[논문]LPS의 파골세포 분화 유도에 미치는 PDE4 저해제의 증강효과

노아롱새미; 천링; 임미정

[국내논문] LPS의 파골세포 분화 유도에 미치는 PDE4 저해제의 증강효과
The Effect of PDE4 Inhibitor on LPS-Induced Osteoclastogenesis 원문보기

약학회지 = Yakhak hoeji, v.52 no.1, 2008년, pp.43 - 47

노아롱새미 (숙명여자대학교 약학대학) , 천링 (숙명여자대학교 약학대학) , 임미정 (숙명여자대학교 약학대학)

Abstract ▼ AI-Helper

To determine the regulatory roles of PDE4 inhibitor on LPS-induced osteoclastogenesis, we investigated the effect of a PDE4 inhibitor on osteoclast formation in the presence of LPS. A specific PDE4 inhibitor, rolipram, increased LPS-induced osteoclast formation in cocultures. To verify that whether rolipram acts indirectly on osteoblasts, we investigated the TRANCE and COX-2 mRNA expression levels in osteoblasts. Treatment of rolipram increased the expression of TRANCE and COX-2 mRNA in osteoblasts stimulated by LPS. On the contrary, rolipram did not augment the number of osteoclasts differentiated from bone marrow cells by LPS. In conclusion, the stimulation of LPS-induced osteoclast formation by the PDE4 inhibitor are attributable to its indirect effect on osteoblasts, not to their direct effect on bone marrow-derived osteoclast precursors.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

세포 내 cAMP의 농도를 증가시킨다.d, 13)따라서 LPS와 rolipram의 TRANCE 및 COX-2 mRNA 발현 증가가 조골세포 내 cAMP의 농도 증가를 매개한 것인지 조사하였다. 조골세포를 각각의 시약菇 처리해 1시간 후의 cAMP 농도를 측정하였다.
다음은 파골 전구세포에서 PDE4 저해제가 LPS의 작용에 미치는 영향을 조사트였다. 파골 전구세포는 M-CSF 및 TRANCE 처리로 세포의 증식, 분화, 융합 과정을 거쳐 성숙한 다핵 파골세포로 분화된다.
16, 17) 공배양계에서 LPS에 대한 PDE4 저해제의 파골세포 분화 증강 효과는 PDE4 저해제가 조골 또는 파골세포 전구세포에 작용해 LPS의 효과를 증강시켰을 가능성이 있다. 따라서 LPS에 대한 PDE4 저해제 rolipram의 상승적 효과가 조골세포에 대한 간적접 작용인지 또는 파골세포 전구세포에 대한 직접적인 작용인지 각각의 세포를 사용해 알아보았다. 먼저 PDE4 저해제의 조골세포에 대한 작용을 northern blotting 방법으로 조사하였다.
본 연구에서는 PDE4 저해제인 rolipram을 사용하여 LPS에 의한 파골세포 분화 유도에 미치는 효과를 알아보았다. 본 연구 결과, roliprame 초기 배양한 마우스 조골세포와 골수세포의 공배 양계에서 LPS에 의한 파골세포 형성을 촉진하는 것으로 나타났다.
415)그러나 아직 LPS와 PDE4 저해제의 파골세포 분화에 관한 연구는 보고된 바 없다. 이에 본 연구자는 LPS와 PDE4 저해제가 파골세포 분화에 미치는 영향을 조사하여 일련의 지견을 얻었기에 보고하는 바이다.

