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문제 정의
- 따라서, 건강기능식품 및 천연물신약 소재로서 우수함이 입증된 백운풀로부터 이 식물이 대표적으로 함유하고 있는 iridoid와 anthaquinine을 분리, 정제하고 그 구조를 동정하였으며, 아울러 산업화를 위한 기초 자료를 제공하기 위하여 이들에 대한 최적 동시분석조건을 개발하여 정량법 및 유효성을 검증하고자 하였다.
제안 방법
- 1H- 및 13C-NMR spectra는 Bruker Avance Digital 400 spectrometer (Karlsruhe, Germany)로 400과 100 MHz에서 각각 측정하였다. Chemical shift는 TMS를 표준물질로 하여 δ (ppm)로 나타내었다.
- CH2Cl2 가용성 분획(343.1 g) 중 9.26 g을 이용하여 silica gel 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 그 결과, Fr.
- HPLC는 Waters Breeze HPLC system을 사용하였으며, MPLC는 Yamazen MPLC system (GR-200)을 이용하였다. 1H- 및 13C-NMR spectra는 Bruker Avance Digital 400 spectrometer (Karlsruhe, Germany)로 400과 100 MHz에서 각각 측정하였다.
- 3일 때의 농도로 구하였다. 또한 일내 정밀성과 반복성을 검토하기 위하여 하루 3반복 측정하였으며, 일간 정밀성과 반복성은 3일 동안 반복 측정하여 값을 도출하였다.
- 백운풀 추출물의 지표성분으로 설정한 화합물의 정량을 위해 최적 HPLC 조건을 검토한 결과, column은 Merck Chromolith RP-18e (100×4.6 mm, 5 μm), 실온, 유속 2.0 ml/min, injection volume 10 μl, 이동상으로는 0.5% acetic acid가 포함된 H2O (A)와 methanol (B)을 사용하여 최초 80% (A)로 시작하여 9 분 후 40% (A)가 되도록 gradient를 준 다음 18분까지 유지하는 조건을 설정하였다.
- 분석기기의 LOD (limit of detection)는 signal대 noise의 비를 3으로 설정하였으며, LOQ (limit of quantification)는 LOD×3.3일 때의 농도로 구하였다.
- 설정된 HPLC 조건을 이용하여 검량선 작성 및 지표성분의 validation을 실시하였다. 각각의 지표성분을 MeOH에 용해하여 1 mg/ml로 조제하고 이를 stock solution으로 하였다.
- 83 (3H, s)에서 발견되어 HD3 구조 중 p-coumaroyl moiety의 hydroxyl group이 methoxyl group으로 치환된 (E)-6-O-methoxycinnamoyl scandoside methyl ester일 것으로 예상하였다. 이 구조는 기존의 문헌치와 NMR data를 비교하여 확정하였다[14]. 두 이성질체의 합으로서 HD4의 순도는 사용한 HPLC 조건에서 99% 이상이었다.
- 이 용액을 단계적으로 희석하여 농도가 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 μg/ml로 총 6개의 구간을 설정하였으며 0.45 μm membrane filter로 여과하여 여액을 HPLC에 주입하고, 검출된 peak area와 농도와의 상관관계를 이용하여 검량선을 작성하였다.
- 0 ml/min, 10 μl를 injection volume으로 설정하였다. 이동상으로는 0.5% acetic acid가 포함된 H2O (A)와 MeOH (B)을 사용하여 최초 80 (A):20 (B) (v/v)로 시작하여 9분 후 40 (A):60 (B)으로 gradient를 준 후, 18분까지 유지시고, 20분에 다시 80 (A):20 (B)가 되도록 조건을 설정하였다. 분리된 화합물을 동시에 검출할 수 있는 적정파장으로 280 nm를 선택하였다.
- 즉, 고정상으로는 Agilent Eclipse XDB-C18 (4.6×250 mm, 5 μm), 검출은 UV 280 nm, 유속은 0.9 ml/min, 컬럼 온도는 25℃, 이동상으로는 0.5% acetic acid가 포함된 H2O (A)와 MeOH (B)을 사용하여 최초 (A) 95%로 시작하여 50분 후 50%가 되도록 gradient를 준 후, 5분간 유지키는 조건을 설정하였다.
