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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 산화적 스트레스로부터 신경세포를 보호하는 생리활성물질을 탐색하기 위한 목적으로 제비꽃의 추출물을 이용하여 glutamate에 의해 손상된 N18-RE-105 신경 세포주에 대한 보호효과를 밝히고자 하였다.
- 제비꽃 추출물의 신경세포 보호효과. 본 연구팀에서는 고농도의 glutamate가 유도하는 산화적 스트레스로부터 신경세포를 보호하는 물질을 찾기 위하여 천연물을 대상으로 탐색을 시도하였다. 그 결과, 제비꽃(Viola mandshurica)추출물로부터 강력한 신경세포 보호효과를 확인할 수 있었다.
- 본 연구팀에서는 국내외에서 자생하고 있는 435가지의 약용식물 주줄물을 대상으로 뇌신경세포계 hybridoma N18-RE-105 세포주를 이용하여 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호 효과를 갖는 천연추출물의 탐색을 시도하였다. 그 결과 제비꽃(Violamandshurica)추출물로부터 강력한 신경세포 보호효과를 확인할 수 있었다.
제안 방법
- 신경세포에서의 산화적 스트레스를 유도하기 위하여 glutamate를 시간별로 처리하였다. 96-well plate 에 5X 104 cells/mZ 농도로 세포를 분주한 후, 24시간 동안 배양하고 10, 20mM의 최종농도로 glutamate> 24, 36시간 노출시킨 뒤 산화적 스트레스를 받아 50% 이하의 세포사멸을 유도하는 적정한 농도와 시간을 결정하였다.
- mandshurica (A: methanol extract, B: ethan이 extract, C: acetone extract). After MTT assay, the MTT reduction rate (means土S.D. of triplicate determination) were calculated by setting each of control survivals in the absence of glutamate and V. mandshurica extracts. *si*g* nificant vs.
- Cells were treated with various concentrations (10, 20 mM) of glutamate, and cell count after (24 h, 36 h) incubation. After MTT assay, the MTT reduction rate (mean±S.D. of triplicate determination) were calculated by setting each of control survivals in the absence of glutamate. ***significant vs.
- LDH 측정에 의한 세포독성 확인. 제비꽃 추출물의 신경세포보호 효과를 측정흐}기 위한 방법으로 LDH release assay를 실시하였다.
- 5% Triton X-100용액을 50 g/ 첨가하여 40rpm으로 10분 동안 shading시켜 세포벽을 깨트린 다음, 같은 방법으로 LDH reagent 50 μl를 첨가하여 반응 시키고, 반응이 끝나면 반응 정지액을 넣은 뒤, 540nm에서 흡광도를 측정하였다. LDH에 의한 세포독성의 백분율은 배양액과 살아있는 세포에서 유리된 총 LDH에 대한 배양액으로부터 유리된 LDH의 값으로 계산하여 glutamate 실험군과 비교한 값을 나타내었다.
- MTT 분석을 통한 세포 생존율 측정. 제비꽃 추출물과 ascorbic acid의 신경세포 보호효과를 측정하기 위하여 MTT reduction assay를 실시하였다.
- 제비꽃 추출물의 신경세포보호 효과를 측정흐}기 위한 방법으로 LDH release assay를 실시하였다. N18-RE-105 세포주를 5X104 cells/mZ로 맞춘 후, 100μl씩 96-well plate에 분주하여 CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 뒤 10, 50, lOOpg/m/의 최종농도로 제비꽃 acetone 추출물을 세포주에 처리하였다. 30분 후 20mM glutamate를 처리하여 24시간 배양한 다음, 배양액을 새로운 96-well plate에 50 g/ 분주하고, 이 배양액에 LDH reagent를 50 μl씩 첨가하여 상온에서 정치시킨 후, 20분간 반응하였다.
- , Tokyo, Japan)를이용하여 4(rc에서 감압 농축하여 각 용매 추출물을 얻었다. 각 추출물은 10mg/mZ로 DMSO에 녹여 적당한 농도로 희석하였고, 최종농도 1% DMSO가 되도록 처리하였다.
