이 논문에서는 신생아와 노인 유래의 섬유아세포들의 노화의 특징들을 비교하여 사람의 나이와 세포의 수명 및 세포 형질의 관계에 대해 연구하였다. 본 연구의 결과는 비록 한가지의 노인세포에 대해 얻어진 것이기는 하지만 다음과 같은 세 가지 중요한 가능성을 제시한다. 첫째로, 노인에서 유래한 섬유아세포의 증식속도가 신생아 유래의 세포에 비해서 느릴 가능성이 있다. 이러한 결과는 실제로 노인 신체에 존재하는 세포가 신생아에 존재하는 세포에 비해 낮은 속도로 증식할 가능성을 시사하는 것으로서, 노인에서 관찰되는 조직실질의 감소 원인을 설명하는 자료가 될 수 있겠다. 둘째로, 노인 유래 섬유아세포의 early passage 세포가 신생아 유래의 세포의 early passage 세포와 동일하게 낮은 수준의 SA${\beta}-Gal$ 활성, autofluorescence, lysosome 함량, 그리고 활성산소 수준을 갖고 있었다. 이 점은, early passage 때의 세포가 보이는 형질이 신체에 존재하는 세포의 상황과 크게 다르지 않다고 가정할 때, 노인 신체의 조직에 존재하는 세포들이 신생아의 세포와 유사한 상태로 존재할 가능성을 시사하는 것이다. 즉, 노인 신체에서는 in vitro 노화세포에서 나타나는 수준의 세포노화가 일어나 있지 않다는 것이다. 셋째, 노인세포가 노화했을 때는 신생아세포의 경우와 거의 동일한 수준의 활성산소, lysosome, SA ${\beta}-Gal$ activity 증가를 보이고 있었는데, 이는 노인 유래의 세포가 in vitro 배양 시 신생아 유래의 세포보다 더 심하거나 또는 빠른 산화적 손상이나 세포학적 변화를 겪지는 않는다는 것을 보여주는 것으로서, 세포가 보유한 항산화적 기능이 노인이 되면서 크게 약화되지는 않음을 시사하고 있다. 결론적으로 노인 유래의 세포는 세포증식 속도를 제외하면 대체로 신생아 때의 상태와 동일한 세포 내 상태를 갖고 있다고 결론 내릴 수 있겠다.
이 논문에서는 신생아와 노인 유래의 섬유아세포들의 노화의 특징들을 비교하여 사람의 나이와 세포의 수명 및 세포 형질의 관계에 대해 연구하였다. 본 연구의 결과는 비록 한가지의 노인세포에 대해 얻어진 것이기는 하지만 다음과 같은 세 가지 중요한 가능성을 제시한다. 첫째로, 노인에서 유래한 섬유아세포의 증식속도가 신생아 유래의 세포에 비해서 느릴 가능성이 있다. 이러한 결과는 실제로 노인 신체에 존재하는 세포가 신생아에 존재하는 세포에 비해 낮은 속도로 증식할 가능성을 시사하는 것으로서, 노인에서 관찰되는 조직실질의 감소 원인을 설명하는 자료가 될 수 있겠다. 둘째로, 노인 유래 섬유아세포의 early passage 세포가 신생아 유래의 세포의 early passage 세포와 동일하게 낮은 수준의 SA ${\beta}-Gal$ 활성, autofluorescence, lysosome 함량, 그리고 활성산소 수준을 갖고 있었다. 이 점은, early passage 때의 세포가 보이는 형질이 신체에 존재하는 세포의 상황과 크게 다르지 않다고 가정할 때, 노인 신체의 조직에 존재하는 세포들이 신생아의 세포와 유사한 상태로 존재할 가능성을 시사하는 것이다. 즉, 노인 신체에서는 in vitro 노화세포에서 나타나는 수준의 세포노화가 일어나 있지 않다는 것이다. 셋째, 노인세포가 노화했을 때는 신생아세포의 경우와 거의 동일한 수준의 활성산소, lysosome, SA ${\beta}-Gal$ activity 증가를 보이고 있었는데, 이는 노인 유래의 세포가 in vitro 배양 시 신생아 유래의 세포보다 더 심하거나 또는 빠른 산화적 손상이나 세포학적 변화를 겪지는 않는다는 것을 보여주는 것으로서, 세포가 보유한 항산화적 기능이 노인이 되면서 크게 약화되지는 않음을 시사하고 있다. 결론적으로 노인 유래의 세포는 세포증식 속도를 제외하면 대체로 신생아 때의 상태와 동일한 세포 내 상태를 갖고 있다고 결론 내릴 수 있겠다.
