 배양액은 10% FBS (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA) 가 함유된 TCM-199(Gibco-BRL) 에 10 pg/ml FSH-P(Fo- llitropin-V), 1 yg/ml estiradiol-17beta 그리고 10 ng/ml EGF를 첨기휴여 사용하였다.
성숙난자는 4-well dish(Nunc, Denmark)를 사용해 mineral oil 이 피복된 500 p I 체외 성숙용 배양액에 30~50개의 난자를 침적하여, 39°C, 5% COz 조건의 배양기에서 20시간 동안 체외성숙을 실시하였다. 체외수정은 0.6% BSA, 2 ng/ml Heparin, 4% PHE(0.372 mg/ml penicillamine, 0.11 mg/ml hypotaurine, 0.018 mg/ml epinephrine) 가 함유된 수정용 배양액(Fertiliza- tion-TALP)을 사용하였다. Mineral oil 이 도포된 100 ul 수정용 소적에 난구세포를 제거하지 않은 성숙된 난자 20개씩을 침적, 각 소적당 1()6개씩의 정자를 첨가 후 5% CO% 39°C 배양액에 24시간 배양하였다.
이론/모형
DNA 메틸화가 소의 Oct-4 유전자 발현을 조절하는지를 검토하고자, Oct-4 promoter로 추정되는 전사개시점 상류 영역의 메틸화 패턴을 Bisulfite sequencing법에 의하여 조사하였다. 조사된 영역은 소 Oct、promoterS- 추정되는 전사 개시점 상류 영 역 -1, 072 bp 내 19개의 CpG site(l〜 19번)와 CpG가 다수 포함되어 있는 CpG Island 영역인 exortl 일부 영역의(+27bp) 2개 CpG site(21 〜22번)이다.
우선 Genomic DNA 추출은 Ko(2005)의 방법에 준하여 주줄 하였고, Sodium Bisulfite Genomic Sequencing은 Clark(1994) 방법에 따라 수행하였다. 간략히 Bisulfite Ge nomic Sequencing 방법을 설명하면 EcoRI 처리된 약 2 ug 의 genomic DNA가 0.
성능/효과
5에서 Oct-4 발현과 T-DMR의 메틸화 변화를 정리하였다. T-DMR중 특히 그룹H의 영역의 CpGs에서 Oct-4 가 급격히 발현되는 상실배, 배반포에서 저메틸화 경향을 보였으나, Oct-4가 미약하게 발현되는 2-cell, 4-cell, 8-cell 에서는 2-cell을 제외하고 고메틸화 되는 경향을 보였다 (Fig. 5). 그러므로 착상 전 cleavage 발달과정 중 Oct-4의전사조절은 그 상류 promoter 영역의 그룹II의 CpG들의 DNA 메틸화에 의 한 epigenetic 시스템에 의해 부분적으로 제어 받는 것 같다.
결론적으로 본 연구에서 Oct-4는 수정 후 초기 배 발달과정에서 DNA 메틸화의 타깃이고, 특히 소에서 Oct-4 T-DMR의 메틸화는 수정 후 배반포까지 다양하게 변화함을 보여준다.
Oct-4의 발현은 정자에서 미약하게 미수정란에서 보통 수준으로 발현되었다. 그리고 수정 후 2-cell, 4-cell, 8-cell에서 매우 희미하게 발현을 유지하였고, 상실배에서 급격하게 증가 후 배반포까지 높은 수준으로 유지되었다(Fig. 1). 그러나 체세포인 신장과 섬유아세포에서는 발현되지 않았다.
6%)까지 점차적으로 감소하였고(Yamazaki 등, 2006), 또한 ES 및 TS 세포를 이용하여 Oct-4 유전자의 상류 영역의 메틸화 상태를 해석한 실험에서 Oct-4 발현이 메틸화에 의해 세포 특이적으로 제어 받고 있음을 증명하였다(Hatori 등, 2004). 본 실험 결과, 소에서는 그 메틸화 변화가 마우스와 달리 착상 전 초기 배에서 높게 유지되며, cleavage 단계별 그 발현에 따라 뚜렷하게 변화하였다. 섬유아세포 이용 5'-aza dC 또는 TSA 처리에 의한 Oct-4 전사산물의 발현유도를 통하여 그 발현이 DNA 메틸화 및 chromatin remodeling에 의하여 제어 받는지를 확인 결과 Oct-4 발현은 유도되지 않았는더L 이것은 소에서 Qct-4의 전사 조절이 epigenetic 시스템과 함께 전사 인자들과의 상호작용이 존재함을 추정할 수 있고, 이에 대한 분석이 좀더 수행되어야 할 것으로 생각된다.