- 정상군에 비해 glutamate 처리군은 세포독성으로 인하여 신경돌기가 거의 소멸된 양상을 보여 신경세포가 형태학적으로 큰 변화가 유도된 것을 확인할 수 있었으나, ascorbic acid를 최종농도 50|iM, 500 |iM 전처리한 실험군에서는 농도 의존적으로 신경세포의 생존을 확인할 수 있었다. 그리고 동일한 조건에서 MTT reduction assay 방법을 이용하여 정상군과 glutamate 처리군 그리고 glutamate와 ascorbic acid를 농도별로 처리한 실험군과 비교하였다. Fig.
- 8% 수준으로 세포 생존율이 감소하였다. 다음으로 glutamate 세포독성과 세포내 산화-환원 계의 연관성을 조사하기 위하여 천연 항산화제인 ascorbic acid를 30분 전 처리한 후, 20mM glutamate> 처리하여 세포 생존율을 조사하였다. 신경세포가 외부환경으로부터 자극을 받으면 신경상해를 입는 것과 동시에 세포사가 유도되어 세포의 형태학적인 변화가 나타나므로22)glutamate로 유도된 세포독성의 상태에서 ascorbic acid가 세포의 형태학적 변화에 미치는지를 알아보기 위해 광학 현미경 하에서 관찰하였다(Fig.
- 반응 후 well 바닥에 형성된 fdrmazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO 100 g/ 첨가하여 녹이고 ELISA reader(Model 680, BioRad, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구 세포수를 100%로 하였을 때 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.
- 그 결과, 제비꽃(Viola mandshurica)추출물로부터 강력한 신경세포 보호효과를 확인할 수 있었다. 먼저, 제비꽃을 용매별로 추출하여 10, 50, 100 μg/ml의 최종농도로 N18-RE-105 세포주에 처리하여 glutamate에 의해 유도된 산화적 스트레스 상태에 대한 신경세포 보호효과를 확인하였다(Fig. 3). Methanol 과 acetone 추출물 10 μg/ml에서는 39.
- 제비꽃 추출물과 ascorbic acid의 신경세포 보호효과를 측정하기 위하여 MTT reduction assay를 실시하였다. 세포주를 5X 104 cells/mZ로 맞추고 96-well plate에 각각 100 μl씩 첨가하여 24시 간 동안 37℃, 5% CO2 incubatoi에서 배양한 후, DMSO에 녹인 제비꽃 추출물을 각 용매별 10, 50, 100μg/m/와 ascorbic acid 50, 100 μM의 최종농도로 처리하였다. 30분 동안 배양한 후 20mM glutamateS 처리하여 24시간 배양하고 각 well에 PBS 완충액에 녹인 MTT(5 mg/mZ) 용액을 10 μl씩 첨가하여 1시간 동안 다시 배양하였다.
- 다음으로 glutamate 세포독성과 세포내 산화-환원 계의 연관성을 조사하기 위하여 천연 항산화제인 ascorbic acid를 30분 전 처리한 후, 20mM glutamate> 처리하여 세포 생존율을 조사하였다. 신경세포가 외부환경으로부터 자극을 받으면 신경상해를 입는 것과 동시에 세포사가 유도되어 세포의 형태학적인 변화가 나타나므로22)glutamate로 유도된 세포독성의 상태에서 ascorbic acid가 세포의 형태학적 변화에 미치는지를 알아보기 위해 광학 현미경 하에서 관찰하였다(Fig. 2A). 정상군에 비해 glutamate 처리군은 세포독성으로 인하여 신경돌기가 거의 소멸된 양상을 보여 신경세포가 형태학적으로 큰 변화가 유도된 것을 확인할 수 있었으나, ascorbic acid를 최종농도 50|iM, 500 |iM 전처리한 실험군에서는 농도 의존적으로 신경세포의 생존을 확인할 수 있었다.