Normal somatic cells proliferate for a limited number of doublings in culture and then enter an irreversible growth-arrest state called replicative senescence. Replicative senescence has been believed a reason for the limited cellular turnover and deterioration of tissue function in aged animals. Ho...
Normal somatic cells proliferate for a limited number of doublings in culture and then enter an irreversible growth-arrest state called replicative senescence. Replicative senescence has been believed a reason for the limited cellular turnover and deterioration of tissue function in aged animals. However, there is no experimental evidence supporting this assumption. Furthermore, cells from aged person have been poorly characterized with an exception of the cases of T cells. In this study, we examined cell biological changes occurring in replicative senescence of fibroblast strains originated from a new-born (NHF-NB) and a 87 year old man (NHF-87). NHF-87 (and the cells from a 75-year old) proliferated to smaller population doublings and with longer doubling times than NHF-NB did. At early passages, NHF-87 exhibited a low senescence-associated ${\beta}-Gal$ (SA ${\beta}-Gal$) activity and lipofuscin level, typical markers for cellular senescence. Furthermore, they maintained low levels of lysosome and reactive oxygen species (ROS). All of these levels increased dramatically in the late passage NHF-87 quite similarly as those in the late passaged NHF-NB did. These results indicate that most cells originated from the aged maintain a phenotype of the cells originated from new-born donors and undergo replicative senescence with the same kinetics as that of the cells from new-born. It is also indicated that not SA ${\beta}-gal$ activity but cell proliferation rate may be qualified as a biomarker for cells aged in vivo.
Normal somatic cells proliferate for a limited number of doublings in culture and then enter an irreversible growth-arrest state called replicative senescence. Replicative senescence has been believed a reason for the limited cellular turnover and deterioration of tissue function in aged animals. However, there is no experimental evidence supporting this assumption. Furthermore, cells from aged person have been poorly characterized with an exception of the cases of T cells. In this study, we examined cell biological changes occurring in replicative senescence of fibroblast strains originated from a new-born (NHF-NB) and a 87 year old man (NHF-87). NHF-87 (and the cells from a 75-year old) proliferated to smaller population doublings and with longer doubling times than NHF-NB did. At early passages, NHF-87 exhibited a low senescence-associated ${\beta}-Gal$ (SA ${\beta}-Gal$) activity and lipofuscin level, typical markers for cellular senescence. Furthermore, they maintained low levels of lysosome and reactive oxygen species (ROS). All of these levels increased dramatically in the late passage NHF-87 quite similarly as those in the late passaged NHF-NB did. These results indicate that most cells originated from the aged maintain a phenotype of the cells originated from new-born donors and undergo replicative senescence with the same kinetics as that of the cells from new-born. It is also indicated that not SA ${\beta}-gal$ activity but cell proliferation rate may be qualified as a biomarker for cells aged in vivo.
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문제 정의
이 논문에서는 신생아와 노인 유래의 섬유아세포들의 노 화의 특징들을 비교하여 사람의 나이와 세포의 수명 및 세포 형질의 관계에 대해 연구하였다.
