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문제 정의
- 본 연구에서는 문주란의 급성 전골수성 백혈병 세포인 HL-60 의 증식 억제 효과를 조사하고, 세포 증식 억제 작용이 apoptosis 유도에 의한 것인지 알아보았다.
- 있다. 우선, 본 연구에서는 문주란의 HL-60 세포 증식 억제 효과가 apoptosis 유도 작용에 의한 것인지 알아보았다. DNA 분절현상은 apoptosis의 대표적 현상。-루 Ca2+ 의존성 endonuclease 가 활성화되어 chromatin의 linker DNA가 절단되어 nucleosomal DNA 분절을 이루게 된다.
- 문주란에 의한 HL-60 세포 증식 억제 효과가 apoptosis 유도에 의한 것인지 알아보기 위해 DNA fragmentation 및 DNA content 변화를 알아보았으며, apoptosis 유도 신호전달 기전에 중요한 Bcl- 2와 Bax의 발현 양상을 조사하였다. 이러한 실험 결과로 문주란 추출물의 효과적인 항암작용을 밝혀 항암제로 사용 가능한 근거를 제시하고자 하였다.
- 이에 본 연구에서는 다양한 생리활성을 나티내는 수선화 과에 속하는 문주란의 급성 전골수성 백혈병 세포인 HL-60 세포에서의 세포 증식 억제 효과를 검색하고 그 기전을 조사하였다. 문주란에 의한 HL-60 세포 증식 억제 효과가 apoptosis 유도에 의한 것인지 알아보기 위해 DNA fragmentation 및 DNA content 변화를 알아보았으며, apoptosis 유도 신호전달 기전에 중요한 Bcl- 2와 Bax의 발현 양상을 조사하였다.
- 이와 같은 연구 결과는 문주란의 CHC13 및 BuOH 분획물의 활성 성분을 급성 전골수성 백혈병의 치료에 이용할 수 있는 가능성의 근거를 제시하는 것이다.
제안 방법
- 70。(3에서 5분, 37°C에서 5분, 37。(:에서 60분, 그리고 70°C에서 1(達 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. Polymerase chain reaction(PCR)은 합성된 cDNA로부터 Bcl-2, 14) Bax”) 및 02-MG16을 증폭시키기 위하여 2 B cDNA, 4 皿의 primer pair, 10 x buffer(10 mM liis-HCl, pH 8.
- 이러한 현상을 agarose gel에서 ladder 형태로 관찰할 수 있다.17)문주란 80% MeOH 추출물 및 용매 분획물 처리에 의하여 HL-60 세포의 apoptosis가 유도되는 지 DNA 분절현상을 전기영동으로 관찰하였다. 문주란의 80% MeOH 추출물 및 용매 분획물을 HL-60 세포에 각각 50 ng/m/ 농도로 24시간 동안 처리하여 DNA ladder! 확인한 결과, Fig.
- 살아있는 암세포 mitochondria의 탈수소 효소작용에 의하여 수용성의 노란색 MTT가 환원되어 형성되는 자주색을 띠는 비수용성의 formazan을 microplate(ELISA) reader로 540nm에서 흡광도를 측정하여, 생존하면서 대사적으로 왕성한 세포의 농도를 조사하였다.9)HL-60 세포 또는 HEL-299(2.5X 105cells/m/)> 96 well plate에 넣고 문주란 분획물을 20, 50 및 100 卩血의 농도로 처리하였다. 이를 4일간 배양한 다음 MTT (Sigma, MO, USA) 200 p/(2mg/m/)을 첨가하고 4시간 동안 반응 시킨 후 plate를 1000 rpm에서 5분간 원심분리하고 상층 액을 제거하였다.
- HL-60 세포(2.5X105 ceiE/m/)에 50 瞄向의 농도로 문주란의 CHC13, BuOH, EtOAc과 H2O 분획물을 처리한 다음 24시간 동안 배양한 후, DNA에 특이적爻 결합하는 형굉색소인 Hoechst 33342(H33342; Sigma, MO, USA) 용액을 가하여 37°C에서 10 분간 염색한 후 형광현미경 (IX-71, Olympus, Japan)하에서 관찰하였다. D)
- 1에서와 같이 문주란의 CHC13, BuOH 및 H2O 분획물 처리군에서 뚜렷한 DNA ladder* 관찰 할 수 있었고, EtOAc 분획물 처리 군에서도 희미하게 단편화 현상을 관찰할 수 있었다. HL-60 세포의 DNA 분절을 유도하는 문주란의 CHC13, BuOH, EtOAc 및 H2O 분획물을 50 渤mJ의 농도로 24시간 동안 처리한 다음, DNA에 결합하여 형광을 나타내는 물질인 PI를 처리하여 세포주기를 유세포 분석기로 조사하였다.18)그 결과, 문주란의 CHC13> BuOH, EtOAc 및 H2O 분획물 처리에 의하여 apoptotic 세포, 즉 sub- G1 hypodiploid 세포가 증가하는 것을 확인하였으며, BuOH, EtOAc 및 H2O 분획물 처리군에서는 necrosisS 일어나는 것으로 보아 이들 용매 분획에 의하여 HL-60 세포의 apoptosis와 necrosis가 함께 유도되는 것으로 보인다(Fig.
