선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 만삼 추출물의 SK-N-MC 신경세포주에 대한 세포보호 효과에 미치는 영향을 알아보기 위한 실험을 하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 이에 본 연구에서는 補中 益氣 生津의 효능이 있는 補氣藥 인 만삼을 이용하여, DPPH 소거효과, BSA를 이용한 항산화 효과, SK-N-MC 세포에 대한 세포생존율, Cytochome C, Bax, Bcl-2, P21, P53의 발현을 측정하고 그 결과를 보고하는 바이다.
제안 방법
- Bovine Serum albumin(BSA) 를 이용하여 항산화 효과를 검증하였다. 만삼추출물의 농도를 0, 5, 20, 100 ㎍/㎖로 사용하였으며, 만삼추출물 5 ㎍/㎖에서부터 방어능이 나타났다(Fig.
- DPPH(1.1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 150 i M 되 게 각각 넣은 후 동량의 만삼 추출물을 각각 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180 ㎍/㎖씩 혼합하였다. 그 후 30분간 실온에서 차광한 후 방치하였다.
- 으로 transfer 하였다. Membrane 을 5% milk 을 함유한 PBS-Tween(0.01%)에서 1 시간동안 상온에서 hybridization 하였다. 이 membrane 을 cytochrome c(PharMingen, USA), Bax(Santa Cruz, USA), Bcl-2(Santa Cruz, USA), p53(Santa Cruz, USA), p21(Santa Cruz, USA), Actin(Santa Cruz, USA)의 항체를 사용하여 1시간동안 상온에서 shaking하면서 hybridization 시키고 난 후 PBS-Tween 20으로 세척하고, membrane을 horseradish peroxidase으로 conjugated된 antimouse IgG 또는 antirabbit IgG 로 다시 1시간동안 상온에서 hybridization 하였다.
- 5 ㎕씩 첨가하고 37 C water bath 에서 2시간 동안 반응하였다. 그 후 5X Loading dye 12 ㎕를 첨가한 뒤, 12.5% SDS-PAGE를 실시하고, Comassie Blue 시약으로 Gel 염색과 탈염색을 실시 후 Gel을 Scanning (Humax, 한국)하였다.
- 단백질 정량은 Bicinchoninic Acid(BCA, Sigma, USA) 용액을 이용하여 bovine serum albumin(BSA, Sigma, USA)을 표준 곡선으로 산출하여 측정하였다. 96-well plate 에 BSA(1 ㎍/㎖)를농도별로 0, 1, 2, 4, 8, 16 ㎍/㎖에 BCA 용액 100 ㎕를 첨가하여 20분간 37C 에서 방치한 다음 흡광도 540 nm 에서 측정하여 표준 곡선을 작성하였다.
- 단백질을 세포내에서 추출하기 위하여 1x107의 세포 당 lysis buffer(10 mM Tris - HCl, pH7.6, 150 mM NaCl, 1% SDS) 100 ㎕로 현탁시켜 얼음 위에서 한 시간 동안 방치하여 완전히 lysis시켜 단백질을 추출하였다. 14, 000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상충액을 새 튜브에 옮겨 다음 실험을 수행하였다.
- 96-well plate 에 BSA(1 ㎍/㎖)를농도별로 0, 1, 2, 4, 8, 16 ㎍/㎖에 BCA 용액 100 ㎕를 첨가하여 20분간 37C 에서 방치한 다음 흡광도 540 nm 에서 측정하여 표준 곡선을 작성하였다. 동시에 측정할 샘플을 2 ㎕와 BCA 용액 100 ㎕을 섞은 뒤 20분간 37C 에서 방치한 후 540 nm 에서 측정하여 표준 곡선을 이용하여 단백질농도를 계산하였다.
- 만삼 추출물의 항산화효과를 DPPH 라디칼에 대한 소거효과를 통하여 알아보았다. 만삼 추출물을 각각 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180 ㎍/㎖씩 0분, 15분, 37분, 60분을 반응 시켜 본 결과 농도에 따라 각각 100, 113.
- 본 연구에서 만삼의 항산화능을 두 가지 방법으로 측정하였다. DPPH 법에 의하면, 만삼추출물을 여러가지 농도로 처리하였을 때, 농도의존적으로 DPPH라디칼을 소거하는 결과를 얻었다 (Fig.
- 에서 배양하였다. 세포생존율을 측정하기 위하여 24-well culture plate 에 각 well 당 2x105 cells 를 넣어 배양한 후만삼 추출물을 각각 0 ㎍/㎖ , 5 ㎍/㎖ , 20 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ , 100 ㎍/㎖ 씩 농도로 처리하여 24시간 더 배양하였다. 24시간이 지난 후 세포배양액을 제거하고 PBS로 두 번 washing 한 후 0.
- 직접적으로 세포 보호 효과를 알아보기 위하여 과산화수소를 처리한 SK-N-MC 신경세포주에 동시에 만삼 추출물을 처리하였다. 처리한 결과 각각 0 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100 ㎍/㎖에서 생존율이 100, 80.