첫째로, 노인에서 유래한 섬유아세포의 증식속도가 신 생아 유래의 세포에 비해서 느릴 가능성이 있다. 이러한 결과는 실제로 노인 신체에 존재하는 세포가 신생아에 존재하는 세포에 비해 낮은 속도로 증식할 가능성을 시사하는 것으로 서, 노인에서 관찰되는 조직실질의 감소 원인을 설명하는 자 료가 될 수 있겠다. 둘째로, 노인 유래 섬유아세포의 early passage 세포가 신생아 유래의 세포의 early passage 세포와 동일하게 낮은 수준의 SA p-Gal 활성, autofluorescence, lysosome 함량, 그리고 활성산소 수준을 갖고 있었다.
노인 유래 세포에서의 SA P-Gal 활성 변화가 신생아 유래 의 세포의 경우에 비해 어떻게 다른지 알아보기 위해 NHF-87의 SA P-Gal 활성을 조사하였다. 기존에 보고된 바 [1 기와 같이 NHF-NB는 세포노화에 근접한 late passage에서 SA P-Gal 활성이 완연히 나타났고(Fig 2, NB(L)) 세포의 크기가 커지고 morphology도 전형적인 노화세포의 모습을 띄 었다.
본 논문에서 우리는 75세 이상의 노인에서 유래한 섬유아 세포들의 노화과정에서의 세포학적 변화를 확인하고자 하였다. 노인세포에서의 세포 증식한계와 증식속도(population doubling time), SA μ-Gal 활성의 발현, 노화과정에서의 lysosome 수, lipofuscin 축적도, 활성산소 축적도 등을 신생아 세포에 대비하여 관찰하였는데, 그 결과 노인에게서 유래한 섬유아세포는 증식 속도에서는 유의하게 낮았지만, 노화과정에서 신생아의 세포가 겪는 것과 거의 동일한 세포학적 변화를 겪는다는 것을 확인할 수 있었다.
제안 방법
세포를 60 mm plate에 분주하고 24시간 뒤에 50 gM Lysotracker Red DND-99 (L7528, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 가하고 30분간 반응시켰다. 이후 trypsine-EDTA처 리로 분리된 세포를 PBS에 재현탁하고 FACS에서 분획하였다. Lysotracker 처리된 세포는 590 nm emission을, 처리되지 않은 세포는 530 nm emission을 이용하여 측정하고 개수하였으며, 결과는 Cell Quest 3.
Louis, MS, USA) 와 2 μM dihydroethidium (DHE; Invitrogen) 를 넣 고 30분간 반응시켰다. 이후, trypsine-EDTA처리를 통해 분 리된 세포를 모은 뒤 EDTA가 포함된 PBS로 재현탁하고 FACS (Beckton Dickson FACScan)로 분획하였다. DCF-DA 의 형 광은 530 nm emission을, DHE의 형 광은 650 nm emis- sion을 이용하여 측정, 개수하였다.
이후, trypsine-EDTA처리를 통해 분 리된 세포를 모은 뒤 EDTA가 포함된 PBS로 재현탁하고 FACS (Beckton Dickson FACScan)로 분획하였다. DCF-DA 의 형 광은 530 nm emission을, DHE의 형 광은 650 nm emis- sion을 이용하여 측정, 개수하였다.
우선, 신생아(NHF-NB) 및 75세 노인(NHF-75)과 87세 노 인(NHF-87)에서 유래한 섬유아세포 strain들을 240-340일간 지속적으로 계대배양하였는데, NHF-NB는 PD74, NHF-75는 PD33, NHF-87은 PD43에 이르러 세포수 증가가 멈춰 이 시 점에서 노화상태(replicative senescence)에 진입하였다고 판 단하였다(Fig. 1). Schineider 등[26]은 21-36세 사이의 청년에서 유래한 섬유아세포의 최대 PD (life span)가 63세 이상의 노인들에서 유래한 섬유아세포의 최대 PD보다 유의하게 크 다고 보고한 반면, Maier 등[2이은 90세 노인들에서 유래한 섬유아세포들도 여전히 높은 증식능력을 갖고 있으며 세포 들의 최대 PD는 서로 간 큰 차이를 보인다는 보고를 한 바있는데, 이번 조사에서 나타난 75세와 87세 노인유래 세포들 의 최대 PD인 33과 43은 노인세포간의 상이성을 잘 보여주고 있다.