- 산화적 스트레스 유도. 신경세포에서의 산화적 스트레스를 유도하기 위하여 glutamate를 시간별로 처리하였다. 96-well plate 에 5X 104 cells/mZ 농도로 세포를 분주한 후, 24시간 동안 배양하고 10, 20mM의 최종농도로 glutamate> 24, 36시간 노출시킨 뒤 산화적 스트레스를 받아 50% 이하의 세포사멸을 유도하는 적정한 농도와 시간을 결정하였다.
- 다음으로 glutamateS. 유도된 세포독성 상태에서 활성이 가장 좋은 acetone 추출물을 가지고 N18-RE-105 세포주의 형태학적 변화에 미치는 영향을 알아보기 위해 광학 현미경 하에서 관찰하였다(Fig. 4A). 그 결과, 정상군에 비해 glutamate 처리군은 신경세포의 형태학적을 큰 변화가 유도된 것을 확인할 수 있으나, 제비꽃의 acetone 추출물을 50 μg/ml, 100 μg/ml 을 최종 농도로 처리하였을 때 신경세포의 생존을 확인할 수 있었다.
- 추출물 제조. 제비꽃 5 g에 methanol, ethanol, acetone 용매를 각각 100 m/씩 가하여 상온에서 3일 동안 정치시켜 추출 한 후, 여과지 (5C. 110 mm, Advantec, Tokyo Roshi Kaish, Ltd., Tokyo, Japan)로 여과하였다. 여과된 추출여액은 회전 감압농축기 (EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai Co.
- 제비꽃 acetone 추출물에 대한 N18-RE-105 세포주의 형태학적인 관찰을 위해 6-well plate 에 1X105 cells/well로 24시간 동안 배양하였다. 제비꽃 acetone 주줄물을 농도별(50, 100 μg/ml)로 처리 한 후 20mM의 glutamate를 24시간 노출시켜 phase-contrast microscope(TS 100-F, Nikon, Tokyo, Japan)로 각 well의 세포형태를 관찰하고 100배로 사진 촬영하였다.
대상 데이터
- Louis, MO, US A)제품을 구입하였으며, lactate dehydrogenase(LDH) release assay kit는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.(Osaka, Japan)로부터 구입하였다. 세포주 배양을 위해 필요한 Dulbecco's modified Ease's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), horse serum(HS) 및 HAT supplement 등은 Gibco-BRL(Grand Island, NT, USA)에서 구입하였으며, 그 외 연구에 사용된 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.
- 세포주 및 배양. 본 실험에 사용된 세포주는 hybridoma N18- RE-105 cell로써 한국생명공학연구원에서 분양 받아 사용하였다. 사용된 배지는 DMEM medium에 10% FBS, 5% HS 및 1XHAT s* upplement 첨가하여 사용하였고, 95%의 습도가 유지되는 37℃, 5% CO2 incubator(MCO-18AIC, Sanyo, Osaka, Japan)에서 배양하였다.
- 시약 및 실험재료. 본 실험에서 사용된 제비꽃은 경상남도 산청군 지리산 근처에서 채집하여 음건, 추출하여 실험에 사용하였다. 신경세포 보호효과 실험에 사용된 시약으로 L-glutamic acid(monosodium salt hydrate), 3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5- diphenyl tetrazolium bromide(MTT), ascorbic acid, dimethyl sulfoxide(DMSO) 는 Sigma Chemical Co.
- 본 실험에 사용된 세포주는 hybridoma N18- RE-105 cell로써 한국생명공학연구원에서 분양 받아 사용하였다. 사용된 배지는 DMEM medium에 10% FBS, 5% HS 및 1XHAT s* upplement 첨가하여 사용하였고, 95%의 습도가 유지되는 37℃, 5% CO2 incubator(MCO-18AIC, Sanyo, Osaka, Japan)에서 배양하였다.
- (Osaka, Japan)로부터 구입하였다. 세포주 배양을 위해 필요한 Dulbecco's modified Ease's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), horse serum(HS) 및 HAT supplement 등은 Gibco-BRL(Grand Island, NT, USA)에서 구입하였으며, 그 외 연구에 사용된 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.