이러한 급격한 탈메틸화는 마우스 외에 rat, 돼지 (Dean 등, 2001), 사람(Fulka 등, 2004; Dean 등, 2001) 에서보이고, 면양과 소에서는 부분적인 약간의 탈메틸화 현상이 보인다(Beaujean 등, 2004; Dean 등 2001). 본 실험에서는 착상 전 초기 배 발달 과정 동안 메틸화 패턴은 Oct-4 발현 조절 영역으로 생각되는 T-DMR내 그룹II의 CpG들에서 정자에서 28% 미수정란에서 84%이고, 수정 후 2-cell 에서는 52%의 메틸화를 보여주는데(Fig. 5), 미수정란 측면에서 보면 수정에 의한 세포복제 과정에서 탈메틸화가, 정자 측면에서 보면 메틸화 증가현상을 보여 이전의 결과들에서 보이는 paternal의 탈메틸화 범주에 포함되어 있지 않는다. 이처럼 이전의 genome-wide하게 메틸화를 분석하는 면역염색 결과와는 달리 bisulfite-sequencing 방법은 상세하게 게놈상의 특정영역의 메틸화 패턴을 조사함에 따라 특정 유전자 영역의 보다 정확한 메틸화 패턴을 얻을 수 있다.
이라고 보고하고 있다(Vigneault 등, 2004). 본 연구의 결과에서도 이들 보고된 내용과 유사한 결과를 보였는데, 수정 후 2-cell, 4-ceH, &cell에서 매우 희미하게 발현되었고, 미수정란에서 보통 수준 그리고 상실배에서 급격히 강하게 발현되었다. 이들 결과는 미수정란에서 전사된 다양한 종류의 mRNA들이 수정 후 착상 전 수정란으로 이행되는데 전사는 초기 수정란 단계에 한정된다고 알려져 있는 것과 같이 (Aoki 등, 1997; 2003) 수정 전 미수정란에서 발현된 Oct-4 전사산물이 수정 후 이행되고, 상실배 단계에서 de woo하게 발현됨을 시사하고 있다.
의하여 제어 받는지를 확인하고자 실시하였다. 실험 결과 5'-aza dC 또는 TSA 처리한 어떠한 시험구에서도 Oct-4 발현은 유도되지 않았다(Fig. 4). 이들 결과는 소에서는 Oct-4의 발현 조절이 그 상류 영역의 메틸화 .
3% 배반포에서 40% 메틸화 감소를 보여 다이내믹한 메틸화의 변화를 보이고 있어 세포특이적인 메틸화 패턴이 이 시기에 존재한다. 어째든 Oct-4 T-DMR의 DNA 메틸화 상태는 착상 전 배 발달 동안에 특정 stage에서 독특한 메틸화 패턴을 갖고 변화하며, 이러한 모든 변화는 de novo 메틸화와 능동적인 탈메틸화에 의해 일어난다 할 수 있다. 일반적으로 수정 후 genom&wide한 탈메틸화 현상이 일어나는데, 이것은 DNA 복제와 세포분열에 따른 유지 메틸화 부족에 의한 것으로 알려져 있어 (Rougier 등, 1998), 본 실험의 결과뿐만 아니라 수정 후 포유동물 초기 배 발달 과정은 다이내믹한 epigenetic modification의 큰 죽을 차지하고 있는 것 같다.
2-cell 수정란에서 CpGs 메틸화는 정자 미수정란과 차이를 보이는데, CpGs 1번과 15〜19 대부분은 거의 완전히 탈메틸화를 보이고 나머지는 메틸화 되었다. 이들 결과는 정자 게놈 12와 14 CpGs의 site 특이적인 de novo 메틸화와, 난자 게놈 16 — 19 CpGs의 탈메틸화가 cleavage되는 2-cell 특이 적 인 메틸화 패턴이 수정 후에 형성되었음을 의미한다. 다음으로 4-cell에서는 CpGs 16~19에서 다시 de go하게 메틸화 되고, 8-cell에서는 그대로 메틸화 패턴을 유지하였다.
조사된 영역은 소 Oct、promoterS- 추정되는 전사 개시점 상류 영 역 -1, 072 bp 내 19개의 CpG site(l〜 19번)와 CpG가 다수 포함되어 있는 CpG Island 영역인 exortl 일부 영역의(+27bp) 2개 CpG site(21 〜22번)이다. 조사된 체조직인 신장, 간뿐만 아니라 정자 미수정란 및 착상 전 수정란의 CpG Island 영역인 exon 1은(20〜21) 모두 탈메틸화 되었다(Fig. 2). 전사 개시점 상류 영역의 메틸화 패턴은 신장, 간에서는 5개의 CpGs(15~19)를 제외하고 나머지 CpGs는 고메틸화 되어 있었다.
후속연구
본 실험 결과, 소에서는 그 메틸화 변화가 마우스와 달리 착상 전 초기 배에서 높게 유지되며, cleavage 단계별 그 발현에 따라 뚜렷하게 변화하였다. 섬유아세포 이용 5'-aza dC 또는 TSA 처리에 의한 Oct-4 전사산물의 발현유도를 통하여 그 발현이 DNA 메틸화 및 chromatin remodeling에 의하여 제어 받는지를 확인 결과 Oct-4 발현은 유도되지 않았는더L 이것은 소에서 Qct-4의 전사 조절이 epigenetic 시스템과 함께 전사 인자들과의 상호작용이 존재함을 추정할 수 있고, 이에 대한 분석이 좀더 수행되어야 할 것으로 생각된다.
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