3. Forward and side scattering patterns of the early and late-passaged NHF-NB and NHF-87, lx 104 NHF-NB at PD20 (NB (E)) and PD70 (NB (L)) and NHF-87 at PD16 (87 (E)) and PD42 (87 (L)) were applied to FACS, and their forward (FSC-H) and side scattering (SSC-H) patterns were analyzed.
노화된 세포에서는 세포의 산화적 손상정도를 나타내주는 척도가 되는 lipofuscin의 축적이 일어나몌28], 아마도 이러한 산화손상물들을 제거 하기 위한 프로그램 의 하나로 lysosome 구조체의 수가 증가해 있다[6, 24], 노인유래의 세포에 이러한 lysosome 관련 변화가 이미 존재하는지 아니면 세포가 in vi- vo에서 세포노화를 겪으면서 이러한 변화가 일어나는지를 알아보기 위해 NHF-NB와 NHF-87 세포들의 lipofuscin에서 유 래 하는 autofluorescence의 수준과 Lysotrackei를 이용한 lysosomal content를 조사, 비 교하였다. 기대하였던 바대로 NHF- NB는 세포가 노화상태에 들어가면서 autofluorescence (Fig.
세포가 노화하면서 세포 내 활성산소의 양은 점차 증가한 다[17]. 노인유래의 세포에서 활성산소의 발생정도를 파악하 고자 활성산소의 주류를 이루는 superoxide radical (02)과 hydroxyl radical (-OH) 수준에 대해 이들에 의해 산화된 DCF-DH와 DHE의 형광을 FACS를 통해 조사하였다. NHF- NB는 기대한 바와 같이 late passage에서 DCF-DH (Fig.
대상 데이터
신생아의 포피(foreskin)에서 유래한 섬유아세포(NHF-NB 라 칭함)와 75세와 87세의 건강한 남자 노인의 둔부에서 유 래한 섬유아세포(각각 NHF-75, NHF-87라 칭 함)는 서울대학 교 피부학교실의 정 진호 박사로부터 분주받아 10% fetal bovine serum (Biowhitaker, Walkersville, MD, USA) 이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Biowhitaker)에서 배양하였다. 이들 세포를 20일 동안에 세포의 수가 전 혀 늘지 않는 시점에 도달할 때까지 계속해서 계대배양하여 증식곡선을 완성하였다.
이후의 실험들에서는 NHF-NB와 분열속도가 일정하게 유 지된 NHF-87를 대상으로 조사하였으며, 각각의 early passage (NHF-NB는 PD20-28, NHF-87은 PD16~24) 와 세포노화 단계에 근접한 late passage (NHF-NB는 PD66-70, 87세는 PD42)의 세포들이 이용되었다. Early passage 세포들은 증식 이 활발하여 NHF-NB의 경우 2-3일에 한번 분열하였던 반면, late passage 세포들은 1회 분열에 2주 정도가 소요되었다.
데이터처리
이후 trypsine-EDTA처 리로 분리된 세포를 PBS에 재현탁하고 FACS에서 분획하였다. Lysotracker 처리된 세포는 590 nm emission을, 처리되지 않은 세포는 530 nm emission을 이용하여 측정하고 개수하였으며, 결과는 Cell Quest 3.2 Software (Beckton Dickson)로분석하였다.