데이터처리
- 모든 자료의 처리는 SPSS-PC+ 통계 package를 사용하여 처리하였다. 각 항목에 따라 백분율과 평균치 ± 표준편차(SD)를 구하고 각 추출물의 세포독성 정도를 비교하기 위해 one-way 분산분석 (ANOVA)을 시행하여 F값을 구하고 Scheffe's test를 이용하여 대조군과 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다. 통계적 유의성은 5% 수준에서 평가하였다.
- 각 항목에 따라 백분율과 평균치 ± 표준편차(SD)를 구하고 각 추출물의 세포독성 정도를 비교하기 위해 one-way 분산분석 (ANOVA)을 시행하여 F값을 구하고 Scheffe's test를 이용하여 대조군과 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다. 통계적 유의성은 5% 수준에서 평가하였다.
이론/모형
- MTT 분석을 통한 세포 생존율 측정. 제비꽃 추출물과 ascorbic acid의 신경세포 보호효과를 측정하기 위하여 MTT reduction assay를 실시하였다. 세포주를 5X 104 cells/mZ로 맞추고 96-well plate에 각각 100 μl씩 첨가하여 24시 간 동안 37℃, 5% CO2 incubatoi에서 배양한 후, DMSO에 녹인 제비꽃 추출물을 각 용매별 10, 50, 100μg/m/와 ascorbic acid 50, 100 μM의 최종농도로 처리하였다.
- LDH 측정에 의한 세포독성 확인. 제비꽃 추출물의 신경세포보호 효과를 측정흐}기 위한 방법으로 LDH release assay를 실시하였다. N18-RE-105 세포주를 5X104 cells/mZ로 맞춘 후, 100μl씩 96-well plate에 분주하여 CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 뒤 10, 50, lOOpg/m/의 최종농도로 제비꽃 acetone 추출물을 세포주에 처리하였다.
성능/효과
- 그리고 동일한 조건에서 MTT reduction assay 방법을 이용하여 정상군과 glutamate 처리군 그리고 glutamate와 ascorbic acid를 농도별로 처리한 실험군과 비교하였다. Fig. 2B의 결과와 같이 glutamate 처리군의 세포 생존율은 40.8% 수준으로 떨어졌으나 ascorbic acid를 50 μM, 500|iM로 처리했을 때의 생존율은 47%, 85.3% 로 세포가 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로부터 고농도의 glutamate는 세포내의 산화환원 system 이상을 초래하여 세포사를 일으키며 산화적 스트레스를 유도하고 있음을 확인할 수 있었다.
- 4B와 같다. Glutamate가 처리된 N18-RE-105 세포주에 제비꽃의 acetone 추줄물을 10, 50, 100 p.g/mZ4- 최종농도로 처리하여 glutamate 처리 군과 비교한 결과, LDH 방출량이 67.5, 57.8, 52.1%로 감소하여 정상군의 수준으로 회복되었다는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 제비꽃의 acetone 추출물이 glutamate에 의해 유도된 산화적 스트레스로부터 신경세포 손상을 강력하게 억제한다는 것을 시사한다.
- 1과 같다. Glutamate의 세포독성은 농도와 시간에 의존적으로 나타났으며 최종농도 20 mM glutamate를 처리하고 24시간이 경과하자 정상세포의 16.8% 수준으로 세포 생존율이 감소하였다. 다음으로 glutamate 세포독성과 세포내 산화-환원 계의 연관성을 조사하기 위하여 천연 항산화제인 ascorbic acid를 30분 전 처리한 후, 20mM glutamate> 처리하여 세포 생존율을 조사하였다.
- 3). Methanol 과 acetone 추출물 10 μg/ml에서는 39.3%, 49.4%로 약한 활성을 보이지만, 100 μg/ml로 처리했을 때에는 각각 72.1%, 79.4% 로 급격히 활성이 증가하는 것을 볼 수 있었다. 특히 acetone 추출물의 경우 50 μg/ml에서도 76.
- 갖는 천연추출물의 탐색을 시도하였다. 그 결과 제비꽃(Violamandshurica)추출물로부터 강력한 신경세포 보호효과를 확인할 수 있었다. 제비꽃은 다년생 초본으로 줄기가 없고 잎은 뿌리로부터 총생하며 엽병이 길고 날개가 있다.