- PCR은 Table I의 primert 사용하여 94°C에서 30 초(denaturing), 55°C에서 42초(armealing) 및 72°C에서 1분(primer extension)을 35회 반복하는 조건에서 수행하였다. PCR 에 의하여 생성된 산물은 3.5% agarose gel에서 전기영동을 실시하고 ethidium bromide로 염색하여 특정 band를 확인하였다.
- 1% Triton X-100), 250 pM dNTR 25 mM MgCl2, 1 unit laq poly- merase(Promega, USA)를 섞고 distilled watei로 전체를 25 以 로 맞춘 다음 Perkin-Eimer thermal cycler를 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR은 Table I의 primert 사용하여 94°C에서 30 초(denaturing), 55°C에서 42초(armealing) 및 72°C에서 1분(primer extension)을 35회 반복하는 조건에서 수행하였다. PCR 에 의하여 생성된 산물은 3.
- 5 |iM), 1 unit RNase inhibitor 및 M-MuLV reverse transcriptase(2 U)를가하여 70。(3에서 5분, 37°C에서 5분, 37。(:에서 60분, 그리고 70°C에서 1(達 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. Polymerase chain reaction(PCR)은 합성된 cDNA로부터 Bcl-2, 14) Bax”) 및 02-MG16을 증폭시키기 위하여 2 B cDNA, 4 皿의 primer pair, 10 x buffer(10 mM liis-HCl, pH 8.3, 50 mM KC1, 0.1% Triton X-100), 250 pM dNTR 25 mM MgCl2, 1 unit laq poly- merase(Promega, USA)를 섞고 distilled watei로 전체를 25 以 로 맞춘 다음 Perkin-Eimer thermal cycler를 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR은 Table I의 primert 사용하여 94°C에서 30 초(denaturing), 55°C에서 42초(armealing) 및 72°C에서 1분(primer extension)을 35회 반복하는 조건에서 수행하였다.
- Dimethylsulfoxide(DMSO; Sigma, MO, USA) 150 讨를 가하여 침전물을 용해시킨 후 microplate reader(Amersham Pharmacia Biotech, NY USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 증식 억제 정도를 조사하였다.
- 세척하였다. 그 후 -20°C 에서 70% ethano로 30분 동안 고정 시키고 PBS 세척 후 RNase A(lmg4nZ)를 처리한 다음에 propidium iodide(PI; Sigma, MO, USA)로 염 색하고, COULTER EPICS XL™ Flow Cytometer(Coulter, Miami, FL, USA)로 세포주기를 분석하였다.侦
- 문주란에 의한 HL-60 세포 증식 억제 효과가 apoptosis 유도에 의한 것인지 알아보기 위해 DNA fragmentation 및 DNA content 변화를 알아보았으며, apoptosis 유도 신호전달 기전에 중요한 Bcl- 2와 Bax의 발현 양상을 조사하였다. 이러한 실험 결과로 문주란 추출물의 효과적인 항암작용을 밝혀 항암제로 사용 가능한 근거를 제시하고자 하였다.
- 문주란에 의한 HL-60 세포의 apoptosis 유도 기전을 밝히기 위해 anti-apoptosis 유전자로 알려진 Bcl-2와 pro-apoptosis 유전자로 알려진 Bax의 mRNA level을 조사하였다. Bcl-2는 미토콘드리아로부터 apoptosis 동안에 중요한 사건이라고 여겨지는 AIF(apoptosis induced factor)와 cytochrome c의 방출을 방해함으로써 apoptosis를 방지한다.