- 57)이 관측되어 HD1과 같은 anthraquinone의 일종으로 판단되었다. 한편, HD1과는 달리 HD2에서는 methoxyl proton이 발견되지 않아 HD2는 2-hydroxy-3-methylanthraquinone으로 예측되었으며 이 구조는 NMR 분석치를 문헌치와 대조하여 확정하였다[16]. 분리된 HD2는 앞서 기술한 HPLC 분석 조건으로 분석 시 93.
대상 데이터
- KNUNPC-HD-1). Column chromatography용 resin은 Merck 사 (Germany)의 Kieselgel 60 (Art.7734와 Art.9385)을 사용하였고, TLC plate 또한 Merck사의 precoated Kieselgel 60F254 (Art.5715)및 RP-18 (Art.1.15685) 등을 사용하였다. 분석용 HPLC column은 Merck 사의 Merck Chromolith RP-18e (4.
- E4-1~E4-4의 4개 분획으로 나누고, 이 중 Fr. E4-2를 MPLC (Yamazen ODS-S-50B, 2630 mm, 30~100% MeOH, 5 ml/min) 로 재정재하여 얻었다(884.9 mg).
- 건조된 백운풀(H. diffusa, 10.8 kg)은 부산광역시에 소재하는 대도농산에서 재배한 것을 제공받아 사용하였으며, 표본은 본 연구실에 보관하였다(voucher specimen no. KNUNPC-HD-1). Column chromatography용 resin은 Merck 사 (Germany)의 Kieselgel 60 (Art.
- 고정상으로는 Merck사의 Chromolieth RP-19e (4.6×100 mm, 5 μm)를 사용하였으며, 실온에서 유속은 2.0 ml/min, 10 μl를 injection volume으로 설정하였다.
- 5% acetic acid가 포함된 H2O (A)와 MeOH (B)을 사용하여 최초 80 (A):20 (B) (v/v)로 시작하여 9분 후 40 (A):60 (B)으로 gradient를 준 후, 18분까지 유지시고, 20분에 다시 80 (A):20 (B)가 되도록 조건을 설정하였다. 분리된 화합물을 동시에 검출할 수 있는 적정파장으로 280 nm를 선택하였다.
- 분석용 HPLC column은 Merck 사의 Merck Chromolith RP-18e (4.6×100 mm), Agilent사 (CA, USA)의 Agilent EclipseXDB-C18 (4.6×250 mm, 5 μm)을 사용하였다.
성능/효과
- 13C-NMR 분석 결과, 2개의 ketone (δ 182.95, 181.77) 및 한 개의 methyl proton (δ 16.57)이 관측되어 HD1과 같은 anthraquinone의 일종으로 판단되었다.
- HD2는 주황색 분말로 얻어졌으며 육안적 성상 및 TLC 에서의 거동이 HD1과 매우 유사하였을 뿐 아니라, NMR spectrum 역시 매우 비슷한 양상을 나타내었다. 즉, 1H-NMR 측정결과 δ 2.
- 5% acetic acid가 포함된 H2O (A)와 methanol (B)을 사용하여 최초 80% (A)로 시작하여 9 분 후 40% (A)가 되도록 gradient를 준 다음 18분까지 유지하는 조건을 설정하였다. PDA (photodiode array detector)를 이용하여 전체의 파장을 분석한 후, 적정파장을 280 nm로 설정하였으며, 이 방법으로 백운풀 ethanol 추출물을 분석할 경우 다른 성분의 방해 없이 20 분 이내에 모든 지표성분을 분석할 수 있었다(Fig. 2).
- 다만, 1H-NMR 분석 결과, HD4에서는 HD3에 비해 한 개 많은 methoxyl group이 δ 3.83 (3H, s)에서 발견되어 HD3 구조 중 p-coumaroyl moiety의 hydroxyl group이 methoxyl group으로 치환된 (E)-6-O-methoxycinnamoyl scandoside methyl ester일 것으로 예상하였다.
- 231 μg/ml 수준이었다(Table 1). 또한 면적 비에 대한 재현성 RSD (Relative Standard Deviation, %)는 각각 0.16, 0.90, 1.18, 0.58%의 값을 보였으며(Table 2) 일내 CV (Coefficient of Validation, %)는 각각 0.23, 2.00, 1.18, 0.26%를, 일내 정확도는 102.80, 96.08, 108.44, 94.60%로 나타났다(Table 3). 한편, 일간 CV (%)는 각각 0.