성능/효과
본 연구의 결과는 비록 한가지의 노인세포에 대해 얻어진 것이 기는 하지만 다음과 같은 세 가지 중요한 가능성을 제시 한다. 첫째로, 노인에서 유래한 섬유아세포의 증식속도가 신 생아 유래의 세포에 비해서 느릴 가능성이 있다. 이러한 결과는 실제로 노인 신체에 존재하는 세포가 신생아에 존재하는 세포에 비해 낮은 속도로 증식할 가능성을 시사하는 것으로 서, 노인에서 관찰되는 조직실질의 감소 원인을 설명하는 자 료가 될 수 있겠다.
셋째, 노인세포가 노화했을 때는 신생아세포 의 경우와 거의 동일한 수준의 활성산소, lysosome, SA p-Gal activity 증가를 보이고 있었는데, 이는 노인 유래의 세포가 in vitro 배양 시 신생아 유래의 세포보다 더 심하거나 또는 빠른 산화적 손상이나 세포학적 변화를 겪지는 않는다는 것을 보여주는 것으로서, 세포가 보유한 항산화적 기능이 노인 이 되면서 크게 약화되지는 않음을 시사하고 있다. 결론적으 로 노인 유래의 세포는 세포증식 속도를 제외하면 대체로 신 생아 때의 상태와 동일한 세포 내 상태를 갖고 있다고 결론 내릴 수 있겠다.
본 논문에서 우리는 75세 이상의 노인에서 유래한 섬유아 세포들의 노화과정에서의 세포학적 변화를 확인하고자 하였다. 노인세포에서의 세포 증식한계와 증식속도(population doubling time), SA μ-Gal 활성의 발현, 노화과정에서의 lysosome 수, lipofuscin 축적도, 활성산소 축적도 등을 신생아 세포에 대비하여 관찰하였는데, 그 결과 노인에게서 유래한 섬유아세포는 증식 속도에서는 유의하게 낮았지만, 노화과정에서 신생아의 세포가 겪는 것과 거의 동일한 세포학적 변화를 겪는다는 것을 확인할 수 있었다.
16일(NHF-87)에 달하여서, 두 노인 유래 세포들의 초기 증식속도는 거의 동일하게 나타났다. 또한, 노 인 유래 세포의 증식속도는 NHF-NB의 증식속도의 1/2 정도로 낮은 것으로 나타났다. 특이하게 NHF-75는 PD19 이후 부터는 증식속도가 줄어든 상태로(doubling time 12.
실제로 NHF-NB의 경우 early passage 세포에 비해 late passage에서는 높은 SSC값을 갖는 세포가 상당히 늘어나 있었는데(Fig. 3, NB(L)), NHF-87 세포들도 early passage에 비해 late passage에서 SSC값이 크게 증가한 것이 관찰되었다. 오히려 NHF-87의 경우에 매우 높은 SSC 값을 갖는 세포들이 더욱 많이 발생하였다(Fig.
87(L)). 한편, 이 조사에서 세포의 크기를 알려주는 forward scattering (FSC)은 late passage에서 크게 증가하지 않았으 나, early passage 세포들을 비교하였을 때, 신생아세포보다는 NHF-87세포가 다소 높은 FSC 중앙값을 보여서, 노인 유 래 세포가 신생아의 세포보다는 다소 커져 있음을 추측케 한다. 그러나, 이것이 사람 간의 상이성에 기인할 가능성도 배 제할 수 없다.
그러나, 이것이 사람 간의 상이성에 기인할 가능성도 배 제할 수 없다. 이상의 결과들은 NHF-87 세포가 in vitro 노화 과정에서 NF-NB와 동일한 패턴의 SA p-Gal 활성과 세포 형태 측면에서의 변화를 겪었다는 것을 보여주고 있다. 즉, 87세 노인 유래의 세포는 신생아의 세포와 같이 in vitro 에서 의 배양초기에는 노화세포의 형질을 보이지 않고 세포노화 단계에 근접해서야 비로소 노화된 세포의 형질을 띄게 됨을 알 수 있다.