- 세포를 수집한 후 Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega, WI, USA)를 사용하여 DNA를 분리흐卜 였다. 분리한 DNA를 1.5% agarose gel에서 40분(100 V) 동안 전기 영동을 한 다음 ethidium bromide로 염 색하고 UV tran- silluminator(Spectronics Corporation Westbury NY, USA) 하에서 DNA fragmentation 현상을 관찰하였다.'“
- 살아있는 암세포 mitochondria의 탈수소 효소작용에 의하여 수용성의 노란색 MTT가 환원되어 형성되는 자주색을 띠는 비수용성의 formazan을 microplate(ELISA) reader로 540nm에서 흡광도를 측정하여, 생존하면서 대사적으로 왕성한 세포의 농도를 조사하였다.9)HL-60 세포 또는 HEL-299(2.
- 5xio5cei0mZ)에 50临何의 농도로 문주란의 80% MeOH 주줄물 및 용매 분획물을 처리한 다음 24시간 동안 배양하였다. 세포를 수집한 후 Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega, WI, USA)를 사용하여 DNA를 분리흐卜 였다. 분리한 DNA를 1.
- 북제주군 구좌읍 하도리 일대에서 채취하였다. 채취한 문주란을 실내에서 통풍 건조한 후 분쇄하고, 미세분말 100 g을 취하여 중량의 10배에 해당하는 80% methanol 가한 후 상온에서 3일 동안 교반 하였으며, 진공여과를 통해 상층액을 회수하였다. 이 과정을 3회 반복하여 모은 상층액을 감압 농축법을 이용하여 문주란 80% MeOH 추출물 20 g을 얻었다.
대상 데이터
- HL-60(human promyelocytic leukemia) 세포 및 HEL-299 (human embryonic lung cell)는 한국 세포 주 은행 (Korea Cell Line Bank)으로부터 분양 받아 100 units/m/의 penicillin- streptomycin(GIBCO Inc, NY, USA)과 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS; GIBCO Inc, NX USA)°] 첨가된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37°C, 5% CO2, humidified incubator 에서 배양하였으며, 계대 배양은 약 70~80%의 confluence 가 되는 3~4일 마다 한번씩 시행하였다.
- DNA-specific fluorescent dye, H33342 (10 μg/ml medium at final) was directly added to cultured cells. The fluorescent images of nuclei of cells were observed and photographed under inverted fluorescent microscope equipped with a IX-71 Olympus camera. The cells were photographed under microscopy (×400).
- 시료는 제주도에서 자생하는 문주란(C沥ww asiaticum)으로 2004년 북제주군 구좌읍 하도리 일대에서 채취하였다. 채취한 문주란을 실내에서 통풍 건조한 후 분쇄하고, 미세분말 100 g을 취하여 중량의 10배에 해당하는 80% methanol 가한 후 상온에서 3일 동안 교반 하였으며, 진공여과를 통해 상층액을 회수하였다.
이론/모형
- 문주란의 추출물 및 용매 분획물의 HL-60 세포 증식에 대한 억제 효과는 MTT assay를 이용하여 검색하였다. MTT assay는 살아있는 세포의 mitochondria 탈수소 효소작용에 의하여 수용성의 노란색 MTT가 환원되어 자주색을 띠는 비수용성의 formazan이 형성되며, 이를 540 nm의 파장에서 흡광도를 측정하는 검색법이다.
- 세포의 성장증^에 대한 문주란의 효과를 3-(4, 5-dimethylthiazol- 2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) assay를 이용하여 검색하였다. 살아있는 암세포 mitochondria의 탈수소 효소작용에 의하여 수용성의 노란색 MTT가 환원되어 형성되는 자주색을 띠는 비수용성의 formazan을 microplate(ELISA) reader로 540nm에서 흡광도를 측정하여, 생존하면서 대사적으로 왕성한 세포의 농도를 조사하였다.
- 문주란의 80% MeOH 분획물을 비롯한 각각의 용매 분획물을 20, 50 및 100 昭W의 농도로 HL-60 세포에 처리한 결과, 50 卩g/m血의 농도를 기준으로 BuOH 분획물이 약 83% 로 가장 높은 HL-60 세포 증식 저해 효과를 보였고, CHC13,EtOAc, H2O, 80% MeOH, hexane 분획물 순으로 HL-60 세포증식 저해 효과가 나타났다(Table II). 정상 세포의 증식을 억제히는지 알아보기 위하여 HEL-299(human embryonic lung cell) 에 같은 방법으로 문주란을 처리하여 MTT assay를 수행하였다. 그 결과, 20 貽8의 농도에서는 15%, 50 卩以起의 농도에서는 20%, 100 卩g/mZ의 농도에서는 40%까지 HEL-299 세포 증식을 억제하는 것으로 확인되었다(Eble HI).