제안 방법

이 과정에서 LPS는 TRANCE에 비의존적으로 파골세포의 융합을 촉진해 다핵 파골세포의 형성을 유도하는 것으로 알려져 있다.I" 먼저 단구/대식세포 계열의 RAW264.7 세포를 파골 전구세포로 사용해 LPS의 효과를 확인하였다. TRANCE로 36시간 자극 후 LPS를 처리하였을 때 미처리 세포에서는 단핵 세포가 다량 형성된 것에 반해 LPS 처리 세포는 다핵 파골세포의 형성을 촉진한 것이 관찰되었다(Fig.
유도하는 것으로 알려져 있다.16)먼저 초기 배양한 마우스 조골세포와 골수세포의 공배양계를 이용하여 PDE 저해제가 LPS 에 의한 파골세포 분화에 미치는 효과를 조사하였다. 사용한 LPS 20 ng/m/은 공배양계에서 다핵의 파골세포는 형성하지 않았으나 단 핵의 파골세포를 형성하였다.
배양이 끝난 세포는 10% formalin으로 10 분간고정 한 후 ethanol-acetond : 1)로 1분간 재고정 하여 TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase) staining을 했다. 3개 이상의 핵을 가진 TRAP+ 세포를 다핵 파골세포로 판정했다.
경골 부분의 피부를 절개하여 부착 근육을 떼어냈다. 경골 원심부를 절단하고 슬개골을 탈골시켜 경골을 적출하였다. 뼈 앙끝을 조금 잘라 한 쪽 끝에 25G의 주사바늘을 꽂고 a-MEM 을 흘려보내 골수세포를 시험관에 모았다.
3). 동일한 세포를 사용해 PDE4 저해제 처리가 LPS의 작용에 미치는 영향을 조사하였다. Rolipram 병용 처리시 LPS의 다핵 파골세포 형성 효과는 크게 변화하지 않는 것으로 나타났다(Fig.
U*) 따라서 LPS와 rolipram의 병용 처리에 의한 TRANCE 발현 증강 역시 COX-2 발현 증강을 매개했을 가능성이 있다. 초기 배양한 조골세포를 각각의 시약。루 1시간 처리후 northern blotting 으로 COX-2 mRNA 발현을 조사하였다. TRANCE mRNA 발현과 동일하게 LPS와 rolipmme 각각 조골세포 내 COX-2 발현을 유도하였으며, 두 시약의 병용 처리에 의해 그 발현이 크게 증가함을 알 수 있다(Fig.
7 세포를 TRANCE 50 ng/ ml 존재하에서 36시간 배양 후 LPS 20ng/m/을 첨가해 2일간 추가 배양했다. 배양이 끝난 세포는 10% formalin으로 10 분간고정 한 후 ethanol-acetond : 1)로 1분간 재고정 하여 TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase) staining을 했다. 3개 이상의 핵을 가진 TRAP+ 세포를 다핵 파골세포로 판정했다.
생후 0~1일의 ICR mouse로부터 두개골 피부를 벗긴 후 두개골을 적출하였다. 이때 후두골 근육 부착부분은 제거하였다.
d, 13)따라서 LPS와 rolipram의 TRANCE 및 COX-2 mRNA 발현 증가가 조골세포 내 cAMP의 농도 증가를 매개한 것인지 조사하였다. 조골세포를 각각의 시약菇 처리해 1시간 후의 cAMP 농도를 측정하였다. LPS는 세포 내 cAMP 농도를 변화시키지 않았으며 roliprame cAMP 농도를 상승시켰다(Fig.
초기배양 마우스 조골세포를 LPS, rolipram 또는 두 시약으로 1시간 처리한 후 회수하여 세포 내 cAMP의 양을 cAMP Biotrak Enzyme immunoassay(Amersham Biosciences, USA)로 즉정하였다.
초기배양 마우스 조골세포를 LPS, rolipram 또는 두 시약으로 처리하여 1시간 또는 3시간 배양한 후, total RNA를 Irizol reagent@nvitrogen)로 회수하였다. Total RNA 20 昭을 1.

대상 데이터

원심 분리한 후 10% FBS 함유 a-MEM 으로 약 3~5X 104 세포/100 mm plastic dish가 되도록 접종흐}였다. 5% CO2, 37℃에서 3~4일간 배양한 세포를 이후 조골세포로 실험에 사용하였다.
ICR mouse(6~9주, 수컷)를 경추 탈골한 후 70% 에탄올로 소독하였다. 경골 부분의 피부를 절개하여 부착 근육을 떼어냈다.
초기 배양한 조골세포 5xl03cells/well4 골수세포 软伸 cells/welt을 10% FBS가 함유된 以-MEM으로 LPS 20ngemZ 존재하에서 공배양했다. 또는 RAW 264.

데이터처리

실험결과는 평균값+표준편차로 표기하였고, Student's t-test 로 분석하여 p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

이론/모형

따라서 LPS에 대한 PDE4 저해제 rolipram의 상승적 효과가 조골세포에 대한 간적접 작용인지 또는 파골세포 전구세포에 대한 직접적인 작용인지 각각의 세포를 사용해 알아보았다. 먼저 PDE4 저해제의 조골세포에 대한 작용을 northern blotting 방법으로 조사하였다. LPS 와 roliprame 각각 조골세포에서 파골세포의 분화 인자인 TRANCE의 발현을 촉진함으로써 간접적으로 파골세포 분화를 유도한다.