- 추출한 단백질 50 ㎍를 Cytochome C, Bax, Bcl-2, p53, p53, Actin 를 확인하기 위하여 15% SDS-polyacrylamide SDS-polyacrylamide gel 에 전기영동하여 nitrocellulose membrane 으로 transfer 하였다. Membrane 을 5% milk 을 함유한 PBS-Tween(0.
대상 데이터
- SK-N-MC 신경세 포주는 한국세 포주은행에서 구입하여 RPMI 1640(GibcoBRL, USA) 에 5% FBS 와 Fungizone 를 첨가하여 37℃, 5% CO2 에서 계대 배양하였다.
- SK-N-MC 신경세 포주를 한국세 포주은행에서 구입하여 RPMI (GibcoBRL, USA)에 5% FBS와 Fungizone를 첨가하여 3 7C, 5% CO2에서 배양하였다. 세포생존율을 측정하기 위하여 24-well culture plate 에 각 well 당 2x105 cells 를 넣어 배양한 후만삼 추출물을 각각 0 ㎍/㎖ , 5 ㎍/㎖ , 20 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ , 100 ㎍/㎖ 씩 농도로 처리하여 24시간 더 배양하였다.
성능/효과
- Apopsosis 에 작용하는 과정 중에 만삼추출물이 세포에 독성으로 작용하는지 알아보고자 직접 SK-N-MC 세포에 만 삼 추출물을 처리하여 본 결과 대조군으로 사용된 H2O2 의 산화적 스트레스에 비하여 독성이 적은 것으로 나타났다 (Fig. 3). Apoptosis는 세포 내부에 프로그램된 신호를 따라 여러 유전자 및 단백질들의 발현과 활성이 조절되는 일련의 과정으로13), 단백질 분해효소인 caspase 가 세포내에서 분해되면서 그 자극에 의해 미토콘드리아 막에 존재하는 cytochrome c 가 세포질 밖으로 방출되고 여러 가지 기전이 연속으로 일어나면서 유도되며, 종양억제 유전자로 알려진 p53, p21 등도 관여된다.
- 1). BSA 의 경우도 CU2+/H2O2 로 유발된 BSA 의 degradation 을 만삼 추출물이 억제하였다 (Fig. 2).
- DPPH 라디칼 소거효과는 만삼 추출물의 농도가 증가할수록 증가하였다. BSA 를 이용한 항산화효과는 5 ㎍/㎖에서부터 나타났다.
- 통하여 알아보았다. 만삼 추출물을 각각 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180 ㎍/㎖씩 0분, 15분, 37분, 60분을 반응 시켜 본 결과 농도에 따라 각각 100, 113.2, 107.3 88, 65.4 48.3 35.9, 31.2, 32.5, 32.1, 32.9, 32.9% 나타냈다. 즉 농도에 따라 계속적으로 소거효과가 높아짐을 보여주었다 (Fig.
- 만삼추출물의 농도를 0, 5, 20, 100 ㎍/㎖로 사용하였으며, 만삼추출물 5 ㎍/㎖에서부터 방어능이 나타났다(Fig. 2).
- 본 연구에서는 H2O2 로 SK-N-MC 세포에 산화적 스트레스로 apoptosis 를 유도하고, 만삼추출물을 처리하였을 때 Cytochrome C 와 Bax 의 발현을 억제하였고, Bcl-2의 발현은 증가시켜 apoptosis 를 억제하였다 (Fig. 4). 또한, p21 와 p53의 발현을 억제시켰다(Fig.
- 신경세포주의 세포보호효과는 5-50 ㎍/㎖까지 있었고, 100㎍/㎖에서는 감소하였다. 세포사와의 관계를 western Blot으로 분석한 결과 cytochrome C와 Bax의 발현을 감소되 었고, BCl-2는 증가되었고, p53, p21는 감소되었다.
- 세포사와의 관계를 알아보고자 항체를 이용한 Western blot 분석에서 과산화수소수에 의한 세포사가 일어날 때 만 삼 추출물을 처리하면, Cytochome C와 Bax의 발현은 억제되고, Bcl-2의발현은 증가하는 경향을 보였다 (Fig. 4).
- BSA 를 이용한 항산화효과는 5 ㎍/㎖에서부터 나타났다. 신경세포주의 세포보호효과는 5-50 ㎍/㎖까지 있었고, 100㎍/㎖에서는 감소하였다. 세포사와의 관계를 western Blot으로 분석한 결과 cytochrome C와 Bax의 발현을 감소되 었고, BCl-2는 증가되었고, p53, p21는 감소되었다.
- 이상의 결과로 만삼추출물은 항산화능을 가지고 있으며, 과산화수소수로 처리된 SK-N-MC 신경세포주에서 세포사를 억제할 뿐만 아니라, 세포주기에도 관여하여 세포가 생존하도록 하는 세포보호 효과가 있음을 알 수 있었다.
- 처리한 결과 각각 0 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100 ㎍/㎖에서 생존율이 100, 80.1, 81.4, 85, 64.1%로 나타났다. 과산화수소를 처리한 세포의 경우 세포사가 일어나 세포생존율이 떨어졌으나, 만삼추출물을 처리한 세포에서는 보호효과가 나타나 생존율이 높아짐을 보여주었다 (Fig.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.