즉, 87세 노인 유래의 세포는 신생아의 세포와 같이 in vitro 에서 의 배양초기에는 노화세포의 형질을 보이지 않고 세포노화 단계에 근접해서야 비로소 노화된 세포의 형질을 띄게 됨을 알 수 있다. 따라서, 이 결과는 노인의 신체에 존재하는 섬유 아세포에는 SA p-Gal 활성이나 노화세포의 형태적 성질이 존재하지 않고 있다는 것을 예측케 한다. 이러한 결과는 노 인의 조직에서는 in Mo에서 노화된 세포와 달리 SA p-Gal 활성이 없다는 보고[2기와 일치하는 것이라고 하겠다.
이는 노인유래 의 세포가 배양 초기에 높은 수준의 lipofuscin과 lysosome 을 갖고 있지 않음을 나타내주는 것이다. 이 결과들은 노인 의 신체에 존재하는 섬유아세포들이 높은 수준의 lipofuscin 과 lysosome을 갖고 있지는 않다는 것을 시사한다, 또한, 이 들이 노화상기에 들어가면서 신생아 유래의 세포와 동일한 수준으로 세포 내 lipofuscin의 양과 lysosome의 수가 증가한 다는 것도 잘 말해주고 있다.
한편, NHF-87의 세포들도 NHFNB와 비슷하게 early passage 에서 활성산소 수준이 낮았고, late passage에 들어가서 높게 나타났다. 이 결과는 첫째, NHF-87 세포들이 in vitro 배양 초 기에는 적은 양의 활성산소를 갖고 있다는 것과, 둘째, 그러나 이들 세포가 노화하면서 NHF-NB의 경우와 동일하게 증 가된 수준의 활성산소가 축적된다는 것을 보여준다. 따라서, 87세 노인의 신체 내에서는 그리 높지 않은 수준의 활성산소 가 발생하고 있다고 추정되며, 노인유래의 세포도 in vitro 노 화과정에서 신생아의 세포와 거의 동일한 산화적 자극과 손 상을 받는다는 것을 추정할 수 있다.
이러한 결과는 실제로 노인 신체에 존재하는 세포가 신생아에 존재하는 세포에 비해 낮은 속도로 증식할 가능성을 시사하는 것으로 서, 노인에서 관찰되는 조직실질의 감소 원인을 설명하는 자 료가 될 수 있겠다. 둘째로, 노인 유래 섬유아세포의 early passage 세포가 신생아 유래의 세포의 early passage 세포와 동일하게 낮은 수준의 SA p-Gal 활성, autofluorescence, lysosome 함량, 그리고 활성산소 수준을 갖고 있었다. 이 점은, early passage 때의 세포가 보이는 형질이 신체에 존재하는 세포의 상황과 크게 다르지 않다고 가정할 때, 노인 신체의 조직에 존재하는 세포들이 신생아의 세포와 유사한 상태로 존재할 가능성을 시사하는 것이다.
즉, 노인 신체에서는 in vitro 노화세포에서 나타나는 수준의 세포노화가 일어나 있지 않다는 것이다. 셋째, 노인세포가 노화했을 때는 신생아세포 의 경우와 거의 동일한 수준의 활성산소, lysosome, SA p-Gal activity 증가를 보이고 있었는데, 이는 노인 유래의 세포가 in vitro 배양 시 신생아 유래의 세포보다 더 심하거나 또는 빠른 산화적 손상이나 세포학적 변화를 겪지는 않는다는 것을 보여주는 것으로서, 세포가 보유한 항산화적 기능이 노인 이 되면서 크게 약화되지는 않음을 시사하고 있다. 결론적으 로 노인 유래의 세포는 세포증식 속도를 제외하면 대체로 신 생아 때의 상태와 동일한 세포 내 상태를 갖고 있다고 결론 내릴 수 있겠다.
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