- 4A). 그 결과, 정상군에 비해 glutamate 처리군은 신경세포의 형태학적을 큰 변화가 유도된 것을 확인할 수 있으나, 제비꽃의 acetone 추출물을 50 μg/ml, 100 μg/ml 을 최종 농도로 처리하였을 때 신경세포의 생존을 확인할 수 있었다. 이러한 신경세포의 형태학적인 변화를 통하여 제비꽃 acetone 추출물은 glutamate 독성에 의한 신경세포 손상을 억제하거나 보호하는 효과가 있다는 것을 확신할 수 있었다.
- 본 연구팀에서는 고농도의 glutamate가 유도하는 산화적 스트레스로부터 신경세포를 보호하는 물질을 찾기 위하여 천연물을 대상으로 탐색을 시도하였다. 그 결과, 제비꽃(Viola mandshurica)추출물로부터 강력한 신경세포 보호효과를 확인할 수 있었다. 먼저, 제비꽃을 용매별로 추출하여 10, 50, 100 μg/ml의 최종농도로 N18-RE-105 세포주에 처리하여 glutamate에 의해 유도된 산화적 스트레스 상태에 대한 신경세포 보호효과를 확인하였다(Fig.
- 1%로 감소하여 정상군의 수준으로 회복되었다는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 제비꽃의 acetone 추출물이 glutamate에 의해 유도된 산화적 스트레스로부터 신경세포 손상을 강력하게 억제한다는 것을 시사한다. 이상의 결과로부터, glutamate에 의한 세포독성에 산화적 손상이 관여하고 있고, 이에 제비꽃 추출물이 항산화 작용을 함으로써 glutamate의 세포독성을 방어하고 있는 것으로 생각된다.
- 그 결과, 정상군에 비해 glutamate 처리군은 신경세포의 형태학적을 큰 변화가 유도된 것을 확인할 수 있으나, 제비꽃의 acetone 추출물을 50 μg/ml, 100 μg/ml 을 최종 농도로 처리하였을 때 신경세포의 생존을 확인할 수 있었다. 이러한 신경세포의 형태학적인 변화를 통하여 제비꽃 acetone 추출물은 glutamate 독성에 의한 신경세포 손상을 억제하거나 보호하는 효과가 있다는 것을 확신할 수 있었다. 또한 동일한 조건하에서 세포의 손상 정도를 확인하기 위하여 세포 배양액 중에 들어 있는 LDH의 방출 양을 측정한 결과는 Fig.
- 3% 로 세포가 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로부터 고농도의 glutamate는 세포내의 산화환원 system 이상을 초래하여 세포사를 일으키며 산화적 스트레스를 유도하고 있음을 확인할 수 있었다.
- 이 결과는 제비꽃의 acetone 추출물이 glutamate에 의해 유도된 산화적 스트레스로부터 신경세포 손상을 강력하게 억제한다는 것을 시사한다. 이상의 결과로부터, glutamate에 의한 세포독성에 산화적 손상이 관여하고 있고, 이에 제비꽃 추출물이 항산화 작용을 함으로써 glutamate의 세포독성을 방어하고 있는 것으로 생각된다.
- 2A). 정상군에 비해 glutamate 처리군은 세포독성으로 인하여 신경돌기가 거의 소멸된 양상을 보여 신경세포가 형태학적으로 큰 변화가 유도된 것을 확인할 수 있었으나, ascorbic acid를 최종농도 50|iM, 500 |iM 전처리한 실험군에서는 농도 의존적으로 신경세포의 생존을 확인할 수 있었다. 그리고 동일한 조건에서 MTT reduction assay 방법을 이용하여 정상군과 glutamate 처리군 그리고 glutamate와 ascorbic acid를 농도별로 처리한 실험군과 비교하였다.
- 4% 로 급격히 활성이 증가하는 것을 볼 수 있었다. 특히 acetone 추출물의 경우 50 μg/ml에서도 76.8%의 생존율을 보이면서 강력하게 세포를 보호하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 다음으로 glutamateS.
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