성능/효과
- HL-60 세포의 DNA 분절을 유도하는 문주란의 CHC13, BuOH, EtOAc 및 H2O 분획물을 50 渤mJ의 농도로 24시간 동안 처리한 다음, DNA에 결합하여 형광을 나타내는 물질인 PI를 처리하여 세포주기를 유세포 분석기로 조사하였다.18)그 결과, 문주란의 CHC13> BuOH, EtOAc 및 H2O 분획물 처리에 의하여 apoptotic 세포, 즉 sub- G1 hypodiploid 세포가 증가하는 것을 확인하였으며, BuOH, EtOAc 및 H2O 분획물 처리군에서는 necrosisS 일어나는 것으로 보아 이들 용매 분획에 의하여 HL-60 세포의 apoptosis와 necrosis가 함께 유도되는 것으로 보인다(Fig. 2). 동일한 처리 방법으로 apoptosis 동안에 나타나는 형태학적 변화를 H33342를 이용한 핵 염색으로 조사한 결과, 문주란의 CHC13> BuOH, EtOAc 및 H2O 분획물 처리에 의하여 cell shrinking, chromatin 응축 및 apoptotic body 등과 같은 형태학적 변화들이 뚜렷하게 확인 되었다(Fig.
- japonicum) 은 문주란 속(Crinum) 수선화 과(Amarylidaceae)에 속하는 식물로 열대와 아열대에 약 130여종이 분포되어 있다.2)문주란 속에서 분리 보고된 alkaloids는 lycorine, homolycorine-lycorine, galanthamine, crinan과 tazettine 등이 있으며, 항바이러스 효과, 항종양 효과 및 항염작용 등을 나타냄이 알려져 있다.3)Winiger 등이 수선화 과에 속한 alkaloid인 pretazettine이 사람 종양 세포인 Molt4 및 HepG2 hepatoma에서 세포독성을 나타냄을 보고하였으며, 또한 문주란에서 분리된 flavan의 Molt4 종양세포에 대한 세포독성도 보고되었다.
- 加)Fig. 4에서 보는 바와 같이 CHC13, BuOH, EtOAc 또는 H2O 분획물을 50 卩以血의농도로 24시간 동안 처리하고, RT-PCR 방법을 이용하여 Bcl-2 와 Bax 발현 변화를 관찰한 결과, CHC13 및 BuOH 분획물 처리 군에서 Bcl-2 발현이 감소하는 것을 확인하였으며, Bax 발현은 증가됨을 확인할 수 있었다. 문주란의 CHCL 및 BuOH 분획물은 HL-60 백혈병 세포의 Bcl-2 level을 down-regulation하여 apoptosis를 유도함으로써 HL-60 세포의 성장 증식을 억제함을 확인할 수 있었다.
- 정상 세포의 증식을 억제히는지 알아보기 위하여 HEL-299(human embryonic lung cell) 에 같은 방법으로 문주란을 처리하여 MTT assay를 수행하였다. 그 결과, 20 貽8의 농도에서는 15%, 50 卩以起의 농도에서는 20%, 100 卩g/mZ의 농도에서는 40%까지 HEL-299 세포 증식을 억제하는 것으로 확인되었다(Eble HI). 문주란의 추출물 및 용매 분획물이 HEL-299 세포보다 HL-60 백혈병 세포의 증식을 더 강력히 억제하는 것을 알 수 있으며, HL-60 백혈병 세포의 증식을 50% 억제하는 농도에서는 HEL-299 세포의 증식은 10% 이하로 억제 되었다.
- 2). 동일한 처리 방법으로 apoptosis 동안에 나타나는 형태학적 변화를 H33342를 이용한 핵 염색으로 조사한 결과, 문주란의 CHC13> BuOH, EtOAc 및 H2O 분획물 처리에 의하여 cell shrinking, chromatin 응축 및 apoptotic body 등과 같은 형태학적 변화들이 뚜렷하게 확인 되었다(Fig. 3).19)
- MTT assay는 살아있는 세포의 mitochondria 탈수소 효소작용에 의하여 수용성의 노란색 MTT가 환원되어 자주색을 띠는 비수용성의 formazan이 형성되며, 이를 540 nm의 파장에서 흡광도를 측정하는 검색법이다. 문주란의 80% MeOH 분획물을 비롯한 각각의 용매 분획물을 20, 50 및 100 昭W의 농도로 HL-60 세포에 처리한 결과, 50 卩g/m血의 농도를 기준으로 BuOH 분획물이 약 83% 로 가장 높은 HL-60 세포 증식 저해 효과를 보였고, CHC13,EtOAc, H2O, 80% MeOH, hexane 분획물 순으로 HL-60 세포증식 저해 효과가 나타났다(Table II). 정상 세포의 증식을 억제히는지 알아보기 위하여 HEL-299(human embryonic lung cell) 에 같은 방법으로 문주란을 처리하여 MTT assay를 수행하였다.