성능/효과

“) PDE는 adenylate cyclase에 의해 합성된 cAMP를 5-AMP로 분해시킴으로서 세포 내 cAMP 농도를 조절한다. 12, 13)지금까지 PDE family는 PDE1에서 11까지의 isozyme 이 존재하는 것으로 밝혀졌으며, 그 중 PDE4의 역할이 중요시됨에 따라 PDE4 저해제의 생리 . 병리학적 활성에 대해서도 많은 연구가 이뤄졌다.
동일한 세포를 사용해 PDE4 저해제 처리가 LPS의 작용에 미치는 영향을 조사하였다. Rolipram 병용 처리시 LPS의 다핵 파골세포 형성 효과는 크게 변화하지 않는 것으로 나타났다(Fig. 3). 이상의 결과는 공 배양 세포계에서 PDE4 저해제에 의한 LPS의 파골세포 형성촉진이 파골세포 전구세포에 대한 작용과는 무관하게 주로 조골세포에서의 TRANCE 발현 증강에 기인하는 것을 의미한다.
초기 배양한 조골세포를 각각의 시약。루 1시간 처리후 northern blotting 으로 COX-2 mRNA 발현을 조사하였다. TRANCE mRNA 발현과 동일하게 LPS와 rolipmme 각각 조골세포 내 COX-2 발현을 유도하였으며, 두 시약의 병용 처리에 의해 그 발현이 크게 증가함을 알 수 있다(Fig. 2B). 따라서 LPS와 rolipram에 의한 TRANCE mRNA 발현 증가는 COX-2 mRNA 발현을 증강시킴으로써 유발된 것으로 예싱된다.
7 세포를 파골 전구세포로 사용해 LPS의 효과를 확인하였다. TRANCE로 36시간 자극 후 LPS를 처리하였을 때 미처리 세포에서는 단핵 세포가 다량 형성된 것에 반해 LPS 처리 세포는 다핵 파골세포의 형성을 촉진한 것이 관찰되었다(Fig. 3). 동일한 세포를 사용해 PDE4 저해제 처리가 LPS의 작용에 미치는 영향을 조사하였다.
2C). 그러나 LPS와 rolipram을 병용 처리했을 때 rolipram 단독 처리에 비해 조골세포 내 cAMP 농도가 큰 변화를 보이지 않는 것으로 보아 LPS와 rolipram의파골세포 형성에 대한 상승적 효과는 조골세포 내 cAMP를 매개하지 않는 것으로 추정되었다(Fig. 2C). 그러나 이상의 결과는 LPS와 rolipram 처리 1시간 후의 cAMP 농도를 측정한 것이므로, 장시간 후의 cAMP 농도가 변화할 가능성은 여전히 존재하며 이는 추가적인 실험을 통해 규명해야 할 부분이다.
2A). 또한 LPS와 rolipram의 병용 처리는 동일 시간대 TRANCE mRNA 발현을 급격히 증가시키는 것을 알 수 있다. (Fig.
이는 rolipml이 LPS의 조골세포 내 TRANCE와 COX-2 mRNA 발현을 증강시킨 결과이며, 조골세포 내 cAMP 생성 증강 효과는 없었다. 또한 roliprame LPS의 파골세포 전구세포에 대한 다핵 파골세포 형성 효과에는 상승적으로 작용하지 않는 것으로 밝혀져, 공배양계에서의 LPS와 rolipram의 파골세포 형성촉진은 주로 조골세포에 대한 간접적 작용에 기인하는 것으로 밝혀졌다.
파골세포 분화 유도에 미치는 효과를 알아보았다. 본 연구 결과, roliprame 초기 배양한 마우스 조골세포와 골수세포의 공배 양계에서 LPS에 의한 파골세포 형성을 촉진하는 것으로 나타났다. 이는 rolipml이 LPS의 조골세포 내 TRANCE와 COX-2 mRNA 발현을 증강시킨 결과이며, 조골세포 내 cAMP 생성 증강 효과는 없었다.
사용한 LPS 20 ng/m/은 공배양계에서 다핵의 파골세포는 형성하지 않았으나 단 핵의 파골세포를 형성하였다. 비특이적 PDE 저해제인 isobutylmethylxanthine(IBMX)2] 첨가는 LPS 단독처리보다 다핵의 파골세포 형성을 증가시켰으며(Fig. 1A), 이는 PDE4 특이적 저해제인 rolipian의 첨가로도 동일한 효과를 보였다(Fig. IB).
3). 이상의 결과는 공 배양 세포계에서 PDE4 저해제에 의한 LPS의 파골세포 형성촉진이 파골세포 전구세포에 대한 작용과는 무관하게 주로 조골세포에서의 TRANCE 발현 증강에 기인하는 것을 의미한다.
이상의 결과는 공배양계에서 LPS에 의한 파골세포 형성에 PDE 저해제, 특히 PDE4 저해제가 상승적으로 작용함을 의미한다.

후속연구

따라서 LPS와 rolipram에 의한 TRANCE mRNA 발현 증가는 COX-2 mRNA 발현을 증강시킴으로써 유발된 것으로 예싱된다. LPS와 rolipram의 TRANCE 발현 유도에 관여하는 COX-2의 역할은 추후 NS398 등의 COX-2 특이적 저해제나 siRNA를 사용한 실험으로 보다 정확히 규명될 것으로 기대된다.
2C). 그러나 이상의 결과는 LPS와 rolipram 처리 1시간 후의 cAMP 농도를 측정한 것이므로, 장시간 후의 cAMP 농도가 변화할 가능성은 여전히 존재하며 이는 추가적인 실험을 통해 규명해야 할 부분이다.
또한 골 손실을 유발하는 원인은 다양하여 본 연구에서 밝힌 바와 같이 염증성 골손실에서는 PDE4 저해제의 투여가 LPS의 골 손실 효과를 증강시킬 가능성이 있다. 따라서 향후 PDE4 저해제의 골 손실 치료제 약물 개발을 위해서는 다양한 골손실 모델 동물을 이용한 효과 및 작용기전의 규명이 필요하다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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