- 잎의 모양도, 백운풀은 더 가늘고 뾰족하나 산방화이초는 상대적으로 두껍고 둔탁한 편이다. 또한 백운풀은 마우스 경구 급성독성시험 결과 투여 후 60일 동안 생존율에 변화를 주지 않았으며, 체중 및 간에 대한 영향으로 간 기능 검사 지표인 aspartate aminotransferase (ALT), alanine aminotransferase (AST)와 지방질 역시 안전한 것으로 평가되었다[2].
- 백운풀의 지표성분 설정을 위하여 백운풀을 EtOH로 추출한 다음, 추출물에 대해 각종 크로마토그래피를 실시한 결과, HD1~HD4의 네 가지 화합물을 얻을 수 있었다. 화합물 HD1은 주황색 분말로 얻어졌으며, 1H-NMR 분석 결과, δ 4.
- 본 연구에서 확립한 방법은 기존에 백운풀 중의 anthraquinone만을 동시 분석하는 방법[5] 및 2 종의 iridoid를 분석하는 기존의 방법[3]에 비하여 서로 다른 두 가지 골격을 갖는 4종의 화합물을 동시에 분석함에도 불구하고 분석에 소요되는 시간이 20 분 이상 단축되어 매우 효율성이 높다고 판단된다. 본 연구결과는 백운풀을 소재로 하는 건강기능식품이나 천연물신약 개발 및 제품화, 그리고 이들의 산업화 시 품질관리에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 한편, HD1과는 달리 HD2에서는 methoxyl proton이 발견되지 않아 HD2는 2-hydroxy-3-methylanthraquinone으로 예측되었으며 이 구조는 NMR 분석치를 문헌치와 대조하여 확정하였다[16]. 분리된 HD2는 앞서 기술한 HPLC 분석 조건으로 분석 시 93.5%의 순도를 나타내는 것으로 확인되었다.
- HD3는 10% 황산을 이용한 정성반응에서 진한 청색으로 발색되었다. 순도확인을 위한 HPLC 분석에서 2개의 peak가 관측되었으며, 그 면적 비율은 약 4:1이었다. 1H-NMR spectrum에서 major peak로 나타나는 δ 7.
- 34에서 나타난 peak는 각각 methoxyl group과 methyl group 유래인 것으로 판단되었다. 이상의 결과를 볼 때, 이 화합물은 anthraquinone의 일종일 것으로 예측되었으며 NMR data를 문헌치와 비교하여 digitolutein (2-hydroxy-1-methoxy-3-methylanthraquinone)으로 구조 동정할 수 있었다[18]. 이 화합물은 앞서 기술한 조건에서 HPLC로 분석하였을 때 95.
- 한편, HD1~4 이외에도 ursolic acid, daphylloside, geniposide 등의 화합물이 본 실험을 통해 분리되었으나 식물에 널리 분포되어 있는 성분이거나 또는 미량 존재하는 성분으로서 지표성분은 첫째, 성분을 대표할 수 있을 정도로 함유량이 높을 것, 둘째, 분리하기 쉬울 것, 셋째, 가능한 그 식물에 특이적인 화합물일 것, 넷째, 분석방법이 간단할 것 등, 지표성분으로서의 조건을 충족하기 어려워 지표성분으로서 HD1~4을 설정하게 되었다.
- 화합물 HD1은 주황색 분말로 얻어졌으며, 1H-NMR 분석 결과, δ 4.03에서 methoxyl group에 의한 singlet이 관측되었으며, δ 2.41에서 methyl singlet이 검출되었다.
후속연구
- 본 연구에서 확립한 방법은 기존에 백운풀 중의 anthraquinone만을 동시 분석하는 방법[5] 및 2 종의 iridoid를 분석하는 기존의 방법[3]에 비하여 서로 다른 두 가지 골격을 갖는 4종의 화합물을 동시에 분석함에도 불구하고 분석에 소요되는 시간이 20 분 이상 단축되어 매우 효율성이 높다고 판단된다. 본 연구결과는 백운풀을 소재로 하는 건강기능식품이나 천연물신약 개발 및 제품화, 그리고 이들의 산업화 시 품질관리에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
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