- 4에서 보는 바와 같이 CHC13, BuOH, EtOAc 또는 H2O 분획물을 50 卩以血의농도로 24시간 동안 처리하고, RT-PCR 방법을 이용하여 Bcl-2 와 Bax 발현 변화를 관찰한 결과, CHC13 및 BuOH 분획물 처리 군에서 Bcl-2 발현이 감소하는 것을 확인하였으며, Bax 발현은 증가됨을 확인할 수 있었다. 문주란의 CHCL 및 BuOH 분획물은 HL-60 백혈병 세포의 Bcl-2 level을 down-regulation하여 apoptosis를 유도함으로써 HL-60 세포의 성장 증식을 억제함을 확인할 수 있었다. 이러한 연구결과를 바탕으로 본 연구실에서는 향후 문주란을 급성 전골수성 백혈병 치료제로 개발하기 위하여 분리된 활성성분에 의한 mRNA 및 단백질 수준에서의 apoptosis 유도 기전에 대한 연구를 진행할 계획이다.
- 그 결과, 20 貽8의 농도에서는 15%, 50 卩以起의 농도에서는 20%, 100 卩g/mZ의 농도에서는 40%까지 HEL-299 세포 증식을 억제하는 것으로 확인되었다(Eble HI). 문주란의 추출물 및 용매 분획물이 HEL-299 세포보다 HL-60 백혈병 세포의 증식을 더 강력히 억제하는 것을 알 수 있으며, HL-60 백혈병 세포의 증식을 50% 억제하는 농도에서는 HEL-299 세포의 증식은 10% 이하로 억제 되었다.
- 본 연구에서는 문주란의 HL-60 백혈병 세포의 성장증식에 대한 효과를 조사한 결과, 문주란의 CHCq 및 BuOH 분획물이 HL- 60의 Bcl-2 level을 down-regulation하여 apoptosis를 유도함으로써 HL-60 세포의 성장 증식을 억제함을 확인할 수 있었다. 이와 같은 연구 결과는 문주란의 CHC13 및 BuOH 분획물의 활성 성분을 급성 전골수성 백혈병의 치료에 이용할 수 있는 가능성의 근거를 제시하는 것이다.
- Bcl-2 色mily는 apoptosis를 억제하는 것과 촉진하는 집단으로 나눌 수 있는데 Bcl-2나Bcl-xL은 apoptosis를 억제하며 Bax, Bcl-xS 등은 촉진하는 작용을 한다. 특히 세포 사멸을 촉진하는 여러가지 조건 아래서도 세포가 지속적으로 생존하는 것으로 봐서 bcl-2가 세포 생존에 중요한 역할을 한다고 판단하였고, 이어서 bcl-2의 역할이 세포의 apoptosis 를 억제하기 때문이라는 것이 증명되었다.加)Fig.
- 17)문주란 80% MeOH 추출물 및 용매 분획물 처리에 의하여 HL-60 세포의 apoptosis가 유도되는 지 DNA 분절현상을 전기영동으로 관찰하였다. 문주란의 80% MeOH 추출물 및 용매 분획물을 HL-60 세포에 각각 50 ng/m/ 농도로 24시간 동안 처리하여 DNA ladder! 확인한 결과, Fig. 1에서와 같이 문주란의 CHC13, BuOH 및 H2O 분획물 처리군에서 뚜렷한 DNA ladder* 관찰 할 수 있었고, EtOAc 분획물 처리 군에서도 희미하게 단편화 현상을 관찰할 수 있었다. HL-60 세포의 DNA 분절을 유도하는 문주란의 CHC13, BuOH, EtOAc 및 H2O 분획물을 50 渤mJ의 농도로 24시간 동안 처리한 다음, DNA에 결합하여 형광을 나타내는 물질인 PI를 처리하여 세포주기를 유세포 분석기로 조사하였다.
후속연구
- 문주란의 CHCL 및 BuOH 분획물은 HL-60 백혈병 세포의 Bcl-2 level을 down-regulation하여 apoptosis를 유도함으로써 HL-60 세포의 성장 증식을 억제함을 확인할 수 있었다. 이러한 연구결과를 바탕으로 본 연구실에서는 향후 문주란을 급성 전골수성 백혈병 치료제로 개발하기 위하여 분리된 활성성분에 의한 mRNA 및 단백질 수준에서의 apoptosis 유도 기전에 대한 연구를 진행할 계획이다.
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